一種引物、擴增靶核苷酸的方法及檢測靶核苷酸擴增的方法

2023-06-13 13:02:56

一種引物、擴增靶核苷酸的方法及檢測靶核苷酸擴增的方法
【專利摘要】本發明公開了一種引物、靶核苷酸擴增方法及檢測靶核苷酸序列擴增的方法，屬於生物【技術領域】。所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括B片段，所述反向引物的5'末端包括A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，A片段與A1片段互補，B片段與B1片段互補，C片段與C1片段互補。所述靶核苷酸擴增方法，提供靶核苷酸，加入正向引物和反向引物，所述正向鏈和所述反向鏈分別擴增。所述檢測靶核苷酸序列擴增的方法用於檢測靶核苷酸是否擴增。所述引物能夠高效進行環形擴增並不斷延長靶核苷酸片段，所述靶核苷酸擴增方法與現有技術相比檢測效率至少提高了20倍，即提高了靈敏度。
【專利說明】一種引物、擴增靶核苷酸的方法及檢測靶核苷酸擴增的方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種引物、擴增靶核苷酸的方法及檢測靶核 苷酸擴增的方法。

【背景技術】
[0002] 核苷酸是組成核酸的基本單位，對核苷酸遺傳序列分析方法是一種鑑定遺傳疾 病、病原微生物等非常強有力的方法，該核苷酸序列分析方法可直接分析生命體的遺傳特 徵，並且，該核苷酸序列分析方法檢測的對象是基因自身。
[0003] 常用的體外擴增核苷酸序列的方法包括PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合 酶鏈式反應）技術，該PCR技術由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步組成一個 周期，該周期循環進行，使得目的核苷酸得以擴增。
[0004] 在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題：
[0005] 現有的PCR技術的擴增效率仍不能滿足人們的要求，因此，該PCR技術的擴增效率 有待提1?。


