一種螢光壽命測量方法及系統的製作方法

2023-06-20 12:24:01

專利名稱：一種螢光壽命測量方法及系統的製作方法
技術領域：
本發明屬於光電檢測領域，尤其涉及一種螢光壽命測量方法及系統。
背景技術：
螢光顯微技術已經成為生命科學，尤其是細胞生物學研究的重要 工具。雙光子激 發螢光顯微技術具有對生命體的殺傷作用小，穿透深度大，具有層析能力等優點，已經成為 生命科學研究的重要手段。除螢光強度的分布和變化以外，螢光壽命對螢光團所處的微環 境非常敏感，能夠對離子濃度(Ca2+，Na+)、pH值和p02等生理生化參數進行定量測量，因此雙 光子激發螢光壽命測量能夠為生物醫學檢測和分析提供高時空解析度的功能信息，並有望 在蛋白質間相互作用的研究和癌症的早期診斷等生物學和臨床醫學領域獲得重要的應用。目前雙光子激發螢光壽命測量方法包括時間相關單光子技術(Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC)和門控像增強器。TCSPC通過統計單個光子發光機率擬 合出螢光壽命，而門控像增強器通過控制開關增強器，以非常短的時間記錄不同時刻的熒 光衰減，再重構出完整的螢光衰減。二者均不能一次性直接記錄螢光的衰減，成像速度慢。 掃描相機能夠將時間變化轉化為空間變化，一次記錄完整的螢光衰減，具有明顯優勢。當前已有多參量多焦點螢光顯微成像技術的相關報導，該技術具有同時獲取螢光 光譜信息和螢光壽命信息的特點。利用針孔陣列形成陣列點並行雙光子激發，螢光由自製 的掃描相機記錄，在掃描相機前放置色散稜鏡對光譜色散，掃描相機記錄的圖像一維為光 譜信息，另一維為螢光壽命信息。該方法圖像傳感器CCD相機每幅圖像只能獲得樣品的陣 列點陣位置處光譜和壽命信息，如果要獲得二維樣品信息，必須對各子區域內對陣列點逐 點移動，並且陣列點每移動一個位置需要記錄一幅圖像，例如，對於512x512圖像，陣列點 為4x4，需要記錄16384幅圖像，導致成像速度慢，特別對獲得生物樣品影響明顯。實際上， 有些情況僅僅需要快速獲得螢光壽命信息，而螢光光譜信息並不重要，需要發展快速的熒 光壽命測量方法。

發明內容
本發明實施例的目的在於提供一種螢光壽命測量方法，旨在解決現有螢光壽命測 量速度慢、效率低的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種螢光壽命測量方法，包括以下步驟產生激發光；將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；利用所述多個子光束，同時對所述多個子區域進行掃描，使各子區域內的螢光物 質發出螢光；實時採集掃描時發出的所述螢光；分辨所述螢光的壽命信息。本發明實施例的另一目的在於提供一種螢光壽命測量系統，所述系統包括
激發光源，用於產生激發光；分光器，用於將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個 子區域；第一掃描鏡，用於將所述多個子光束調整至第二掃描鏡；第二掃描鏡，用於將經所述第一掃描鏡調整後的多個子光束調整至所述樣品，使 各子區域內的螢光物質發出螢光；雙色鏡，用於導出所述螢光；成像透鏡，用於實時採集所述螢光；掃描相機，用於分辨所述螢光的壽命信息；探測器，用於記錄所述螢光的壽命信息。本發明實施例將激發光分為與樣品上多個子區域一一對應的多個激發光子光束， 利用激發光子光束對對應的測量子區域進行掃描，形成多線並行激發螢光，達到快速獲取 螢光壽命的目的，效率高。


圖1是本發明實施例提供的螢光壽命測量方法的實現流程圖；圖2是本發明實施例提供的螢光壽命測量系統的結構圖；圖3是本發明實施例提供的螢光壽命測量系統的光路圖；圖4a是本發明實施例提供的螢光壽命測量系統在第一個掃描位置的螢光壽命信 息；圖4b是本發明實施例提供的螢光壽命測量系統在第二個掃描位置的螢光壽命信 息；圖5是樣品中任意一點的螢光衰減曲線。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並 不用於限定本發明。本發明實施例將激發光分為與樣品上多個子區域一一對應的多個激發光子光束， 激發光子光束對對應的測量子區域進行掃描，形成多線並行激發螢光，達到快速獲取螢光 壽命的目的。本發明實施例提供的螢光壽命測量方法包括以下步驟產生激發光；將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；利用所述多個子光束，同時對所述多個子區域進行掃描，使各子區域內的螢光物質發出螢光；實時採集掃描時發出的所述螢光；分辨所述螢光的壽命信息。本發明實施例提供的螢光壽命測量系統包括
