一種組織工程化皮膚的構建方法與應用的製作方法
2023-06-13 13:01:11 1
專利名稱：一種組織工程化皮膚的構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及將來自不同組織的幹細胞在體外向表皮細胞定向誘導分化，並將誘導分化的細胞群與生物材料相結合，共同構建組織工程化皮膚的方法，利用此方法可在支架材料上製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度的皮膚組織替代物。
背景技術：
皮膚作為人體的最大器官，具有屏障、保護、調節體溫和感覺的功能。由於炎症、潰瘍、燙傷、燒傷等因素造成的皮膚缺損，嚴重的可危及生命。目前臨床通常採用自體皮瓣或皮膚移植的方法治療缺損創面，但面臨供皮區新的創傷缺陷，以及供皮區來源的不足。此外移植物與移植部位臨近的皮膚存在顏色、質地、功能上的差異。
組織工程學是應用工程學和生命科學的原理和方法，構建生物性替代物，以恢復、維持或增進受損器官或組織功能的一門科學(Nerem RM.Tissue engineeringin the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)CE8)。組織工程學的建立和發展為皮膚缺損治療開創了嶄新的途徑。
目前應用於臨床的組織工程產品主要有合成性敷料、人工皮片、人工真皮替代物和人工複合全層皮膚。IntegraTM是由美國Integra Life Sciences公司生產的雙層基質的人工真皮。其真皮是由牛肌腱的膠原蛋白及硫酸軟骨素製成具有一定孔洞大小的支架，利於血管內皮細胞通過和纖維細胞長入，表皮是由矽膠膜組成，可在真皮層癒合後除去，再進行人工表皮的移植。美國FDA於1996年核准IntegraTM用於燒燙傷的治療。然而，IntegraTM由於缺乏活的細胞成分，可能延緩真皮的重建。
還有一類是含有單一細胞的皮膚，如人工表皮和人工真皮。
EpicelTM是由美國Genzyme組織修復公司生產的人工表皮，主要用於治療大面積燒燙傷病人。它是將病人自體的角質細胞在體外放大培養，移植到潰瘍、痔、大皰性表皮鬆懈症部位。雖然它們在殘留的真皮部位黏附得很好，但它們不黏附脂肪、慢性創面或感染性創面；而且移植部位容易剝離，或者形成水皰，對機械損傷高度敏感；缺乏真皮成分；移植成功率主要與創面細菌汙染程度有關；費用昂貴。DermagraftTM是由Advanced Tissue Sciences公司生產的人工真皮。是將新生兒包皮中獲取的成纖維細胞接種於生物可降解的聚乳酸纖維網上，移植後14天，成纖維細胞大量增殖並分泌膠原等細胞外基質以及細胞因子，3～4周聚乳酸纖維網因生物降解而消失，用於治療糖尿病引起的足部潰瘍。但生產這種合成網膜真皮替代物需要大量成纖維細胞；難以改變網膜的厚度；市售產品只達到真皮重建。
ApligraftTM是第一種商業化的既含有表皮層又含有真皮層的組織工程化皮膚，由美國Organogenesis公司生產。它是將新生兒包皮中獲取的成纖維細胞接種於牛的I膠原蛋白中，6天後細胞分泌細胞外基質，形成類似真皮層的組織，再種植上新生兒包皮的角質細胞。角質細胞附著在真皮上開始分裂分化形成表皮層。再將整個複合物置於氣-液界面繼續培養，促使角質細胞成熟。雖然ApligraftTM實現了一次外科手術同時重建真皮和表皮的目的，但由於採用同種異體細胞作為種子細胞來源，因而存在著不可避免的免疫排斥反應，以及潛在的病源微生物感染的風險；而且所用的種子細胞均為終末分化的成熟細胞，沒有自我增殖分化的能力。
發明內容
本發明提供了一種利用幹細胞體外向表皮細胞誘導分化後的細胞群與生物材料結合，共同構建組織工程皮膚的方法。利用此方法可在支架材料上製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度的皮膚組織替代物。由於幹細胞具有多向分化潛能，能夠在誘導條件下分化為表皮細胞，通過誘導分化的細胞及其分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創面的癒合。
本發明是通過以下技術方案實現的(1)體外誘導幹細胞向表皮細胞分化將骨髓、脂肪、胚胎、臍帶血、外周血等組織來源的MSC或其它成體幹細胞種植於在預先鋪有明膠(Sigma公司，貨號G-1890)、膠原、纖維蛋白凝膠、Matrigel膠(BD公司，貨號354240)或其它生物活性膠的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)或者其它成體幹細胞相應的基本培養基，於37℃，5％CO2培養箱中進行培養至細胞達到30％～50％的融合，遂改用表皮誘導條件培養液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基(DF12培養基，Sigma公司，貨號D-0547)中含有下列成分10～20ng/ml EGF(RD公司，貨號236-EG)，10～20ng/ml bFGF(RD公司，貨號234-FSE)，5～20ng/ml PDGF(RD公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物進行誘導培養，10～14天後即可得到表皮細胞。
(2)膠原溶液製備和準備新鮮牛尾浸於75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.03～0.05M冰醋酸，4℃反覆振搖溶解，製備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5523)(Biochrom公司，貨號S0115)，適量的胎牛血清，用1N的NaOH調節pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養皿中，置於冰上，紫外燈下照射30min～60min。