【發明內容】

[0006] 為了解決現有技術中PCR技術的擴增效率低的問題，本發明實施例提供了一種引 物、擴增靶核苷酸的方法及檢測靶核苷酸擴增的方法。所述技術方案如下：
[0007] -方面，本發明實施例提供了一種引物，所述引物適用於擴增的所述靶核苷酸，所 述靶核苷酸包括互補的正向鏈和反向鏈，所述正向鏈包括B片段和C片段，所述反向鏈包括 B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片 段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1 片段，所述反向引物的3'末端包括所述C1片段，所述A片段與所述A1片段互補，所述B片 段與所述B1片段互補，所述C片段與所述C1片段互補。
[0008] 具體地，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示，所述反向引物的序列 如序列表中SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 5所示。
[0009] 另一方面，本發明實施例提供了一種擴增靶核苷酸的方法，所述方法包括：
[0010] 提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互補的正向鏈和反向鏈，所述正向鏈包括B片 段和C片段，所述反向鏈包括B1片段和C1片段；
[0011] 加入所述正向引物、所述反向引物和等溫擴增反應液，使得所述正向鏈和所述反 向引物互補並進行擴增，所述反向鏈和所述正向引物互補並進行擴增；
[0012] 所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所 述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所 述A片段與所述A1片段互補，所述B片段與所述B1片段互補，所述C片段與所述C1片段 互補；
[0013] 所述正向鏈和所述反向鏈分別擴增後，得到第一正向鏈和第一反向鏈，當所述反 向引物的5'末端包括所述A片段時，所述第一正向鏈的兩端分別具有所述A片段和所述A1 片段，所述第一反向鏈的兩端分別具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向鏈的5'末 端和3'末端與所述第一反向鏈的3'末端和5'末端分別通過所述A片段和所述A1片段互 補形成環鏈，所述第一正向鏈的5'末端和3'末端互補成環，所述第一反向鏈的5'末端和 3'末端互補成環；當所述反向引物的5'末端包括A1片段時，所述第一正向鏈的兩端均具 有所述A片段，所述第一反向鏈的兩端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互補 配對，使所述第一正向鏈的5'末端和3'末端與所述第一反向鏈的5'末端和3'末端均互 補形成環鏈；
[0014] 所述第一正向鏈和所述第一反向鏈在互補後，在聚合酶的催化下，所述第一正向 鏈和所述第一反向鏈作為模板進行延長擴增，得到第二反向鏈和第二正向鏈；
[0015] 將所述第二反向鏈和第二正向鏈解鏈，解鏈後的所述第二反向鏈和第二正向鏈作 為下一個延長擴增反應的模板進行擴增，分別得到所述第二反向鏈和所述第二正向鏈的互 補鏈，並循環進行，使得所述靶核苷酸在恆溫的條件下不斷延長，完成所述靶核苷酸的擴 增。
[0016] 具體地，當所述靶核苷酸為RNA鏈時，所述等溫擴增反應液包括嗜熱脂肪芽孢杆 菌DNA聚合酶和反轉錄聚合酶。
[0017] 具體地，當所述靶核苷酸為DNA鏈時，所述等溫擴增反應液包括嗜熱脂肪芽孢杆 菌DNA聚合酶。
[0018] 具體地，所述恆溫的溫度為60_65°C。
[0019] 進一步地，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示，所述反向引物的序 列如序列表中SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
[0020] 具體地，所述等溫擴增反應液中包括解鏈溫度調節劑，所述解鏈溫度調節劑為甜 菜鹼、二甲基亞碸、脯氨酸或甲醯胺。
[0021] 具體地，在所述正向引物和所述反向引物中，所述A片段的長度小於所述B片段和 所述C片段的長度。
[0022] 又一方面，本發明實施例提供了一種檢測上述靶核苷酸序列擴增的方法，在所述 等溫擴增反應液中添加檢測試劑，採用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增後的靶核苷酸，若電泳結 果得到清晰明亮的特徵性條帶，則靶核苷酸已擴增；若未出現特徵性條帶，則靶核苷酸未擴 增。
[0023] 本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是：本發明提供的引物能夠高效進 行環形擴增並不斷延長靶核苷酸，該引物與靶核苷酸結合擴增出兩端相同或互補的核苷酸 區，該相同或互補的核苷酸區與另一條互補鏈互補成環，周而復始地不斷延長擴增。同時， 本發明提供的靶核苷酸擴增方法，其擴增過程在變性反應過程中無需的溫度變化，且全程 的反應條件均在恆溫條件下進行，進而避免了溫度變化，提高了擴增的效率，在序列互補鏈 成環後，高效率的加長重複片段，利用該新型引物與核苷酸結合擴增出兩端相同或互補的 核苷酸區，該相同或互補的核苷酸區與另一條互補鏈互補成環，周而復始地不斷延長擴增， 能夠用於檢測各種基因或基因突變的方法，與現有技術相比檢測效率至少提高了 20倍，即 提高了靈敏度。同時，本發明提供的檢測方法能夠快速有效的檢測出靶核苷酸是否擴增。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他 的附圖。
[0025] 圖1是本發明實施例二提供的正向引物和反向引物的序列示意圖；
[0026] 圖2是本發明實施例二提供的正向鏈和反向引物互補以及反向鏈和正向引物互 補配對的示意圖；
[0027] 圖3是本發明實施例二提供的第三反向鏈和第三正向鏈的示意圖；
[0028] 圖4是本發明實施例二提供的第三正向鏈和反向引物以及第三反向鏈和正向引 物互補並進行擴增的示意圖；
[0029] 圖5是本發明實施例二提供的第四正向鏈和第四反向鏈的示意圖；
[0030] 圖6是本發明實施例二提供的第四正向鏈和反向引物以及第四反向鏈和正向引 物互補並進行擴增的示意圖；
[0031] 圖7是本發明實施例二提供的第一正向鏈和第一反向鏈的示意圖；
[0032] 圖8是本發明實施例二提供的第一正向鏈和第一反向鏈分別通過正向引物和反 向引物擴增，以及互補成環的示意圖；
[0033] 圖9是本發明實施例二提供的第二反向鏈和第二正向鏈的示意圖；
[0034] 圖10是本發明實施例二提供的解鏈後的第二反向鏈和第二正向鏈作為模板進行 擴增的示意圖；
[0035] 圖11是本發明實施例二提供的得到第二反向鏈和第二正向鏈的互補鏈的示意 圖；
[0036] 圖12是本發明實施例二提供的反應液A的電泳圖；
[0037] 圖13是本發明實施例二提供的反應液B較高濃度樣本的電泳圖，且泳道1為HAV DNA (1 X l(T15mol)，泳道 2 為 HCV DNA (1 X l(T15mol)，泳道 3 為 HBV DNA (-)，泳道 4 為 DL2000 的 Marker，泳道 5 為 HBV DNA (1 X l(T18mol)，泳道 6 為 HBV DNA (1 X lO'mol)，泳道 7 為 HBV DNA(lXl(T20mol);
[0038] 圖14是本發明實施例二提供的反應液B低濃度樣本的電泳圖，且泳道1為HBV DNA (-)，泳道 2 為 HBV DNA (1 X l(T23mol)，泳道 3 為 HBV DNA (1 X l(T22mol)，泳道 4 為 HBV DNA (1 X l(T21mol)，泳道 5 為 DL2000 的 Marker ;
[0039] 圖15是本發明實施例三提供的正向引物和反向引物的序列示意圖；
[0040] 圖16是本發明實施例三提供的正向鏈和反向引物互補以及反向鏈和正向引物互 補配對的示意圖；
[0041] 圖17是本發明實施例二提供的第二反向鏈和第二正向鏈的不意圖；
[0042] 圖18是本發明實施例三提供的第三正向鏈和反向引物以及第三反向鏈和正向引 物互補並進行擴增的示意圖；
[0043] 圖19是本發明實施例三提供的第四正向鏈和第四反向鏈的示意圖；
[0044] 圖20是本發明實施例三提供的第四正向鏈和反向引物以及第四反向鏈和正向引 物互補並進行擴增的示意圖；
[0045] 圖21是本發明實施例三提供的第一正向鏈和第一反向鏈的示意圖；
[0046] 圖22是本發明實施例三提供的第一正向鏈和第一反向鏈分別通過正向引物和反 向引物擴增，以及互補成環的示意圖；
[0047] 圖23是本發明實施例三提供的第二反向鏈和第二正向鏈的示意圖；
[0048] 圖24是本發明實施例三提供的解鏈後的第二反向鏈和第二正向鏈作為模板進行 擴增的示意圖；
[0049] 圖25是本發明實施例三提供的得到第二反向鏈和第二正向鏈的互補鏈的示意 圖；
[0050] 圖26是本發明實施例三提供的反應液C的樣本電泳圖，且泳道1為DL2000的 Marker，泳道 2 為 HBV DNA (1 X l(T21mol)，泳道 3 為 HBV DNA (1 X l(T22mol)，泳道 4 為 HBV DNA (1 X 10_23mol)，泳道 5 為 HBV DNA (-)。

