膠原蛋白人造產品、膠原蛋白溶液製備方法及從動物組織中分離膠原蛋白的方法

2023-06-13 13:02:36

專利名稱：膠原蛋白人造產品、膠原蛋白溶液製備方法及從動物組織中分離膠原蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及從不同動物組織中分離膠原蛋白的方法，製備膠原蛋白 溶液的方法及膠原蛋白的人造產品。本發明尤其涉及一種從動物骨骼、 軟骨組織、皮膚組織及腱/韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法， 一種利 用上述分離組織製備膠原蛋白溶液、膠原蛋白基質及高度濃縮膠原蛋白溶液的方法。
背景技術：
通常，膠原蛋白是一種構成動物骨骼、軟骨、牙齒、腱、皮膚及魚 鱗的硬質蛋白。膠原蛋白是一種纖維樣的固體，在電子顯微鏡下觀察， 呈現為纏結的具有交叉條紋的周期結構。膠原蛋白是一種結構蛋白，常常存在於各種哺乳動物中，其構成了機體所有蛋白總重量的30%。目前，已知的膠原蛋白有20種，其中I 型膠原蛋白是最大量的。膠原蛋白是由分子量大約為300kDa的單體蛋 白通過特定位點的共價鍵橫向連接而成的。因此，成熟的膠原蛋白呈現 為一種典型的纖維樣形狀，不溶於水，具有高拉伸強度。膠原蛋白由組 成型胺基酸構成，例如，甘氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、丙氨酸及穀氨 酸，其顯著特徵是羥基脯氨酸含量高，這在其它形式的蛋白中是不常見 的。
其中，膠原蛋白具有一種結構，三個多肽鏈通過氫鍵圍繞另一個多 肽鏈呈螺旋狀扭轉。膠原蛋白在水、弱酸和弱鹼中不降解，但是膠原蛋 白煮沸後導致其變成單鏈結構的明膠，是可溶的。與明膠不同，膠原蛋 白不需加熱即有一定的粘度，因此其易於凝膠化。另外，由於膠原蛋白 的分子量比明膠大，膠原蛋白更適合生物組織並且具有高生物活性。因 此，當用膠原蛋白處理傷口時，與明膠促進組織再生相比，膠原蛋白更 易促進癒合過程。另外，即使膠原蛋白變硬，其還是具有高柔韌性，並 且在短時間內快速橫向連接，這致使減少凝膠化時間。膠原蛋白對蛋白 水解酶不敏感，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶 和彈性蛋白酶，但是其易被膠原酶降解。從組織中分離膠原蛋白包括有 機溶劑萃取，酸/鹼處理，蛋白水解酶作用，例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、 無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶和彈性蛋白酶，得到膠原蛋白。另外，為了體內應用，如上獲得的膠原蛋白溶解於生物無毒溶劑， 例如水、生理鹽水、硼酸鹽緩衝液，或者含鹽水溶液，例如氯化鈉、蛋 白質、糖和脂肪。目前，許多提高膠原蛋白分離效率的方法正在研究中。為了保證足 夠的醫療用途用膠原蛋白，需要大量的原材料，也需要膠原蛋白分離方 法的重大改進。尤其，膠原蛋白不僅在提高血小板濃度和聚集血小板方面有一定作 用，而且可以通過改變血小板的形狀和生物化學結構來激活血小板，因 此膠原蛋白可以廣泛地被應用於止血劑。自從十九世紀五十年代以來，已有大量分離膠原蛋白的方法，但是 分離非變性形式的純膠 原蛋白是十分困難的。因此，為了在不同領域應 用膠原蛋白，發展從不同組織中分離膠原蛋白並獲得大量膠原蛋白的方 法是必要的。然而，現在已知的分離膠原蛋白的方法是從哺乳動物(鼠、牛、豬 及類似物)的皮膚或腱中分離膠原蛋白。不幸的是還沒有能從骨組織中 分離膠原的方法。發明內容本發明鑑於上述問題，第一個目的是提供一種從動物不同組織中分 離及利用膠原蛋白的方法。為了這個目的，本發明的第二個目的是提供一種從動物骨及軟骨組 織、皮膚組織和腱/肌肉組織中有效分離膠原蛋白的方法。本發明的第三個目的是提供一種從上述分離組織中製備膠原蛋白 溶液的方法。本發明的第四個目的在於提供一種利用上述膠原蛋白溶液製備膠 原蛋白基質和高度濃縮膠原蛋白溶液的方法。本發明的第五個目的在於提供一種從各種動物組織中分離膠原蛋 白的方法， 一種製備膠原蛋白溶液及人造產品的方法，通過顯著地提高 產品質量和可靠性來提高消費者的滿意度。上述其它目的與本發明的一個方面一致，通過提供用動物不同組織 製備膠原蛋白溶液的方法來實現，包括在最終處理膠原蛋白後將具有預定濃度的膠原蛋白溶液置於低溫中性條件，然後30 - 35。C過夜處理；離
心收集膠原蛋白；將上述收集的膠原蛋白溶解於冷弱酸溶劑或者磷酸緩 沖鹽溶液(PBS),膠原蛋白的濃度為1至5 mg/mL。為達到上述目的，本發明的首選方式將配合附圖作詳細描述。本發明應用的一種從動物不同組織分離膠原蛋白的方法， 一種製備 膠原蛋白溶液及人工製品的方法，參見圖1至圖4。與本發明以下的描述相關，考慮到與本發明相關的已知功能或結構 的描述可能會使本發明不清楚，其中的詳細描述會被省略掉。下文提到的術語是考慮到本發明的功能而確定的，可能與廠商的意 圖或者相關領域的普通實踐不同。因此，這裡用到的術語是根據本發明 的說明書內容定義的。本發明提供可 一 種改進的從不同組織中有效分離膠原蛋白的方法， 尤其是從骨組織中分離膠原蛋白的方法，及分離的膠原蛋白的應用方 法。這裡使用的術語"分離的膠原蛋白"是指膠原蛋白經處理後去除了 強抗原性肽，用酸或酶從不同動物中提取來的，例如胃蛋白酶、胰蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶。本發明所述的膠原蛋白在4-l(TC,酸性條件下可溶，但是在 30-37。C,中性條件下不可溶解。另外，當預定濃度的膠原蛋白在30-37。C 時，將PH值由酸性調至中性，本發明所述的膠原蛋白呈凝膠形式。給 膠原蛋白一個刺激導致其由凝膠形式轉變為不可溶的纖維樣形式。在本方法適合的溫度和PH條件下，在4。C，中性條件下滴定膠原蛋 白，在預定的時間段內，甚至是中性條件下，可以保持特定的溶液狀態。
