一種製備高純度胰激肽原酶的方法

2023-06-13 04:10:26

專利名稱：一種製備高純度胰激肽原酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種胰激肽原酶的製備方法，具體地說是涉及一種採用親和層析法生 產高純度胰激肽原酶的製備方法；屬於生物製藥領域，涉及到藥用蛋白酶的生化分離技術。
背景技術：
胰激肽原酶是從豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶，它在藥理和臨床上的功用 主要為胰激肽原酶是一種具有擴張血管改善微循環作用的周圍血管擴張藥；它能夠激活 纖溶酶，抑制磷脂酶A2，具有降低血粘度，防止血小板聚集，防止血栓形成等作用。其主要用 於微循環障礙性疾病，如糖尿病引起的腎病、周圍神經病、視網膜病、眼底病及缺血性腦血 管病的治療，也可用於高血壓病的輔助治療。現有胰激肽原酶的純化方法一種是使用多糖非樹脂物料進行純化，例如使粗的胰 激肽原酶吸附到一種弱鹼性陰離子交換纖維素上並分離；或者將一種鋁鹽或者鋅鹽加入含 有胰激肽原酶的水溶液中，將產生的胰激肽原酶的沉澱吸附到弱鹼性的陰離子交換纖維素 上或交聯葡聚糖上，並分離之；另一種純化方法是使用離子交換樹脂，即加入一種蛋白質沉 澱劑到胰臟提取液中，產生的胰激肽原酶吸附到大孔強鹼性陰離子交換樹脂，並分離之。然 而，利用上述多糖型非樹脂物料進行吸附的方法缺點是離子交換物料的物理強度不夠，不 能進行大規模製備。而離子交換樹脂法不能使產品在洗脫時除去不需要的雜質。因此，上 述方法得到產品的純度還有待於進一步提高。胰激肽原酶最初收載於中國衛生部藥品標準二部第六冊(生化藥品)(1998年) 中，該標準中規定胰激肽原酶的比活按乾燥品計算不得小於300單位/毫克蛋白，2006年國 家藥典委員會對該標準進行了修訂，增加了純度指標，規定供口服用胰激肽原酶的純度不 得低於65%。這一指標的制定從一定程度上提高了對胰激肽原酶的品質要求，但是由於目 前國內生產胰激肽原酶工藝水平不高，產品純度所能達到的程度不均衡，質量穩定性差，因 此在制定純度限度要求時，對純度要求只有65%。最新發布的中國藥典2010版中將胰激肽 原酶作為新品種收錄其中，對純度要求做了修訂，胰激肽原酶的純度要求也僅提高到70%。根據分析，胰激肽原酶工藝未獲得重大突破的原因有三一是生產廠家的工藝慣 性，工藝一旦穩定不輕易變動；二是幾年前胰激肽原酶在臨床上的應用主要是用作口服制 劑等，對產品的質量要求沒有那麼高；三是親和層析技術本身的技術難度使得開發以親和 層析工藝來製備胰激肽原酶的技術不是那麼容易。可是近年來國際研究發現，胰激肽原酶靜脈注射可舒張腦血管、增加腦血液中血 紅蛋白含量，降低腦梗塞面積的擴展，改善梗塞引起的腦組織葡萄糖和氧攝取降低，改善葡 萄糖代謝，並可改善自發性皮層腦電圖異常，用於治療輕/中度急性血栓性腦梗死，這個應 用使得國際市場上對本產品的需求不斷擴大，而從質量要求上卻更加嚴格，要求產品有更 好的品質，傳統工藝生產的胰激肽原酶顯然已經不能滿足這種需求。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種工藝穩定、質量 保證的製備高純度胰激肽原酶的方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)原料磨碎、加熱反應用研磨設備將新鮮冷凍豬胰直接磨成漿狀，控制溫度為 40-600C，加熱攪拌反應4_5h，放置過夜，得到反應液；(2)提取將反應液泵入提取桶，將反應液、純化水和丙酮按體積比1 3 1混 合，攪拌3-4h，再經過固液分離裝置得到清液；(3)鹽析向步驟(2)得到的清液中加入硫酸銨至30%飽和度，在4°C冷庫中放 置過夜後過濾，得到提取液，在提取液中再補充硫酸銨至70%飽和度，在4°C冷庫中放置過 夜，棄去上清液後用離心法收集底層沉澱，得到粗品；(4)親和層析分離純化將得到的粗品用純化水溶解得到溶解液，將親和層析介 質裝入分離柱，用緩衝液進行平衡後用溶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢後繼續用 緩衝液衝柱至流出液的OD28tl值小於0. 