激發光源，用於產生激發光；分光器，用於將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；第一掃描鏡，用於將所述多個子光束調整至第二掃描鏡；第二掃描鏡，用於將經所述第一掃描鏡調整後的多個子光束調整至所述樣品，使 各子區域內的螢光物質發出螢光；雙色鏡，用於導出所述螢光；成像透鏡，用於實時採集所述螢光；掃描相機，用於分辨所述螢光的壽命信息；探測器，用於記錄所述螢光的壽命信息。圖1示出了本發明實施例提供的螢光壽命測量方法的實現流程，詳述如下在步驟SlOl中，產生激發光；本發明實施例優選工作頻率為76MHz，周期為120fs，中心波長為800nm的脈衝激 光作為激發光，此激發光可實現螢光物質的雙光子激發。在步驟S102中，將激發光分為多個子光束，多個子光束對應於樣品的多個子區 域；本發明實施例中，將激發光均分為多個平行的子光束，多個子光束一一對應於具 有螢光物質的樣品的多個子區域。在步驟S103中，利用多個子光束，同時對多個子區域進行掃描，使各子區域內的 螢光物質發出螢光；本發明實施例中的掃描分為線掃描和步進掃描，具體過程如下1、線掃描各子光束經聚焦形成激發光陣列點分別投射至樣品的各個子區域，沿樣品縱向對 各子區域進行線掃描，各子區域內的螢光物質在激發光陣列點的作用下發出螢光。2、步進掃描對各個子區域的線掃描結束後，沿樣品橫向對各個子區域進行步進掃描即調整激 發光陣列點在樣品橫向的位置。循環執行上述線掃描和步進掃描，直至完成對樣品各個子區域的掃描。應當理解， 具體實施時還可以調換線掃描與步進掃描的方向。在步驟S104中，實時採集線掃描時發出的螢光；本發明實施例中，對各子區域進行線掃描的同時，採集各子區域內螢光物質發出 的螢光。在步驟S105中，分辨螢光的壽命信息；本發明實施例中，將螢光的壽命信息轉換為可分辨的空間信息，從而獲取樣品各 點的螢光壽命。本發明實施例將激發光分為多個子光束，由多個子光束對樣品進行掃描，多線並 行激發樣品內的螢光物質，大大提高螢光壽命測量的速度。圖2和圖3示出了本發明實施例提供的螢光壽命測量系統的結構，為了便於說明， 僅示出了與本發明實施例相關的部分。
本發明實施例提供的螢光壽命測量系統具有一激發光路和一探測光路。激發光路 包括激發光源、擴束準直裝置、整形器、分光器、準直器件、第一掃描鏡和第二掃描鏡以及顯 微物鏡。探測光路包括顯微物鏡、第二掃描鏡、雙色鏡、濾光片、成像透鏡、掃描相機以及探 測器。第二掃描鏡以及顯微物鏡為激發光路和探測光路所共用。以下對激發光路的結構進行詳細說明。如圖2和圖3所示，本發明實施例優選鈦寶石飛秒雷射器101作為 激發光源，其可 產生中心波長為SOOnm、頻率為76MHz、周期為120fs的脈衝雷射，該脈衝雷射可實現螢光物 質的雙光子激發。脈衝雷射經由擴束準直透鏡102和擴束準直透鏡103構成的擴束準直裝 置，變成所需尺寸的準直光。本發明實施例中，整形器為光束整形器104，經準直的脈衝雷射經光束整形器104 整形，形成強度平頂分布的光束，經整形後雷射的強度分布均勻。分光器可為微透鏡陣列、 衍射光學元件或分束器，本實施例優選微透鏡陣列105，平頂分布的雷射經微透鏡陣列105 被分成多個子光束，多個子光束對應樣品的多個子區域，本實施例中微透鏡陣列105為 4X4微透鏡陣列即微透鏡陣列105具有16個微透鏡。本發明實施例準直器件優選管鏡 106，管鏡106的後焦面與微透鏡陣列105的前焦面重合，子光束在微透鏡陣列105的前焦 面即在管鏡106的後焦面聚焦，各子光束經管鏡106均變為平行光的子光束。在本發明實施例中，子光束的傳輸光路上設有第一掃描鏡107，經第一掃描鏡107 調整後的光路上設有第二掃描鏡113，具有螢光物質的樣品116設在經第二掃描鏡113調 整後的光路上，樣品116與第二掃描鏡113之間設有顯微物鏡114，本實施例中顯微物鏡 114的後焦面與管鏡106的前焦面重合，子光束經本激發光路形成激發光陣列點聚焦於樣 品，激發樣品116內的螢光物質發出螢光。此外，為便於調節樣品116，將其設於微調樣品臺 115。以下對探測光路的結構進行詳細說明。