另外，利用膠原蛋白在不同PH值、溫度、鹽濃度和乙醇沉澱條件 下的優點分離膠原蛋白。
進一步，本發明利用膠原蛋白置於30 -37°C,中性條件下一段時間 可發生分層分離的特點聚集膠原蛋白，離心使膠原蛋白沉澱。
如下文討論，膠原蛋白可以提高血小板濃度，引起血小板凝集，通 過改變血小板形狀和生物化學結構來激活血小板。因此膠原蛋白可以被 廣泛應用於止血劑。
膠原蛋白的粘度與PH相關，在pH5. 0至6. 0粘度最高。
為此，本發明所述的膠原蛋白經過最終處理，膠原蛋白溶液具有一 個預定的濃度，先在低溫、中性條件下處理，然後30-35。C振蕩過夜處 理。過夜處理後，離心收集膠原蛋白，濃縮的膠原蛋白溶解在弱酸溶劑 或者磷酸緩衝鹽溶液(PBS),冷藏，製備膠原蛋白濃度為1-5mg/mL的 膠原蛋白溶液。
本發明所述的膠原蛋白可被應用於製備基質和高度濃縮溶液。 如圖3所示，基質的製備是將過濾純空氣注入到適合濃度和PH值 的膠原蛋白中，形成預定氣孔，凍幹，乾熱乾燥。
膠原蛋白基質是由濃度為3-5mg/mL的膠原蛋白溶液製備的。特別 地，過濾純空氣被注入至PH為5. 0-6. 0的膠原蛋白溶液中，因此形成 預定的氣孔。然後將形成氣孔的膠原蛋白溶液凍幹處理，熱處理包裝， 環氧乙烷氣體或Y-射線照射滅菌，形成膠原蛋白基質。基質根據模子 的形狀可以被製成各種形式。上述製備的基質可以用作止血劑，支持物 及類似物，不同形式的膠原蛋白止血劑及支持物通常可以在市場上購買
到。進一步，膠原蛋白基質還可以包括其它成分，例如纖維蛋白原、凝 血酶，用來提高膠原蛋白作為止血劑的作用。所述膠原蛋白基質還可以 用在附著有止血劑的綁帶上。
為了利用高度濃縮膠原蛋白，參見圖4，本發明通過用孔徑為的0. 22 /^的濾器過濾滅菌濃度為lmg/mL的膠原蛋白溶液，然後濃縮滅菌膠原 蛋白至膠原蛋白濃度為3-7%,製備膠原蛋白溶液。高度濃縮膠原蛋白 溶液可以作為皮膚去皺填充物，作為相關產品還可以購買到。另外，在 傷口和被損壞區域噴灑含有抗生物質或者生長因子的高度濃縮膠原蛋 白溶液，可以促進創傷和損壞區域組織再生。


圖1是本發明製備的膠原蛋白SDS-PAGE電泳分離結果照片；
圖2是利用圖象分析儀分析本發明製備的膠原蛋白結果曲線圖及照片；
圖3是利用本發明的膠原蛋白製造的基質產品照片；
圖4是利用本發明膠原蛋白製造的高度濃縮膠原蛋白溶液照片。
具體實施例方式
現在，參考如下實施例，對本發明做進一步詳細描述。這些實施例 僅用於解釋本發明，不限制本發明的範圍和精神。 實施例1
將豬骨組織粉碎成粒徑為1 - 500聲的粉末，用0. 5N HC1處理。經 酸處理的骨組織用胃蛋白酶重複處理2至5次，共計3至7天，分離I
型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲
得重量為原始組織重量5-10%的膠原蛋白。特別地，本程序如下做進一 步詳細描述
1. 分離的豬骨組織經蒸餾水、乙醇、丙酮及類似物充分洗滌。
2. 骨組織切成圓環形狀，-20。C保存。
3. 為了從骨組織中分離膠原蛋白，骨組織製成粒徑為1-500 /an的粉末。
4. 研磨成粉末的骨組織用乙醇和蒸餾水洗滌。
5. 上述洗滌過的骨粉末用0.5N HC1過夜處理，10-100rpm振蕩。
6. 過夜處理後，骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是 10-50: 1，胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中。
7. 胃蛋白酶處理2-5次，共計3-7天。
8. 胃蛋白酶處理過的骨粉末溶液4i:, 12, OOOg離心30分鐘，分離 並保存上清，沉澱重複步驟7。
9. 用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl處理上述分離並保存的上清，4。C, 4小時至1天。
10. 12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清。
11. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。
12. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清。
13. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜置 4小時至1天。
