包括cdk抑制劑和吉西他濱的藥物組合物的製作方法

2023-06-13 16:00:06 2

專利名稱：包括cdk抑制劑和吉西他濱的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及適於治療癌症和其它增殖性疾病的藥物聯合。
背景技術：
哺乳動物細胞周期的啟動、進行和結束受對細胞生長至關重要的各種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)複合物的調控。這些複合物包括至少一種催化亞基(CDK自身)和一種調節亞基(細胞周期蛋白)。對細胞周期調控的一些比較重要的複合物包括細胞周期蛋白A(CDK1-也稱為cdc2，和CDK2)、細胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、細胞周期蛋白C(CDK8)、細胞周期蛋白D1-D3(CDK2，CDK4，CDK5，CDK6)、細胞周期蛋白E(CDK2)、細胞周期蛋白K和T(CDK9)和細胞周期蛋白H(CDK7)。這些複合物中的每一種涉及細胞周期的特定期。
通過與其它蛋白的短暫締合以及它們細胞內定位的變化，CDK的活性在翻譯後被調節。腫瘤發展與基因改變和CDK及其調節劑的下調密切相關，這表明CDK抑制劑可為有用的抗癌治療藥。實際上，早期結果表明轉化細胞和正常細胞在它們對例如細胞周期蛋白A/CDK2的需求上有差別，因而有可能開發出新的抗腫瘤藥，沒有常規細胞毒性和細胞抑制藥物所觀察到的常見宿主毒性。
CDK的功能是磷酸化並因此激活或去激活特定蛋白，包括例如成視網膜細胞瘤蛋白、核纖層蛋白、組蛋白H1和有絲分裂紡錘體的成分。由CDK介導的催化步驟涉及從ATP到大分子酶底物的磷醯-轉移反應。已發現幾類化合物(在例如N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Cur.Med.Chem.1999，6，859中有總結)因由於CDK特異性ATP拮抗作用而具有抗增殖性能。
Roscovitine為化合物6-苄基氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羥基乙基氨基]-9-異丙基嘌呤。Roscovitine已被證實為細胞周期蛋白依賴性激酶尤其是CDK2的有效抑制劑。這種化合物當前正被開發成抗癌藥。CDK抑制劑被認為阻斷了細胞周期G2/M期的細胞途徑。
眾所周知，本領域中經常聯合給予活性藥劑以使治療方案最佳。本發明因此設法提供已知藥劑的新型聯合，該聯合尤其適於治療增殖性疾病，尤其是癌症。更具體地，本發明集中於與聯合使用特定藥劑有關的令人驚奇和出乎意料的效果。
發明概述第一方面，本發明提供包括CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物的聯合。
第二方面提供包括根據本發明的聯合與藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑混合的藥物組合物。
第三方面涉及根據本發明的聯合在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
第四方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物的藥物製品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯合製劑。
第五方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物。
第六方面涉及CDK抑制劑在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述治療包括同時、依次或分別對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物。
第七方面涉及CDK抑制劑和吉西他濱或其衍生物或前體藥物在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
第八方面涉及CDK抑制劑在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用於與吉西他濱或其衍生物或前體藥物的聯合治療。
第九方面涉及吉西他濱或其衍生物或前體藥物在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用於與CDK抑制劑的聯合治療。
詳細描述藥物聯合的效果本質上是不可預料的，經常存在一種藥物部分或完全抑制另一種藥物的效果的傾向。本發明基於令人驚奇的發現，即同時、分別或依次聯合給藥吉西他濱和roscovitine不會導致兩種藥劑之間的任何有害相互作用。出人意料的這種拮抗相互作用的缺乏對臨床應用至關重要。
在優選的實施方案中，與分別給藥的任何一種藥物相比，吉西他濱和roscovitine的聯合能產生增強的效果。這種發現的令人驚奇特性與根據現有技術預料的大不相同。
下面闡述的優選實施方案適用於本發明的所有上述方面。