【具體實施方式】
[0051] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方 式作進一步地詳細描述。
[0052] 實施例一
[0053] 本發明實施例提供了一種引物，該引物適用於擴增靶核苷酸，該靶核苷酸包括互 補的正向鏈和反向鏈，正向鏈包括B片段和C片段，反向鏈包括B1片段和C1片段，該引物包 括正向引物和反向引物，正向引物的5'末端包括A片段，正向引物的3'末端包括B片段， 反向引物的5'末端包括A1片段或A片段，反向引物的3'末端包括C1片段，A片段與A1片 段互補，B片段與B1片段互補，C片段與C1片段互補。
[0054] 進一步地，A片段可以包括10-20個鹼基，且A片段的退火溫度低於B片段和C片 段的退火溫度。
[0055] 採用本發明提供的引物能夠用於定量擴增靶核苷酸，該靶核苷酸可以為RNA鏈或 DNA鏈，當靶核苷酸為RNA鏈時，可以為C肝病毒或腸道病毒71型核酸，當靶核苷酸為DNA 鏈時，可以為B肝病毒或人乳頭瘤病毒核酸等。
[0056] 具體地，當靶核苷酸為RNA鏈時，等溫擴增反應液包括嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合 酶和反轉錄聚合酶。
[0057] 具體地，當靶核苷酸為DNA鏈時，等溫擴增反應液包括嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合 酶。
[0058] 具體地，本發明實施例提供一種引物，該引物用於B肝核酸定量檢測，該引物的序 列如序列表中SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示，具體引物如下：
[0059] 選擇B肝特異性保守基因作為目標檢測基因，通過美國國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，獲得B肝B基因型和C基因型的基因序列，在該基因序列的基因區選擇一段保守序列 進行比對，該序列如序列表中 SEQ ID N0. 6 所示：GCGACGCGGYGATTGAGRCCTTCGTCTGCGAGGC GAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCSYCKKYVTCTAACAACASHAGTYTCCGGAAGTGTTGATAAGATAGGGGC A，序列中 Y = C 或 T，K = G 或 T，V = A、C 或 G，S = C 或 G，R = A 或 G，H = A、C 或 T。利 用實時PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應）的專業引物設計軟體Primer Premierf. 0設計引物序列，引物序列不僅要滿足軟體中各項指標，而且要確保B肝引物序 列能檢測全部B基因型和C基因型的序列。
[0060] 具體地，B片段可以選取擴增區保守性強的約15-30個鹼基的序列，C片段可以選 取擴增區保守性強的約15-30個鹼基的互補序列，且B片段和C片段可以為靶核苷酸的正 向鏈中的根據設計軟體篩選出的最佳引物序列。
[0061] 具體引物序列參見表1，具體引物的組合見表2 :
[0062] 表1. A組引物
[0063]