14. 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。15. 在重懸溶液中加入IN HC1,每lOOmL懸浮液加lmLIN HC1, 4°C 中性條件下滴加。16. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。17. 沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為 l-30mg/mL, 4XM呆藏。實施例2將豬軟骨組織粉碎為粉末，用0. 5N HC1處理。經酸處理的軟骨組 織用胃蛋白酶重複處理，分離II型膠原蛋白，II型膠原蛋白用鹽處理 進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量5 % -10 %的膠 原蛋白。特別地，本程序如下做進一步詳細描述1. 分離的豬軟骨組織經蒸餾水、乙醇、丙酮及類似物充分洗滌。2. 為了從軟骨組織中分離膠原蛋白，軟骨組織製成粒徑為1-500 〃m的粉末。3. 研磨成粉末的軟骨組織用乙醇和蒸餾水洗滌。4. 上述洗滌過的軟骨粉末用鹽酸胍溶液(4M鹽酸胍，0. 05M Tris-HCl， pH 7. 5)過夜處理。5. 過夜處理的軟骨粉末用0. IN HC1洗滌一至兩次。6. 軟骨粉末用0. 5N HC1過夜處理，10至100rpm振蕩。7. 過夜處理後，軟骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比 例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中。8. 胃蛋白酶處理2-5次，共計3-7天。9. 胃蛋白酶處理過的軟骨粉末溶液4。C， 12， OOOg離心30分鐘，分
離並保存上清，沉澱重複步驟8。
10. 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl處理上述分離並保存的上清，4°C, 4小時至1天。
11. 12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清。
12. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為2. 6M。
13. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清。
14. 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為3. 5-4. 0M， 4°C 靜置4小時至1天。
15. 離心，棄上清，所得沉澱用95°/。乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。
16. 在重懸溶液中加入1NHC1,每100mL懸浮液加lmLlNHCl, 4°C 中性條件下滴加。
17. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。
18. 沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL, 4"C保藏。實施例3將豬皮膚組織製成厚度為500 /zm-5mm的片，置於網格尺寸為 200-500 /im的網中，用0. 5N HC1處理。經酸處理的軟骨組織用胃蛋白 酶重複處理，分離I型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離 和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10%-15%的膠原蛋白。特 別地，本程序如下做進一步詳細描述l.分離的豬皮膚組織經蒸餾水、乙醇及類似物充分洗滌，-2(TC保藏。2. 為了從皮膚組織中分離膠原蛋白，皮膚組織製成厚度為500 //m -5mm的片狀。3. 片狀組織至於網格尺寸為200-500拜的網中，用乙醇和蒸餾水洗滌。4. 洗滌過的組織片用胃蛋白酶(組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在O. IN HC1中)處理。5. 胃蛋白酶重複處理2-3次，共計2-3天。6. 胃蛋白酶處理過的皮膚組織溶液，4°C， 12, OOOg離心30分鐘， 分離並保存上清，沉澱重複步驟5。7. 用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl處理分離並保存的上清，4°C , 4小時至1天。8. 12,000g, 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清。9. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。10. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清。11. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M， 4。