一種四倍體大白菜雄性不育系選育的方法與流程
2023-06-13 04:11:06
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種四倍體大白菜雄性不育系選育的方法。
背景技術：
大白菜(Brassica rapa pekinensis)是主要的十字花科蔬菜之一，歷史上曾經與蘿蔔一起作為北方的半年菜具有舉足輕重的地位。近年來隨著生產方式的多元化，大白菜在人們日常生活中的地位有所下降，但仍是北方人們秋冬及早春季節不可缺少的主要蔬菜。生產中採用的大白菜品種基本上都是二倍體，鑑於當前存在的大白菜種質資源的同質化，基因群體日漸穩定，創新面日漸狹窄等問題，新手段、新技術的研發成為大白菜育種的迫切需求。
由於四倍體大白菜為創新性資源，自然界尚未發現野生的四倍體大白菜資源，因此無法獲得自然突變四倍體的雄性不育系，而利用遠緣雜交(蕓薹屬異源多倍體)技術程序更加複雜，進程周期長。人工選育雖然可以獲得四倍體大白菜，但是育成四倍體大白菜的稔性低；此外由於目前選育四倍體大白菜僅以自交親和係為親本的方向，形成親本選擇面窄的困局，限制了中間類型四倍體大白菜品種的選育，如卵圓形、炮彈型、高樁包頭型等，還造成後繼雜交種制種過程中純度難提高的問題，甚至出現自交株、假雜交株，給實際生產帶來很大風險，迫切需要開展四倍體大白菜雄性不育系育種。
技術實現要素：
本發明首先解決了為雄性不育系提供穩定可靠的花粉來源的問題，並克服了二倍體雄性不育系加倍後能否使後代存活、不育性能否保持、不育性的穩定性、能否在四倍體自交系間轉育等諸多問題。
有鑑於此，本發明首先提供了一種四倍體大白菜雄性不育系的選育方法，包括以下步驟：
1)大白菜雄性不育源的選擇：選擇二倍體大白菜雄性不育系材料庫中穩定的細胞質雄性不育系；
2)培育步驟1)的細胞質雄性不育系，選擇獲得四倍體雄性不育株；
3)以步驟2)獲得的四倍體雄性不育株為母本，以穩定的高代四倍體自交係為父本，進行連續多代回交轉育，分別獲得了與父本性狀一致的四倍體雄性不育系BCn。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述細胞質雄性不育係為二倍體細胞質雄性不育系『CMS後36高』。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述步驟2)中培育步驟1)的細胞質雄性不育系『CMS後36高』的方法包括催芽、播種的過程。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述催芽的方法包括：以二倍體大白菜細胞質雄性不育系材料『CMS後36高』種子，55℃溫湯浸種後用潮溼的軟紗布包裹，在28℃恆溫箱中催芽12小時-20小時，使得種子的80％種皮裂開吐白。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述播種的方法包括：採用50穴的穴盤播種2盤，每穴播種3-4粒，播種深度1cm，覆蓋基質後蓋地膜保溼，在人工氣候室25℃、光照強度1000-1500lx下育苗，幼苗破土後及時去除地膜。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述步驟2)中選擇獲得四倍體雄性不育株的方法為使用多倍體誘變劑處理『CMS後36高』幼苗，存活植株在真葉達到6-7片時進行倍性鑑定，之後人工氣候室春化，抽薹後進行雄性不育性鑑定，並選擇四倍體雄性不育植株作為四倍體雄性不育源。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述多倍體誘變劑為秋水仙素。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述高代四倍體自交係為D12、D22、D571、D574；所述與父本性狀一致的四倍體雄性不育係為CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574(註：BCn指代次，每一個材料都需經過n代的回交轉育，成型後的不育系以原保持系(自交系)名稱前加「CMS-」來區分。)。