【權利要求】
1. 一種引物，其特徵在於，所述引物適用於擴增靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互補的正 向鏈和反向鏈，所述正向鏈包括B片段和C片段，所述反向鏈包括B1片段和C1片段，所述 引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末 端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3' 末端包括C1片段，所述A片段與所述A1片段互補，所述B片段與所述B1片段互補，所述C 片段與所述C1片段互補。
2. 根據權利要求1所述的引物，其特徵在於，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示。
3. -種擴增靶核苷酸的方法，其特徵在於，所述方法包括： 提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互補的正向鏈和反向鏈，所述正向鏈包括B片段和C 片段，所述反向鏈包括B1片段和C1片段； 加入所述正向引物、所述反向引物和等溫擴增反應液，使得所述正向鏈和所述反向引 物互補並進行擴增，所述反向鏈和所述正向引物互補並進行擴增； 所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反 向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A 片段與所述A1片段互補，所述B片段與所述B1片段互補，所述C片段與所述Cl片段互補； 所述正向鏈和所述反向鏈分別擴增後，得到第一正向鏈和第一反向鏈，當所述反向引 物的5'末端包括所述A片段時，所述第一正向鏈的兩端分別具有所述A片段和所述A1片 段，所述第一反向鏈的兩端分別具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向鏈的5'末端 和3'末端與所述第一反向鏈的3'末端和5'末端分別通過所述A片段和所述A1片段互補 形成環鏈，所述第一正向鏈的5'末端和3'末端互補成環，所述第一反向鏈的5'末端和3' 末端互補成環；當所述反向引物的5'末端包括A1片段時，所述第一正向鏈的兩端均具有 所述A片段，所述第一反向鏈的兩端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互補配 對，使所述第一正向鏈的5'末端和3'末端與所述第一反向鏈的5'末端和3'末端均互補 形成環鏈； 所述第一正向鏈和所述第一反向鏈在互補後，在聚合酶的催化下，所述第一正向鏈和 所述第一反向鏈作為模板進行延長擴增，得到第二反向鏈和第二正向鏈； 將所述第二反向鏈和第二正向鏈解鏈，解鏈後的所述第二反向鏈和第二正向鏈作為 下一個延長擴增反應的模板進行擴增，分別得到所述第二反向鏈和所述第二正向鏈的互補 鏈，並循環進行，使得所述靶核苷酸在恆溫的條件下不斷延長，完成所述靶核苷酸的擴增。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，當所述靶核苷酸為RNA鏈時，所述等溫擴 增反應液包括嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶和反轉錄聚合酶。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，當所述靶核苷酸為DNA鏈時，所述等溫擴 增反應液包括嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述恆溫的溫度為60-65°C。
7. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示，所述祀核苷 酸的序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
8. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述等溫擴增反應液中包括解鏈溫度調 節劑，所述解鏈溫度調節劑為甜菜鹼、二甲基亞碸、脯氨酸或甲醯胺。
9. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，在所述正向引物和所述反向引物中，所述 A片段的長度小於所述B片段和所述C片段的長度。
10. -種檢測如權利要求3所述的靶核苷酸擴增的方法，其特徵在於，在所述等溫擴增 反應液中添加檢測試劑，採用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增後的靶核苷酸，若電泳結果得到清 晰明亮的特徵性條帶，則靶核苷酸已擴增；若未出現特徵性條帶，則靶核苷酸未擴增。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195135SQ201410381499
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年8月5日
【發明者】劉映樂, 羅虹, 唐景峰 申請人:武漢海帝客生物科技有限公司