吉西他濱，2』-去氧-2』，2』-二氟胞苷是對尤其是卵巢癌、胰腺癌和肺癌表現出抗腫瘤活性的核苷類似物。吉西他濱表現出細胞期特異性，主要殺死正進行DNA合成(S-期)的細胞，並還能阻斷細胞通過G1/S-期界線的進展。吉西他濱在細胞內被核苷激酶代謝成活性二磷酸(dFdCDP)和三磷酸(dFdCTP)核苷。吉西他濱的細胞毒性效應可歸因於二磷酸和三磷酸核苷的聯合作用導致的DNA合成的抑制。更具體地說，二磷酸吉西他濱抑制核糖核苷酸還原酶，而後者負責催化用於DNA合成的三磷酸脫氧核苷產生的反應。二磷酸核苷對這種酶的抑制導致脫氧核苷酸濃度例如dCTP的降低。另外，三磷酸吉西他濱與dCTP競爭摻入到DNA內。隨後的dCTP細胞內濃度的減少增強了三磷酸吉西他濱摻入到DNA內(自增強作用)。一旦吉西他濱核苷酸摻入到DNA內，則只有一個其它核苷酸被加入到增長的DNA鏈中，然後不再抑制進一步的DNA合成。DNA聚合酶不能除去吉西他濱核苷酸和修復增長的DNA鏈(掩蔽鏈終止)。在CEMT類淋巴母細胞中，吉西他濱誘導核小體間細胞DNA片段化，這是細胞程序性死亡的特徵。
CDK抑制劑優選為CDK2和/或CDK4的抑制劑。CDK抑制劑更優選選自Roscovitine、Purvalanol A、Purvalanol B、奧羅莫星和其它2，6，9-三取代的嘌呤，如WO 97/20842、WO 98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of Califomia)中所述。CDK抑制劑甚至更優選選自Roscovitine和Purvalanol A。還更優選地，CDK抑制劑為Roscovitine。
本文使用的術語「增殖性疾病」在廣泛意義上包括任何需要控制細胞周期的疾病，例如心血管疾病如再狹窄和心臟病、自身免疫性疾病如腎小球腎炎和類風溼性關節炎、皮膚病如牛皮癬、抗炎性、抗真菌、抗寄生蟲疾病如瘧疾、氣腫和脫髮病。在這些疾病中，本發明的化合物可按照需要在所需的細胞內誘導凋亡或保持停滯。優選地，增殖性疾病為癌症或白血病，最優選地為肺癌、胰腺癌、膀胱癌、間皮瘤癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌或食道癌。
在一種優選實施方案中，癌症為肺癌、膀胱癌或胰腺癌。
在另一尤其優選的實施方案中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)。還更優選地，癌症為IIIB/IV期非小細胞肺癌。
在尤其優選的實施方案中，本發明涉及上文所述的聯合在治療CDK依賴性或敏感性疾病中的應用。CDK依賴性疾病與一種或多種CDK酶的超過正常活性水平有關。這類疾病優選與CDK2和/或CDK4的異常活性水平有關。CDK敏感性疾病為CDK水平的失常不是主因而是下遊初級異謝失常導致的疾病。在這種情況下，CDK2和/或CDK4被認為是敏感性代謝途徑的一部分，CDK抑制劑可因此在治療這類疾病中有活性。這類疾病優選癌症或白血病。
本文使用的術語「藥物製備」包括本發明的成分除了用於這類藥物製備的任意階段外還有直接作為藥物的應用。
在本發明的一種優選實施方案中，在吉西他濱前依次或分別地給藥CDK抑制劑。優選地，在吉西他濱前至少4小時給藥CDK抑制劑，更優選地在吉西他濱前至少72小時。
在尤其優選的實施方案中，在CDK抑制劑前依次或分別地給藥吉西他濱。優選地，在CDK抑制劑前至少1小時給藥吉西他濱，更優選地在CDK抑制劑前至少24小時。
在一種優選實施方案中，相對於單獨成分，分別給藥治療有效量的CDK抑制劑和吉西他濱；換句話說，即使不是以聯合給藥的方式，CDK抑制劑和吉西他濱也是以治療有效量給藥。
在另一種優選實施方案中，相對於單獨成分，分別給藥亞治療量(sub-therapeutic amount)的CDK抑制劑和吉西他濱；換句話說，如果不是聯合給藥給藥，CDK抑制劑和吉西他濱不是以治療有效量給藥。
優選地，吉西他濱和CDK抑制劑以協同方式相互作用。本文使用的術語「協同」是指吉西他濱和CDK抑制劑在聯合使用時能產生比由兩種組分的單獨效應相加預料到的效應更大的效應。有利地，協同相互作用可允許每種組分以較低劑量給藥於患者，從而降低化療的毒性，同時產生和/或保持相同的療效。因此，在尤其優選的實施方案中，可以亞治療量給藥每種組分。
在所附實施例中詳細描述了支持協同相互作用的證據。
鹽/酯本發明的藥劑可以鹽或酯尤其是藥物可接受的鹽或酯的形式提供。
本發明藥劑的藥物可接受鹽包括它們合適的酸加成鹽或鹼加成鹽。合適藥物鹽的綜述可見Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。鹽為與例如以下酸形成的鹽強無機酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫滷酸；強有機羧酸，如未取代或取代(如被滷代)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸(tetraphthalic)；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；胺基酸，例如天冬氨酸或穀氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被滷代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或對甲苯磺酸。