1 ；換用pH為7.0，濃度為0. lmol/L三(羥甲基)氨 基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)及0. 5mol/L KCl的混合緩衝液繼續洗脫，控制流速為50cm/h，收 集洗脫峰；(5)超濾濃縮除菌對收集到的洗脫峰採用超濾膜進行濃縮，得到的濃縮液通過 0. 22 μ m的濾膜過濾除菌得到酶液；(6)真空冷凍乾燥將步驟(5)中得到的酶液置於凍幹盤中，通過真空冷凍乾燥對 酶液進行冷凍乾燥，即得到產品。所述的步驟(2)中固液分離裝置為機電一體化箱式板框過濾設備。所述的步驟(4)中親和層析介質是以市售的GE Health凝膠作為基礎，以三甲 基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶氮基-苯甲脒作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小 時製備而得，凝膠與配基的重量比為1 (0.1-0.2)。所述的步驟(4)中的緩衝液為濃度為0. lm0l/L0l/L，pH為7. 0的三(羥甲基)氨
基甲烷鹽酸鹽緩衝液。所述的步驟(5)中超濾膜為截流分子量為5000的超濾膜。所述的步驟(6)中真空冷凍乾燥的冷凍溫度為-40 -50°C。與現有技術相比，本發明體現出了親和層析法生產胰激肽原酶的優越性，有利於 工藝的穩定和質量的可控，降低了生產成本，提高了產品品質，以較高的收率得到純度很高 的產品，胰激肽原酶的比活由層析前的約150單位/毫克蛋白提高到約900單位/毫克蛋白， 比活提高600%以上，純度由層析前的40%左右提高到90%，大大提高了產品的市場競爭力。


圖1為純度測定中對照品的色譜圖；圖2為實施例1親和層析前色譜圖；圖3為實施例1親和層析後色譜圖；圖4為實施例2親和層析前色譜圖5為實施例2親和層析後色譜圖；圖6為實施例3親和層析前色譜圖；圖7為實施例3親和層析後色譜圖。
具體實施例方式本發明將通過以下具體實施例來說明本技術的實施過程。實施例1取新鮮冷凍豬胰200公斤，用研磨機將原料直接磨成漿狀，50°C加熱攪拌反應5h， 放置過夜。次日將反應液泵入提取桶，加入600L純化水、200L冷丙酮，攪拌4h，用板框過 濾設備過濾得清液，分離後的殘渣裝袋後按照環保要求處理。清液超濾濃縮，加入硫酸銨 至30%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜後過濾，得到的清液即為提取液，在提取液中再補充 硫酸銨至70%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉 澱，得到粗品2.2公斤。粗品用22L純化水溶解，將20L自製的親和層析介質裝柱，親和層 析介質以市售的GE Health凝膠介質為基礎，以CAD (三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶 氮基-苯甲脒)作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小時製備而得，凝膠與配基的重 量比為1 0.1。用60L 0. lmol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，pH為7.0 緩衝液進行平衡；平衡後直接用溶解液上樣，控制流速在30cm/h ；上樣完畢，繼續用60L緩 衝液進行平衡衝柱至流出液的光密度OD28tl值小於0. 1。換用0. lmol/L Tris-HCl, 0. 