C靜 置4小時至1天。12. 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。13. 在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmLlNHCl， 4°C 中性條件下滴加。14. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。15. 沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30mg/mL， 4。C保藏。 實施例4將豬腱/韌帶組織製成厚度為500 /im- 5mm的片，用胃蛋白酶處理， 分離I型膠原蛋白，I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理， 從而獲得重量為原始組織重量10%-20%的膠原蛋白。特別地，本程序 如下做進一步詳細描述1. 分離的豬腱/韌帶組織經蒸餾水、乙醇及類似物充分洗滌，-20°C 保藏。2. 為了從腱/韌帶組織中分離膠原蛋白，腱/韌帶組織製成厚度為 500 〃m-5mni的片狀。3. 用乙醇和蒸餾水洗滌組織片。4. 洗滌過的組織片用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是 10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在0.1N HC1中。5. 胃蛋白酶重複處理2-3次，共計2-3天。6. 胃蛋白酶處理過的腱/韌帶組織溶液，4°C， 12，000g離心30分 鍾，分離並保存上清，沉澱重複步驟5。7. 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl處理上述分離並保存的上清，4°C， 4小時至1天。8. 12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清。9. 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M。10. 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清。11. 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜
置4小時至1天。12.離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸。11在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmUN HC1， 4°C 中性條件下滴加。14. 上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心。15. 沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL， 4。C保藏。實施例1 - 4提到的效果通過SDS - PAGE分析結果可以得到證實， 參見圖1所示，相關條帶分子量分別是大約140 kDa和130 kDa。另外，圖2所示的膠原蛋白圖象分析結果證實了 I型膠原蛋白的特 性，例如al:a2是2: 1,此為實驗結果的評估。圖3展示了利用本發 明所得的膠原蛋白製備的人造基質產品。圖4展示了利用本發明的膠原 蛋白製備的人造高度濃縮膠原蛋白溶液。從以上描述可見本發明可以從動物不同組織中分離並利用膠原蛋 白。為了這個目的，本發明提供了一種從動物骨、軟骨組織、皮膚和腱 /韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法， 一種利用上述分離組織製備膠原 蛋白溶液的方法， 一種利用膠原蛋白溶液製備基質和高度濃縮溶液的方 法。因此，本發明實現了產品的高質量和可靠性，有助於提高消費者的 滿意度。儘管本發明的較佳實施例揭示了目的，然而對本技術的修改、增加 和代替是允許的，並沒有避開本發明的權利範圍和精神。
權利要求
1、一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，其特徵在於包括將豬骨組織加工成微米級粒徑的粉末，粉粹的豬骨組織用酸處理；酸處理過的骨組織用胃蛋白酶反覆處理一段時間，分離I型膠原蛋白；分離的I型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量5-10％的膠原蛋白。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於從豬骨組織中分離膠 原蛋白包括1) 分離的豬骨組織經蒸餾水、乙醇和丙酮充分洗滌；2) 骨組織切成軀殼形狀，-2(TC保存；3) 為了從骨組織中分離膠原蛋白，骨組織製成粒徑為1-500 ，的 粉末；4) 用乙醇和蒸餾水洗滌骨組織粉末；5) 洗滌過的骨粉末用0.5N HC1過夜處理，10-100rpni振蕩；6) 骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1, 胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；7 )胃蛋白酶反覆處理2至5次，共計3至7天；8) 胃蛋白酶處理過的骨粉末溶液，4°C, 12，000g離心30分鐘，分 離並保存上清，沉澱重複步驟7);9) 用終濃度為0. 