如圖2和圖3所示，探測光路中的雙色鏡112設於第一掃描鏡107與第二掃描鏡 113之間，雙色鏡112對中心波長為800nm的脈衝雷射高透，對波長為400 700nm的螢光 高反，雙色鏡112與子光束之間的夾角為45°或135°，雙色鏡112將螢光從激發光路反射 出來。螢光經雙色鏡112反射後的傳輸光路上依次設有成像透鏡109、掃描相機110以及探 測器。在本發明實施例中，成像透鏡109將螢光按其在樣品不同的位置會聚於掃描相機 110的光電陰極。掃描相機110具有電壓線性變化的偏轉電場，能夠將會聚於光電陰極的不 同位置的螢光的壽命信息轉換為可分辨的空間位置信息，以便探測器識別螢光衰減信息， 從而獲取樣品各點的螢光壽命。本發明實施例中，探測器為面陣探測器111，面陣探測器111優選為CXD相機或 CMOS相機，面陣探測器111用於識別螢光衰減信息，同時記錄螢光在樣品上的位置信息。面 陣探測器111與計算機117連接，計算機117用於讀取、存儲和處理探測器探測到的螢光衰 減信息，由計算機117控制面陣探測器111的曝光時間；計算機117亦可控制第一掃描鏡 107和第二掃描鏡113。此外，成像透鏡109與雙色鏡112之間設濾光片，濾光片為幹涉濾光片108，幹涉濾 光片108將反射回來的激發光以及其它雜散光過濾掉，避免幹擾。
在本發明實施例中，面陣探測器111的曝光時間大於等於第一掃描鏡107的一個 掃描周期，其曝光時間優選為第一掃描鏡107掃描周期的整數倍。面陣探測器111開始曝 光，第一掃描鏡107同時作順(逆)時針快速掃描，第一掃描鏡107歸位時作逆(順)時針 快速掃描。第一掃描鏡107掃描時，第二掃描鏡113必須靜止，此時子光束沿樣品縱向對樣 品各子區域作線掃描，圖4a所示為第一掃描鏡107在第一個掃描位置的壽命信息。第一掃 描鏡107完成一個位置的線掃描，面陣探測器111曝光結束，記錄一幅圖像，接著第二掃描 鏡113開始一個步進掃描，第二掃描鏡113步進掃描的方向與第一掃描鏡107線掃描的方 向相互垂直，第二掃描鏡113完成一個步進掃描後，第一掃描鏡107重複線掃描，圖4b所示 為第一掃描鏡107在第二個掃描位置的壽命信息。通過第二掃描鏡113的步進掃描即可實 現對整個樣品的掃描，獲得整個樣品各點的螢光壽命(衰減)信息。第一掃描鏡107的掃 描周期為第一掃描鏡107作一次順時針或一次逆時針掃描的時間的整數倍，本實施例中第 一掃描鏡107的掃描周期優選為第一掃描鏡107作一次順時針掃描與一次逆時針掃描的時 間之和。當然第一掃描鏡107可以完成多個掃描周期後，第二掃描鏡113才開始一個步進 掃描。本發明實施例中，鈦寶石飛秒雷射器101發出雷射脈衝與掃描相機110開啟同步， 即鈦寶石飛秒雷射器101每發出一個雷射脈衝，掃描相機110開啟一次，本實施例利用同步 信號開啟和關閉掃描相機110。鈦寶石飛秒雷射器101發出的脈衝到達樣品時激發出螢光， 掃描相機110的光電陰極接收到所激發出的螢光時發射出光電子，所發出的光電子在掃描 相機110的偏轉電場的作用下偏轉，在掃描相機110的螢光屏上按空間位置產生二次螢光， 產生的二次螢光對應著樣品上不同點發出的螢光不同時間的強度分布，即螢光強度的衰減 信息。如圖5所示，計算出螢光衰減至其最大強度值的Ι/e的時間即為螢光壽命。經過測試，本發明實施例同樣對於512x512圖像，陣列點為4x4，僅需記錄128幅圖 像。跟現有技術相比，獲取螢光壽命信息的速度大幅提高。本發明實施例將激發光分為與樣品上多個子區域一一對應的多個激發光子光束， 利用激發光子光束對對應的測量子區域進行掃描，形成多線並行激發螢光，達到快速獲取 螢光壽命的目的。此外，子光束對樣品進行掃描時，其對樣品不同位置處螢光物質的激發具 有一定的時間間隔即引入了線內點間到達樣品的時間，大大減小了由柱面鏡產生的線內點 間的串擾，提高了空間解析度和圖像對比度。本方法及系統具有能夠快速獲取樣品螢光壽 命信息的特點，因此，該技術對生物醫學領域研究，特別是對癌症早期診斷，具有重要意義。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種螢光壽命測量方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟產生激發光；將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；利用所述多個子光束，同時對所述多個子區域進行掃描，使各子區域內的螢光物質發出螢光；實時採集掃描時發出的所述螢光；分辨所述螢光的壽命信息。