優選地，本發明所述四倍體大白菜雄性不育系的選育方法中，所述多代回交轉育為至少5代。
本發明的另一方面在於提供了上述的方法獲得四倍體大白菜雄性不育系BCn，及其非繁殖部分。優選地，所述四倍體大白菜雄性不育系BCn的非繁殖部分包括四倍體大白菜雄性不育系BCn的植物器官、植物細胞、植物原生質體、非繁殖性的組織培養物、植物愈傷組織、植物細胞團、植物移植體、或植物的部分；優選地，所述的括四倍體大白菜雄性不育系BCn的植物器官，包括非繁殖性植物胚、花粉、胚珠、果實、花、葉、根、莖、根尖、嫁接物(接穗)等。
本發明的方法及其獲得的穩定四倍體大白菜雄性不育系，至少具有以下優點：
本發明方法適用於四倍體大白菜新品種的選育，通過將目標母本親本創製為雄性不育系，能使父本親本從有限的選擇範圍擴展大不受限制的選取，從而使培育的四倍體大白菜雜交種類型不再僅限於束心型、花心型、圓球型，通過跨類型親本的選配，能培育出更多的中間類型四倍體大白菜品種如卵圓形、炮彈型、高樁包頭型等，使四倍體大白菜品種類型更加豐富；
同時，採用雄性不育系制種，因母本親本的自身雄蕊敗育不可能產生花粉，一旦結籽必定為與父本的雜交種，可使雜交種的純度提高到100％，而且可節約普通制種過程中後期的人工去雄和化學殺雄成本，具有顯著的生態與經濟效益。
附圖說明
圖1為本發明的一個實施例四倍體大白菜雄性不育系BCn的培育方法示意圖；
圖2為本發明的實施例1四倍體大白菜保持系(父本)與雄性不育系對比圖；
圖3為本發明的實施例1中四個四倍體大白菜雄性不育系染色體鏡檢圖；
圖4為本發明的實施例1四倍體大白菜保持系(父本)與雄性不育系田間生長對比照片。
具體實施方式
在本發明的一個實施例中，提供了一種四倍體大白菜雄性不育系的選育方法，包括以下步驟：
1)大白菜雄性不育源的選擇：選擇二倍體大白菜雄性不育系材料庫中穩定的細胞質不育系；
2)培育步驟1)的細胞質不育系，選擇獲得四倍體雄性不育株；
3)以步驟2)獲得的四倍體雄性不育株為母本，以穩定的高代四倍體自交係為父本，進行連續多代回交轉育，分別獲得了與父本性狀一致的四倍體雄性不育系BCn。
在本發明的另一個實施例中，所述細胞質不育係為細胞質不育系『CMS後36高』。
在本發明的另一個實施例中，所述步驟2)中培育步驟1)的細胞質不育系『CMS後36高』的方法包括催芽、播種的過程。
在本發明的另一個實施例中，所述催芽的方法包括：以二倍體大白菜細胞質雄性不育系材料『CMS後36高』種子，55℃溫湯浸種後用潮溼的軟紗布包裹，在28℃恆溫箱中催芽12小時-20小時，使得種子的80％種皮裂開吐白。
在本發明的另一個實施例中，所述播種的方法包括：採用50穴的穴盤播種2盤，每穴播種3-4粒，播種深度1cm，覆蓋基質後蓋地膜保溼，在人工氣候室25℃、光照強度1000-1500lx下育苗，幼苗破土後及時去除地膜。
在本發明的另一個實施例中，所述步驟2)中選擇獲得四倍體雄性不育株的方法為使用多倍體誘變劑處理『CMS後36高』幼苗，存活植株在真葉達到6-7片時進行倍性鑑定，之後人工氣候室春化，抽薹後進行雄性不育性鑑定，並選擇四倍體雄性不育植株作為四倍體雄性不育源。
在本發明的另一個實施例中，所述多倍體誘變劑為秋水仙素。
在本發明的另一個實施例中，所述高代四倍體自交係為D12、D22、D571、D574；所述與父本性狀一致的四倍體雄性不育係為CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574。在本發明的另一個實施例中，所述多代回交轉育為至少5代。
在本發明的另一個實施例中，提供了四倍體大白菜雄性不育系CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574，及其非繁殖部分。