5mol/ L KCl，pH為7. 0混合緩衝液洗脫，流速為50cm/h，收集洗脫峰40L。用截流量5000的超濾 膜進行超濾濃縮，濃縮至5L，將濃縮液通過0. 22μπι的濾膜過濾除菌。除菌後的酶液裝凍 幹盤，採用真空冷凍乾燥技術，將酶液直接冷凍乾燥，冷凍溫度為_40°C，即可得到成品。成 品取樣，參照中國藥典2005年版第二部的要求，進行全項測定，全項指標完全符合中國藥 典2010版二部的要求，檢測結果如表1所示。純度測定中對照品的色譜圖如圖1所示，親 和層析前的色譜圖如圖2所示，親和層析後的色譜圖如圖3所示；親和層析前後比活和純度 的變化如表2所示。高純度胰激肽原酶的主要性能評定為檢驗按本發明中所提供的工藝製備的高純度胰激肽原酶的質量是否達到預期 要求，對按本發明進行的工業化規模製備的高純度胰激肽原酶進行檢驗，檢驗項目為比 活、純度、蛋白酶、熾灼殘渣、脂肪。檢測方法參照中國藥典2010版二部胰激肽原酶項下規 定。具體檢測方法敘述如下1、比活效價測定標準品溶液的製備取胰激肽原酶標準品適量，加上述磷酸鹽緩衝液(PH為7. 0) 製成每Iml中含10單位的溶液。供試品溶液的製備取本品適量，加上述磷酸鹽緩衝液(pH為7. 0)製成每Iml中 約含10單位的溶液。底物溶液的製備取N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽17. 7mg，加入三羥甲基氨基 甲烷緩衝液(稱取三羥甲基氨基甲烷12. 14g，加水800ml溶解，用6mol/L鹽酸溶液調節pH 值至8.0，加水稀釋至1000ml)至100ml，4°C保存。
5
測定法量取25士0. 5°C水浴中預熱的底物溶液2. 5ml，置於Icm比色池中，精密加 入供試品溶液或標準品溶液0. lmol/Ll，混勻，立即計時，照紫外-可見分光光度法(中國藥 典2010年版二部附錄IV A)，在25士0. 5°C，於253nm波長處，以底物溶液為空白，準確讀取 Imin的吸收度AO和3min的吸收度A，標準品溶液和供試品溶液需平行測定3次，分別求得 標準品溶液和供試品溶液的ΔΑ值(ΔΑ = Α-Α0)的平均值代入下式計算 蛋白含量取本品約10mg，精密稱定，照氮測定法(中國藥典2010年版二部附錄 VII D第二法)測定，將結果乘以6. 25即得。比活力由測得的酶活力和蛋白含量計算每Img蛋白中含胰激肽原酶的單位數。 2、純度取本品適量，用流動相A製成每Iml中約含200單位的溶液，作供試品溶液。另取 胰激肽原酶對照品(純度應大於95% )適量，同法製成每Iml中約含200單位的溶液，作對 照品溶液。照高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄VD)試驗。用憎水性凝膠為填充劑(如TSKgel Phenyl_5PW，7. 5mmX 75mm, 10 μ m)；以含 1. 7mol/L硫酸銨的磷酸鹽緩衝液(pH為7. 0)(取磷酸氫二鈉10. 9g，磷酸二氫鈉2. 3g，加水 約700ml使溶解，調pH值至7. 0，再加水稀釋至1000ml)為流動相A，以上述磷酸鹽緩衝液 (pH為7. 0)為流動相B ；柱溫為25°C ；流速為每min 0. 5ml，梯度洗脫；檢測波長為280nm。 理論板數按胰激肽原酶峰計算應不低於1500，胰激肽原酶主峰與相鄰雜質峰的分離度不得 低於0.8。分別取流動相A、供試品溶液及對照品溶液各20 μ 1注入高效液相色譜儀，以流 動相A洗脫lOmin，然後梯度洗脫，10 20min，流動相B的比例從0%增加至100%，維持 15min，記錄色譜圖。分析結束後應以流動相A平衡至少20min。將供試品溶液和對照品溶 液的色譜圖扣除流動相A色譜圖(作為空白基線)，進行基線校正。在供試品溶液色譜圖 中，取空白基線拐點(約16min)後所有色譜峰，按面積歸一化法計算與對照品溶液主峰保 留時間一致的主峰面積，對照品的色譜圖如圖1所示。