(3)脫細胞真皮準備將豬、牛、羊等各種哺乳動物或其它來源的脫細胞真皮或其它商業脫細胞真皮進行鈷60照射滅菌，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)洗2次，之後浸入低糖DMEM培養基中，置於4℃存放，待用。
(4)組織工程化皮膚的製備將脫細胞基質或其它生物支架材料或聚合物材料(如家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及甲殼素、纖維素、聚胺基酸、PLGA、PGA、PLA、聚醯胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維等)平放在4℃預冷的培養板(或其它培養皿)的底部，在其表面鋪滿膠原溶液，浸潤2～10min後，倒去膠原溶液，37℃固化30min。將向表皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，計數，按2×103～2×105細胞/cm2的密度種植於脫細胞真皮表面。2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後即可用於皮膚創傷的修復。
本發明是將各種組織來源的幹細胞在體外向表皮細胞定向誘導分化後再與脫細胞真皮、生物活性支架材料如甲殼素、纖維素、聚胺基酸、PLGA、PGA、PLA或非降解型生物材料如聚醯胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維等結合起來，共同構成組織工程化皮膚，利用此方法可在支架材料上製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度的皮膚組織替代物。由於幹細胞具有多向分化潛能，能夠在誘導條件下分化為表皮細胞，通過誘導分化的細胞及其分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創面的癒合。因此，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
圖1幹細胞向表皮細胞誘導分化A誘導分化後5天細胞呈表皮細胞典型的「鋪路石狀」(×100)B誘導分化後10天，透射電鏡觀察細胞超微結構，胞漿中出現大量張力細絲和黑色素小體(×35000)C免疫螢光鑑定，向表皮誘導分化的細胞表達CK19(綠色螢光)(×200)
D免疫組化鑑定，向表皮誘導分化的部分細胞表達CK10(×200)圖2組織工程化皮膚裸鼠移植試驗及體內免疫螢光檢測A覆蓋組織工程化皮膚的裸鼠移植試驗模型B免疫螢光鑑定，組織工程化皮膚移植後3天，細胞定位於裸鼠表皮C組織工程化皮膚裸鼠移植試驗21天後，缺損創面完全癒合具體實施方式
實施例1、以骨髓MSC為例，體外分離不同組織來源的幹細胞無菌條件下直接抽取患者骨髓，加等量生理鹽水稀釋，200目篩網過濾，加入6％HES(B.Braun公司)沉降紅細胞，吸取上層細胞懸液，離心去上清，加生理鹽水製成細胞懸液，用比重1.073g/ml的Percoll分離液(AmershamBiosciences公司，貨號17-0891-01)分離(1000g×20min)，小心吸出中間層細胞，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，接種於T-25培養瓶中。置CO2培養箱(溫度設定為37℃，CO2濃度為5％)內培養；培養72h後換液，此後依細胞生長速度對培養體系進行換液，待培養瓶內細胞長至80％以上融合時，用0.25％的胰蛋白酶37℃消化細胞，分別按5.5～7.0×103個/cm2接種於培養瓶中，置CO2培養箱培養。
實施例2、體外誘導MSC向表皮細胞分化將骨髓來源的MSC種植於預先鋪有Matrigel膠(BD公司，貨號354240)的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)，於37℃，5％CO2培養箱中進行培養至細胞達到50％的融合，遂改用表皮誘導條件培養液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基(Sigma公司，貨號D-0547)，15ng/ml EGF(RD公司，貨號236-EG)，15ng/mlbFGF(RD公司，貨號234-FSE)，5ng/ml PDGF(RD公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素進行誘導培養，10～14天後即可得到表皮細胞。結果顯示，幹細胞向表皮細胞誘導分化後5天，細胞呈表皮細胞典型的「鋪路石狀」。誘導分化後10天，透射電鏡觀察，胞漿中出現大量張力細絲和黑色素小體，免疫螢光檢測細胞表達CK19，免疫組化檢測部分細胞表達CK10(圖1)。
實施例3、膠原溶液製備和脫細胞真皮準備新鮮牛尾浸於75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.05M冰醋酸4℃反覆振搖溶解，製備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM，適量的胎牛血清，用1N的NaOH調節pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養皿中，置於冰上，紫外燈下照射40min。將牛的脫細胞真皮進行鈷60照射滅菌，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)洗2次，之後浸入低糖DMEM培養基中，置於4℃存放，待用。