5至0.詢的NaCl溶液處理上述分離並保存的上 清，4°C, 4小時至1天；10)12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清； 11 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M;12) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清；13) 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M, 4。C靜置 4小時至1天；14) 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸； 15 )在重懸溶液中加入IN HC1,每100mL懸浮液加lmLIN HCl, 4'C中性條件下滴定；16)上述滴定溶液30-37。C靜置4小時至1天，離心；17 )沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL，4TM呆藏。
3、 一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，其特徵在於包括 將豬軟骨組織加工成粉末，用O. 5N HC1處理； 經酸處理的軟骨組織用胃蛋白酶重複處理，分離II型膠原蛋白；11型膠原蛋白用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為 原始組織重量5 % -10 %的膠原蛋白。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於從豬軟骨組織分離膠 原蛋白包括1) 分離的豬軟骨組織經蒸餾水、乙醇和丙酮充分洗滌；2) 為了從軟骨組織中分離膠原蛋白，軟骨組織製成粒徑為1-500 〃m的粉末； 3 )軟骨組織粉末用乙醇和蒸餾水洗滌；4)上述洗滌過的軟骨組織用鹽酸胍溶液過夜處理，鹽酸胍溶液為 4M鹽酸胍，0. 05M Tris-HC1, pH 7.5;5 )過夜處理的軟骨粉末用0. IN HC1洗滌一至兩次；6) 洗過的軟骨粉末用0. 5N HC1過夜處理，10至100rpm振蕩；7) 軟骨粉末用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1, 胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；8 )胃蛋白酶反覆處理2至5次，共計3至7天；9) 胃蛋白酶處理過的軟骨粉末溶液，4°C, 12, 000g離心30分鐘， 分離並保存上清，沉澱重複步驟8);10) 用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl溶液處理上述分離並保存的上清， 4°C, 4小時至1天；11) 12,000g, 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清； 12 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為2. 6M;13) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清；14) 向收集到的上清中加入NaCl,至NaCl終濃度為3.5-4.0M，4。C 靜置4小時至1天；15) 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；16) 在重懸溶液中加入1NHC1，每100mL懸浮液加lmLlNHCl， 4'C中性條件下滴定；17) 上述滴定溶液30-37t靜置4小時至1天，離心；18)沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL,化保藏。
5、 一種從動物組織中分離膠原秉白的方法，其特徵在於包括 將豬皮膚組織加工成厚度為毫米級的片，置於具有預訂網格尺寸的網中，用酸處理；經酸處理的組織用胃蛋白酶重複處理，分離I型膠原蛋白；胃蛋白酶處理過的組織用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10 % -15 %的膠原蛋白。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於從豬皮膚組織中分離 膠原蛋白包括1) 分離的豬皮膚組織經蒸餾水和乙醇充分洗滌，-2(TC保藏；2) 為了從皮膚組織中分離膠原蛋白，皮膚組織製成厚度為500 //m -5,的片狀；3) 片狀組織至於網衝各尺寸為200-500 /zm的網中，用乙醇和蒸餾水 洗滌；4 )洗滌過的皮膚組織用胃蛋白酶(組織和胃蛋白酶的比例是10-50: 1,胃蛋白酶用前溶在O. IN HC1中)處理；5) 胃蛋白酶重複處理2-3次，共計2-3天；6) 胃蛋白酶處理過的皮膚組織溶液4°C, 12, OOOg離心30分鐘， 分離並保存上清，沉澱重複步驟5);7 )用終濃度為0. 