3、蛋白酶供試品溶液的製備取本品適量，加上述磷酸鹽緩衝液(pH為7. 0)製成每Iml中 含1單位的溶液。測定方法精密量取供試品溶液Iml置試管中，在35士0. 5°C水浴中保溫5min， 精密加入已預熱至35士0. 50C的酪蛋白溶液(酪蛋白0. 6g，加0. 05mol/L磷酸氫二鈉溶 液80ml，65 °C加熱溶解，放冷，調節pH值至8. 0，加水至100ml,臨用前配製)5ml，混勻，於 35士0. 5°C水浴中準確反應20min，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，混勻，濾過，取續濾液 作供試品溶液；另精密量取供試品溶液lml，置試管中，精密加5%三氯醋酸溶液5ml，混勻， 於35士0. 5°C水浴中準確反應20min，再精密加入上述酪蛋白溶液5ml，混勻，濾過，取續濾液作空白溶液，在2h以內照紫外-可見分光光度法(中國藥典2010年版二部附錄IV A)， 在280nm的波長處測定吸收度，不得過0. 2。4、熾灼殘渣取本品0. 5g，依法檢查(中國藥典2010年版二部附錄VIII N)遺留殘渣不得超過
3.0%。5 脂肪取本品l.Og，置具塞錐形瓶中，加入乙醚20ml，密塞，時時旋動，放置約30min後， 將乙醚液傾至用乙醚潤溼的濾紙上，濾過，再用乙醚IOml洗滌殘渣，合併濾液及洗液至恆 重的蒸發皿中，除去乙醚，在105°C乾燥2h，精密稱定，遺留脂肪不得過lmg。實施例2取新鮮冷凍豬胰600公斤，用研磨機將原料直接磨成漿狀，50°C加熱攪拌反應
4.5h，放置過夜。次日將反應液泵入提取桶，加入1800L純化水、600L冷丙酮，攪拌4h，用板 框過濾設備過濾得清液，分離後的殘渣裝袋後按照環保要求處理。清液超濾濃縮，加入硫酸 銨至30%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜後過濾，得到的清液即為提取液，在提取液中再補 充硫酸銨至70%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層 沉澱，得到粗品6. 5公斤。粗品用65L純化水溶解，將50L自製的親和層析介質裝柱，親和 層析介質以市售的GE Health凝膠介質為基礎，以CAD (三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯 偶氮基-苯甲脒)作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小時製備而得，凝膠與配基的 重量比為1 0. 2。用150L 0. lmol/L Tris-HCl，pH為7. 0緩衝液進行平衡；平衡後直接用 溶解液上樣，控制流速在30cm/h ；上樣完畢，繼續用150L緩衝液平衡衝柱，至流出液的OD28tl 值小於0. 1。換用0. lmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L KCl，pH為7. 0的混合緩衝液洗脫，流速 為50cm/h，收集洗脫峰1IOL0用截流量5000的超濾膜進行超濾濃縮，濃縮至16L，將濃縮液 通過0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。除菌後的酶液裝凍幹盤，採用真空冷凍乾燥技術，將酶液直 接冷凍乾燥，冷凍溫度為-50°C，即可得到成品。成品取樣，參照中國藥典20010年版第二部 的要求，進行全項測定，全項指標完全符合中國藥典的要求，檢測結果如表1所示。親和層 析前的色譜圖如圖4所示，親和層析後的色譜圖如圖5所示；親和層析前後比活和純度的變 化如表2所示。實施例3取新鮮冷凍豬胰400公斤，用研磨機將原料直接磨成漿狀，60°C加熱攪拌反應4h， 放置過夜。次日將反應液泵入提取桶，加入1200L純化水、400L冷丙酮，攪拌3. 