實施例4、以脫細胞真皮為例，製備組織工程全層皮膚將滅菌後的牛脫細胞真皮平放在4℃預冷的培養板的底部，在其表面鋪滿膠原溶液，浸潤10分鐘後，倒去膠原溶液，37℃固化30min。將向表皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，計數，按2×105細胞/cm2的密度種植於脫細胞真皮表面。2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後即可用於皮膚創傷的修復。
實施例5、組織工程化皮膚修復裸鼠創面實驗用3.5％水合氯醛麻醉裸鼠後，於背部尾側切取全層皮膚作直徑1.5cm的圓形缺損創面，移植組織工程化皮膚。結果顯示，組織工程化皮膚移植試驗後21天，裸鼠皮膚缺損處完全癒合，皮膚生長完好，未見疤痕(圖2)。
權利要求
1.一種組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於該組織工程化皮膚由向表皮細胞誘導分化的細胞群與生物材料共同構建而成。
2.根據權利要求1所述的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於所述的向表皮細胞誘導分化的細胞群包括從臍帶血、外周血、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等組織分離的幹細胞經體外誘導分化而獲得。
3.根據權利要求1所述的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於所述的生物材料包括可降解型生物材料包括家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚胺基酸、PLGA、PGA、PLA；還包括脫細胞真皮基質；非降解型生物材料如聚醯胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維。
4.根據權利要求1所述的組織工程化皮膚的構建方法，包括有各種組織來源的幹細胞的分離、幹細胞的體外誘導分化、與生物材料的共培養，其特徵在於，本發明方法包括以下步驟(1)不同組織來源的幹細胞的分離培養；(2)不同組織來源的幹細胞向表皮細胞誘導分化；(3)膠原溶液製備和支持材料的準備；(4)含有誘導的表皮細胞的組織工程化皮膚的構建1)將脫細胞真皮或其它生物支架材料或聚合物材料平放在4℃預冷的培養板(或其它培養皿)的底部，在其表面鋪滿膠原溶液，浸潤2～10分鐘後，倒去膠原溶液，37℃固化30min；2)將向表皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，按2×103～2×105細胞/cm2的密度種植於脫細胞真皮表面；3)2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後即可用於皮膚創傷的修復。
5.根據權利要求1所述的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於誘導不同組織來源幹細胞向表皮細胞分化的培養基是在低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基中含有下列成分EGF、bFGF、PDGF，ITS，地塞米松，青黴素，鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物。
6.根據權利要求1所述的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於不同來源幹細胞向表皮細胞誘導分化的一種方案是低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基，15ng/ml EGF，15ng/ml bFGF，5ng/ml PDGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素。
7.組織工程化皮膚的應用，其特徵在於根據權利要求1所述方法構建的組織工程化皮膚可製備應用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的皮膚組織替代物。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體是涉及將來自不同組織的幹細胞在體外向表皮細胞定向誘導分化，並將誘導分化的細胞群與生物材料相結合，共同構建組織工程化皮膚的方法。利用此方法可在支架材料上製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度的皮膚組織替代物。由於幹細胞具有多向分化潛能，能夠在誘導條件下分化為表皮細胞，通過誘導分化的細胞及其分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創面的癒合，因此，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61L27/60GK101062428SQ20061007636
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優先權日2006年4月24日
發明者裴雪濤, 何麗娟, 陳琳, 南雪, 王韞芳, 管利東, 劉大慶, 白慈賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所