2.如權利要求1所述的螢光壽命測量方法，其特徵在於，所述掃描分為線掃描和步進 掃描，具體過程為各子光束經聚焦形成激發光陣列點分別投射至樣品的各個子區域，沿樣品縱向對各子 區域進行線掃描，各子區域內的螢光物質在所述激發光陣列點的作用下發出螢光；對各個子區域的線掃描結束後，沿樣品橫向對各個子區域進行步進掃描即調整所述激 發光陣列點在樣品橫向的位置；循環執行所述線掃描和步進掃描，直至完成對樣品各個子區域的掃描。
3.如權利要求1所述的螢光壽命測量方法，其特徵在於，所述產生激發光的步驟之後 還包括以下步驟調整所述激發光的尺寸並進行準直；並調整所述激發光的強度分布，使所述激發光的 強度分布均勻；所述將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域的步驟 之後還包括以下步驟準直各個所述子光束，使各個所述子光束成為平行光； 所述實時採集掃描時發出的所述螢光的步驟之前還包括以下步驟 過濾所述螢光，將雜散光去除。
4.如權利要求1 3至任一項所述的螢光壽命測量方法，其特徵在於，所述分辨所述熒 光的壽命信息的步驟具體為將所述螢光的壽命信息轉換為可分辨的空間信息，獲取樣品各點發出的螢光的壽命。
5.一種螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述系統包括 激發光源，用於產生激發光；分光器，用於將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；第一掃描鏡，用於將所述多個子光束調整至第二掃描鏡；第二掃描鏡，用於將經所述第一掃描鏡調整後的多個子光束調整至所述樣品，使各子 區域內的螢光物質發出螢光； 雙色鏡，用於導出所述螢光； 成像透鏡，用於實時採集所述螢光； 掃描相機，用於分辨所述螢光的壽命信息； 探測器，用於記錄所述螢光的壽命信息。
6.如權利要求5所述的螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述激發光源與分光器之間 還設有擴束準直裝置，用於調整所述激發光的尺寸並進行準直；以及整形器，用於調整所述激發光的強度分布，使所述激發光的強度分布均勻。
7.如權利要求6所述的螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述分光器與第一掃描鏡之 間還設有準直器件，用於準直各個所述子光束，使各個所述子光束成為平行光。
8.如權利要求7所述的螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述第二掃描鏡與樣品之間 還設有顯微物鏡，用於將各個所述子光束會聚於樣品。
9.如權利要求8所述的螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述準直器件為管鏡，所述分 光器為微透鏡陣列、衍射光學元件或分束器；所述管鏡的後焦面與所述微透鏡陣列的前焦 面重合，所述管鏡的前焦面與所述顯微物鏡的後焦面重合。
10.如權利要求5 9中任一項所述的螢光壽命測量系統，其特徵在於，所述探測器的 曝光時間大於等於所述第一掃描鏡的一個掃描周期，所述第一掃描鏡完成一個周期的線掃 描或多個周期的線掃描後，所述第二掃描鏡開始一個步進掃描，所述第二掃描鏡完成一個 步進掃描後，所述第一掃描鏡重複所述線掃描；所述第一掃描鏡掃描的方向與所述第二掃 描鏡步進掃描的方向相互垂直。
全文摘要
本發明適用於光電檢測領域，提供了一種螢光壽命測量方法及系統，所述螢光壽命測量方法包括以下步驟產生激發光；將所述激發光分為多個子光束，所述多個子光束對應於樣品的多個子區域；利用所述多個子光束，同時對所述多個子區域進行掃描，使各子區域內的螢光物質發出螢光；實時採集掃描時發出的所述螢光；分辨所述螢光的壽命信息。本發明實施例將激發光分為與樣品上多個子區域一一對應的多個激發光子光束，利用激發光子光束對對應的測量子區域進行掃描，形成多線並行激發螢光，達到快速獲取螢光壽命的目的，效率高。
文檔編號G01N21/64GK101832931SQ201010182599
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月24日 優先權日2010年5月24日
發明者屈軍樂, 牛憨笨, 邵永紅 申請人:深圳大學