5h，用板框 過濾設備過濾得清液，分離後的殘渣裝袋後按照環保要求處理。清液超濾濃縮，加入硫酸銨 至30%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜後過濾，得到的清液即為提取液，在提取液中再補充 硫酸銨至70 %飽和度，在4°C冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉 澱，得到粗品4.5公斤。粗品用45L純化水溶解，將30L自製的親和層析介質裝柱，親和層 析介質以市售的GE Health凝膠介質為基礎，以CAD (三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶 氮基-苯甲脒)作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小時製備而得，凝膠與配基的重 量比為1 0. 15。用100L 0. lmol/L Tris-HCl，pH為7. 0緩衝液進行平衡；平衡後直接用 溶解液上樣，控制流速在30cm/h ；上樣完畢，用100L上述平衡液衝柱，衝至流出液的0込8。值 小於 0.1。換用 0. lmol/L Tris-HCl,0. 5mol/L KCl，pH 為 7. 0 緩衝液洗脫，流速為 50cm/h，收集洗脫峰100L。用截流量5000的超濾膜系統進行超濾濃縮，濃縮至12L，將濃縮液通過 0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。除菌後的酶液裝凍幹盤，採用真空冷凍乾燥技術，將酶液直接冷 凍乾燥，冷凍溫度為-50°C，即可得到成品。成品取樣，參照中國藥典20010年版第二部的要 求，進行全項測定，全項指標完全符合中國藥典的要求，檢測結果如表1所示。親和層析前 的色譜圖如圖6所示，親和層析後的色譜圖如圖7所示；親和層析前後比活和純度的變化如 表2所示。實施例4取新鮮冷凍豬胰800公斤，用研磨機將原料直接磨成漿狀，45°C加熱攪拌反應5h， 放置過夜。次日將反應液泵入提取桶，加入2400L純化水、800L冷丙酮，攪拌4h，用板框過 濾設備過濾得清液，分離後的殘渣裝袋後按照環保要求處理。清液超濾濃縮，加入硫酸銨 至30%飽和度，在4°C冷庫中放置過夜後過濾，得到的清液即為提取液，在提取液中再補充 硫酸銨至70 %飽和度，在4°C冷庫中放置過夜，次日吸取上清液棄去，用離心法收集底層沉 澱，得到粗品8.8公斤。粗品用88L純化水溶解，將75L自製的親和層析介質裝柱，親和層 析介質以市售的GE Health凝膠介質為基礎，以CAD (三甲基-氨苯基取代-三嗪基-苯偶 氮基-苯甲脒)作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小時製備而得，凝膠與配基的重 量比為1 0. 15。用180L 0. lmol/L Tris-HCl，pH為7. 0緩衝液進行平衡；平衡後直接用 溶解液上樣，控制流速在30cm/h ；上樣完畢，用180L上述平衡液衝柱，衝至流出液的0込8。值 小於0. 1。換用0. lmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L KCl，pH為7. 0的混合緩衝液洗脫，流速為 50cm/h，收集洗脫峰150L。用截流量5000的超濾膜系統進行超濾濃縮，濃縮至18L，將濃縮 液通過0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。除菌後的酶液裝凍幹盤，採用真空冷凍乾燥技術，將酶液 直接冷凍乾燥，冷凍溫度為-50°C，即可得到成品。成品取樣，參照中國藥典20010年版第二 部的要求，進行全項測定。表1檢測結果