其中，二倍體細胞質雄性不育系『CMS後36高』，四倍體自交系D12、D22、D571、D574可獲得自可獲得自河北農林科學院經濟作物研究所，並可使用《大白菜2n配子發生的細胞學機制研究，《河北農業科學》第9卷第3期》所描述之方法培育獲得。
以下通過具體實施例進一步對本發明的技術方案進行說明，應理解以下僅為本發明的示例性說明，並不用於限制本發明權利要求的保護範圍。
實施例1四倍體大白菜雄性不育系BCn的選育
如圖1所示，四倍體大白菜雄性不育系BCn的選育，包括以下步驟：
(1)催芽：在12月下旬進行，取二倍體大白菜細胞質雄性不育系材料『CMS後36高』種子1g，55℃溫湯浸種後用潮溼的軟紗布包裹，在28℃恆溫箱中催芽12-20h，以80％種皮裂開吐白為宜。
(2)播種：採用50穴的穴盤播種2盤，每穴播種3-4粒(保障萌發種子1粒)，播種深度1cm，覆蓋基質後蓋地膜保溼，在人工氣候室25℃、光照強度1000lx-1500lx下育苗，幼苗破土後及時去除地膜。
(3)子葉展開時將直徑3-5mm的脫脂棉球緊緊貼合生長點卡在子葉中間，用0.2％重量秋水仙鹼溶液點滴脫脂棉球，每天上午、下午各滴1次，持續處理48小時。
(3)四倍體大白菜雄性不育株的篩選：處理結束後，穴盤幼苗仍按照正常育苗程序管理，待穴盤中存活植株在真葉達到6-7片時用鑷子摘取1cm2的心葉置於改良卡諾氏固定液中固定48h，在28℃恆溫下用5％重量果膠酶解離1h，PIHCH染色法染色、壓片、觀察染色體數量，選出成功加倍的四倍體不育株。
(4)低溫處理誘導春化抽薹：在人工氣候室進行低溫短日照處理，10℃下光照強度1000lx-1500lx，光照時數8h，連續處理20日，誘導幼苗通過春化達到抽薹開花的目的。
(5)選取穩定的高代四倍體自交系D12、D22、D571、D574分別為父本，以步驟(4)獲得的春化後的四倍體不育株為母本，進行連續多代回交轉育，5代以後可獲得與父本性狀一致的四倍體雄性不育系BC5：CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574(注BCn指代次，每一個材料都需經過n代的回交轉育，成型後的不育系以原保持系名前加「CMS-」來區分。)。四倍體不育系與保持系(父本)育性鑑定具體結果見下表1、四倍體不育系與保持系(父本)生物學性狀比較結果見下表2：
表1四倍體大白菜雄性不育系轉育後育性鑑定匯總表
表2四倍體不育系與保持系(父本)生物學性狀對比表
如圖2所示，A為父本四倍體大白菜保持系D571；B為雄性不育系CMS-D571；如圖所示，D571雄蕊長於柱頭，花葯飽滿呈絨毛狀，為可育的正常狀態；CMS-D571雄蕊遠低於柱頭，花葯囊乾癟退化成長三角狀，為無花粉的不育狀態。
本發明對實施例1中所獲得的四倍體雄性不育系CMS-D12、CMS-D22、CMS-D571、CMS-D574的染色體進行了電子顯微鏡檢，結果見圖3，其中，A為CMS-D571；B為CMS-D12；C為CMS-D574；D為CMS-D22。結果說明：通過鏡檢發現，四個雄性不育系的染色體數均穩定在40條，可確定為四倍體。
如圖4所示，A為CMS-D574與D574；B為CMS-D571與D571；C為CMS-D12與D12；D為CMS-D22與D22的田間生長比對圖，結果說明：四組不育系與保持系的田間生長各項表現性狀相一致，不育系表現出生長勢強、抗逆性強的特點。
如圖2～4及表1、表2的所示，本發明方法能使雜交組合配製過程中父本親本從有限的選擇範圍擴展大為不受限制的選取，可以按照包球類型互補的原則配製中間類型四倍體大白菜品種，高包型、束心型、牛心型，使四倍體大白菜品種類型更加豐富。
另外，通過表1中不育度所顯示的，本發明的方法可使雜交種的純度提高到100％，而且可節約普通制種過程中後期的人工去雄和化學殺雄成本，具有顯著的生態與經濟效益。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。