取決於被酯化的官能團，使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯。有機酸包括羧酸，如未取代或取代(如被滷代)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或四鄰苯二甲酸；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；胺基酸，例如天冬氨酸或穀氨酸；苯甲酸；或與有機磺酸，如未取代或取代(如被滷代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或對甲苯磺酸。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代(如被滷代)的1至12個碳原子的鏈烷醇。
對映異構體/互變異構體本發明還適當地包括藥劑的全部對映異構體和互變異構體。本領域的技術人員能認識到具有光學性質(一個或多個手性碳原子)或互變異構特徵的化合物。可通過本領域中已知的方法分離/製備相應的對映異構體和/或互變異構體。
立體異構體和幾何異構體本發明的一些藥劑可以立體異構體和/或幾何異構體的形式存在，例如它們可具有一個或多個不對稱和/或幾何中心，並因此可以二種或多種立體異構和/或幾何形式存在。本發明包括這些抑制劑藥劑所有的單獨立體異構體和幾何異構體及它們的混合物的使用。權利要求中使用的術語包括這些形式，只要所述形式保留適當的功能活性(但不必到相同程度)。
本發明還包括藥劑或其藥物可接受鹽的所有合適的同位素變體。本發明藥劑或其藥物可接受鹽的同位素變體定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數但原子質量與自然界中通常發現的原子質量不同的原子取代的物質。可被摻入到藥劑和其藥物可接受鹽的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。藥劑和其藥物可接受鹽的一些同位素變體，例如結合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易製備和可檢測性而特別優選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因較大的代謝穩定性而提供特定的治療益處，例如體內半衰期增加或劑量要求降低，並因此可在一些情況下被優選。通常可使用合適試劑的適當同位素變體通過常規過程製備本發明藥劑和其藥物可接受鹽的同位素變體。
溶劑合物本發明還包括本發明藥劑的溶劑合物形式。權利要求中使用的術語包括這些形式。
多晶型物本發明還涉及各種結晶形式、多晶型形式和無水/水合形式的本發明的藥劑。眾所周知，在藥物工業中可通過稍微改變這種化合物合成製備中所用溶劑的純化方法和或分離形式來分離得到化合物的任意這類形式。
前體藥物本發明還包括前體藥物形式的本發明的藥劑。這種前體藥物通常為一個或多個適當基團已被修飾以使在對人或哺乳動物對象給藥後所述的修飾可被逆轉的化合物。雖然為了實現體內逆轉可與這種前體藥物一起給藥第二種藥劑，但通常通過在這類對象中天然存在的酶實現這種逆轉。這類修飾的例子包括酯(例如上述那些中的任一種)，其中可通過酯酶等進行逆轉。其它這類系統為本領域中那些技術人員所熟知。
給藥可使本發明的藥物組合物適於口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內、腹膜內、動脈內、鞘內、支氣管內、皮下、皮內、靜脈內、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
對於口服給藥，特別利用壓縮片劑、藥丸、片劑、凝膠(gellules)、滴劑和膠囊。優選地，這些組合物每劑包含1-2000mg和更優選50-1000mg的有效成分。
其它給藥形式包括溶液或乳液，它們可經靜脈內、動脈內、鞘內、皮下、皮內、腹膜內或肌內給藥，並由無菌或可滅菌溶液製備。本發明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳液、洗液、軟膏、乳膏劑、凝膠、噴霧劑、溶液或撲粉(dusting poeder)的形式。
經皮給藥的替代方式是利用皮膚貼片。例如，可將有效成分摻入到由聚乙二醇含水乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內。還可以1-10wt％的濃度將有效成分摻入到由白蠟或白色軟石蠟基質與所需要的穩定劑和防腐劑共同組成的軟膏內。
可注射形式每劑可包含10-1000mg、優選10-500mg的有效成分。
組合物可被配製成單元劑型，即包含單元劑量或單元劑量的多重單位或亞單位的形式的離散部分。
在一種特別優選的實施方案中，靜脈內給藥本發明的聯合或藥物組合物。
劑量本領域的普通技術人員不用額外試驗就可容易地確定對患者給藥的本發明的組合物的適宜劑量。典型地，醫師會確定對個體患者最適合的實際劑量，並且根據各種因素進行調整，包括使用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩定性和作用長短、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排洩速度、藥物聯合、特定病症的嚴重程度和個體正接受的治療。本文公開的劑量為一般情況的示例。當然也可有有益的較高或較低劑量範圍個別情況，這都在本發明的範圍內。