表2親和層析前後比活和純度的變化 由以上檢定結果可以得出結論運用本發明中以CAD (三甲基-氨苯基取代_三嗪 基-苯偶氮基-苯甲脒)為配基的親和層析技術生產的高純度胰激肽原酶比活可達到800 單位/毫克蛋白以上，純度均超過90%，遠高於中國藥典2010版中藥用胰激肽原酶的規定， 且主要雜質指標均符合本發明制定的更嚴格於中國藥典2010版中要求的標準，表明本品 純度高，雜質少，安全性高，符合藥用標準。
權利要求
一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)原料磨碎、加熱反應用研磨設備將新鮮冷凍豬胰直接磨成漿狀，控制溫度為40 60℃，加熱攪拌反應4 5h，放置過夜，得到反應液；(2)提取將反應液泵入提取桶，將反應液、純化水和丙酮按體積比1∶3∶1混合，攪拌3 4h，再經過固液分離裝置得到清液；(3)鹽析向步驟(2)得到的清液中加入硫酸銨至30％飽和度，在4℃冷庫中放置過夜後過濾，得到提取液，在提取液中再補充硫酸銨至70％飽和度，在4℃冷庫中放置過夜，棄去上清液後用離心法收集底層沉澱，得到粗品；(4)親和層析分離純化將得到的粗品用純化水溶解得到溶解液，將親和層析介質裝入分離柱，用緩衝液進行平衡後用溶解液上樣，控制流速在30cm/h，上樣完畢後繼續用緩衝液衝柱至流出液的光密度OD280值小於0.1；換用pH為7.0，濃度為0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl)及0.5mol/L KCl的混合緩衝液繼續洗脫，控制流速為50cm/h，收集洗脫峰；(5)超濾濃縮除菌對收集到的洗脫峰採用超濾膜進行濃縮，得到的濃縮液通過0.22μm的濾膜過濾除菌得到酶液；(6)真空冷凍乾燥將步驟(5)中得到的酶液置於凍幹盤中，通過真空冷凍乾燥對酶液進行冷凍乾燥，即得到產品。
2.根據權利要求1所述的一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，所述的步 驟(2)中固液分離裝置為機電一體化箱式板框過濾設備。
3.根據權利要求1所述的一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，所述的步 驟⑷中親和層析介質是以市售的GE Health凝膠作為基礎，以三甲基-氨苯基取代-三 嗪基-苯偶氮基-苯甲脒作為配基，在酸性條件下於冰浴中攪拌24小時製備而得，凝膠與 配基的重量比為1 (0.1-0.2)。
4.根據權利要求1所述的一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，所述的步 驟(4)中的緩衝液為濃度為0. lmol/Lol/L,pH為7. 0的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩衝 液。
5.根據權利要求1所述的親和層析法生產高純度胰激肽原酶的製備方法，其特徵在 於，所述的步驟(5)中超濾膜為截流分子量為5000的超濾膜。
6.根據權利要求1所述的一種製備高純度胰激肽原酶的方法，其特徵在於，所述的步 驟(6)中真空冷凍乾燥的冷凍溫度為-40 -50°C。全文摘要
本發明涉及一種製備高純度胰激肽原酶的方法，該方法包括以下工藝步驟(1)原料磨碎、加熱反應；(2)提取；(3)鹽析；(4)親和層析分離純化；(5)超濾濃縮除菌；(6)真空冷凍乾燥，即可得到成品。與現有技術相比，本發明已建立起一套規模化生產的生產工藝，體現出了親和層析法製備胰激肽原酶的高效性、專一性，有利於生產工藝的穩定可控，減少了生產成本，大大提高了產品品質，其中比活達到800單位/毫克蛋白以上、純度達到90％以上，從而極大地提高了產品的市場競爭力。
文檔編號C12N9/50GK101914511SQ20101015947
公開日2010年12月15日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者葉昀, 林克, 王洪森 申請人:寧波林葉生物科技有限公司