5至0. 8M的NaCl溶液處理上述分離並保存的上 清，4°C, 4小時至1天；8)12，000g, 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清； 9 )上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1. 6M; 10)上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清； 11 )向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M， 4。C靜 置4小時至1天；12) 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；13) 在重懸溶液中加入1NHC1,每lOOmL懸浮液加lmLlNHCl， 4°C中性條件下滴定；14) 上述滴定溶液30至37°。靜置4小時至1天，離心；15) 沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL， 4。C保藏。
7、 一種從動物組織中分離膠原蛋白的方法，包括 將豬腱/韌帶組織加工成厚度為毫米級的片； 用胃蛋白酶處理組織片，分離I型膠原蛋白； 胃蛋白酶處理過的組織用鹽處理進行分級分離和乙醇處理，從而獲得重量為原始組織重量10%-20%的膠原蛋白。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於從豬腱/韌帶組織分離 膠原蛋白包括1) 分離的豬腱/肌肉組織用蒸餾水和乙醇充分洗滌，-2(TC保藏；2) 為了從腱/韌帶組織中分離膠原蛋白，腱/韌帶組織製成厚度為 500 ，—5mm的片狀；3) 用乙醇和蒸餾水洗滌組織片；4) 洗滌過的腱/韌帶組織用胃蛋白酶處理，組織和胃蛋白酶的比例 是10-50: 1，胃蛋白酶用前溶在0. IN HC1中；5) 胃蛋白酶重複處理2-3次，共計2-3天；6) 胃蛋白酶處理過的腱/韌帶組織溶液，4°C， 12,000g離心30分 鍾，分離並保存上清，沉澱重複步驟5;7 )用終濃度為0. 5-0. 8M的NaCl溶液處理上述分離升保存的上清， 4'C, 4小時至1天；8) 12，000g， 4。C離心30分鐘，棄沉澱，收集上清；9) 上清在中性條件下滴定至NaCl終濃度為1.6M;10) 上述溶液4。C處理4小時至1天，離心，棄沉澱，收集上清；11) 向收集到的上清中加入NaCl，至NaCl終濃度為2. 6M， 4"C靜 置4小時至1天；12) 離心，棄上清，所得沉澱用95%乙醇洗滌一至兩次，蒸餾水重懸；13 )在重懸溶液中加入1N HC1，每lOOmL懸浮液加lmLlN HC1， 4°C 中性條件下滴定；14 )上述滴定溶液30-37X:靜置4小時至1天，離心；15)沉澱下來的膠原蛋白用弱酸溶劑或PBS重懸，濃度為1-30 mg/mL, 4。C保藏。
9、 一種從動物組織製備膠原蛋白溶液的方法，對膠原蛋白做最後 處理，其特徵在於中性、低溫條件下，將膠原蛋白溶液處理成預定濃度，接下來30-35 'C過夜處理；離心收集膠原蛋白；將收集到的膠原蛋白溶解於冷弱鹼溶劑或者磷酸緩衝鹽溶液，製備 膠原蛋白濃度為1-5 mg/mL的溶液。
10、 製備膠原蛋白基質的方法，其特徵在於包括 向適合濃度和pH值的膠原蛋白溶液中注入經過濾的純空氣，形成預定的氣孔；凍幹形成氣孔的溶液製成基質；所述基質是由濃度為3-5mg/mL的膠原蛋白溶液製成的，將過濾的 純空氣注入到pH值為5. 0-6. Q的膠原蛋白溶液中，形成預定的氣孔， 凍幹已形成氣孔的膠原蛋白溶液，包裝，凍千產品熱處理，然後環氧乙 烷氣體或者Y射線照射滅菌，由此製備膠原蛋白基質。
11、 一種加工產品，包括濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液用孔徑為0. 22//m的過濾器滅菌； 濃縮已滅菌的膠原蛋白，製備濃度為3-7%的高度濃縮膠原蛋白溶
全文摘要
本發明公開了不同動物組織中分離膠原蛋白的方法，製備膠原蛋白溶液的方法及膠原蛋白的人造產品。為了這個目的，本發明提供了一種從動物組織製備膠原蛋白溶液的方法，包括膠原蛋白的最終處理在中性、低溫條件下處理就有預定濃度的膠原蛋白溶液，然後在30至35℃過夜處理；離心收集膠原蛋白；將收集到的膠原蛋白溶解於弱酸溶劑或者磷酸緩衝鹽溶液(PBS)，從而製備濃度為1至5mg/mL的膠原蛋白溶液。本發明由上述組成，可以實現從動物骨和軟骨組織、皮膚組織和腱/韌帶組織有效分離膠原蛋白的方法，從上述分離組織製備膠原蛋白溶液的方法，利用上述膠原蛋白製備基質和高度濃縮膠原蛋白溶液。
文檔編號C12P21/00GK101213308SQ200680006404
公開日2008年7月2日 申請日期2006年3月9日 優先權日2005年3月11日
發明者呂世根, 張在德, 張晶皓, 李璽邦, 柳志喆, 高暢權 申請人:世源世龍股份有限公司