根據需要，可以0.1-30mg/kg體重，如2-20mg/kg體重，更優選0.1-1mg/kg體重的劑量給藥所述藥劑。
指導性地，按照醫師指導，吉西他濱一般地以1000-1250mg/m2體表面積的劑量經靜脈內緩慢給藥。每周可給予所述的劑量，給藥2周直到7周，或每21-28天給藥一次。施用的劑量和給藥頻率一般根據患者的一般體格狀況和引起的副作用的嚴重程度，尤其是引起造血、神經系統和腎系統的那些副作用的嚴重程度進行調整。
roscovitine一般以約0.05-約5g/天，優選約0.4-約3g/天給藥。roscovitine優選以片劑或膠囊的形式口服給藥。roscovitine的總日劑量可作為單次劑量給藥，或以分散劑量每天給藥2、3或4次。
優選地，以0.4-3g/天的劑量口服或靜脈內給藥roscovitine。然後，按認為最合適的方式以上述適宜劑量給藥吉西他濱。優選地，在給藥roscovitine至少24小時後給藥吉西他濱。
通過實施例並結合以下圖進一步描述本發明，其中

圖1顯示了預先暴露於roscovitine 24小時然後暴露于吉西他濱24小時對MiaPaCa胰腺腫瘤細胞系的作用。
圖2顯示了同時暴露於roscovitine和吉西他濱24小時的效應。
實施例使用單層分析和腫瘤幹細胞分析測定roscovitine單獨和聯合吉西他濱對MDA-435乳腺腫瘤細胞系的生長抑制活性。
方法和材料化合物在DMSO中製備CDK抑制劑(例如roscovitine)的儲備溶液並在-20℃下儲存等分試樣。使用前即刻在培養基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium；Life Technologies，Karlsruhe)中製備最終的稀釋液。
產克隆分析由人腫瘤異種移植物製備單細胞懸浮液在無菌條件下切出胸腺發育不全的裸小鼠(NMRI，Naval MedicalResearch Institute，USA，nu/nu株，得自我們自己的飼養設施)中在皮下連續傳代生長的固體人腫瘤異種移植物，機械分解，隨後用酶混合物在37℃下孵育30分鐘，其中酶混合物由膠原酶(41U/ml，Sigma)、DNAseI(125U/ml，Roche)、透明質酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(Dispase)II(1.0U/ml，Roche)在RPMI 1640-培養基(Life Technologies)中組成。使細胞通過200μm和50μm篩的篩，並用無菌PBS緩衝液(Life Technologies)洗滌兩次。利用臺盼藍排斥實驗在Neubauer血細胞計數計上測定活細胞的百分比。
培養方法根據Hamburger Salmon[Alley，M.C.，Uhi，C.B.M.M.Lieber，1982]介紹的改性雙層軟瓊脂分析以24孔形式上進行產克隆分析(clonogenicassay)。通過使用可代謝的四唑鹽改進軟瓊脂集落形成分析中藥物細胞毒性的檢測。Life Sci.313071-3078]。底層由0.2ml/孔的Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(補充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)慶大黴素)和0.75％(w/v)瓊脂組成。向補充有0.4％(w/v)瓊脂的0.2ml相同培養基中加入4·104-8·104個細胞，並以24多孔皿形式接種到底層上。通過在0.2ml培養基中連續暴露(藥物覆層)施用細胞抑制藥。每個皿包括含有溶媒的6個對照孔，和6個濃度的三重的藥物處理組。在37℃下和有7.5％CO2的溼度氣氛中孵育培養物8-20天，使用倒置顯微鏡密切監視集落生長。在此期間，體外腫瘤生長導致直徑＞50μm的集落形成。在最大集落形成時，用自動圖象分析系統(OMNICON FAS IV，Biosys GmbH)進行計數。在評價前24小時，用2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯化物的無菌水溶液(1mg/ml，100μl/孔)[i]染色活集落。
如果滿足下面的質量控制標準，則認為分析完全可評價-24多孔板的對照組孔中的平均集落數≥20個集落且集落直徑＞50μm-陽性參考化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(在1000μg/ml中毒劑量時)必須實現＜20％對照的集落存活率-第0或2天上的初始板計數＜20％的最終對照組計數
-對照組中的變異係數≤50％數據評價用存活率百分數表示藥物效應，通過比較處理板中的平均集落數和未處理對照的平均集落計數得到(相對集落計數用試驗組對對照組值表示，T/C值[％]) IC50和IC70值，分別是抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成需要的藥物濃度，通過繪製化合物濃度對相對集落計數的曲線確定。根據下式計算平均IC50和IC70值；平均IC50,70=10[X=1nlg(IC50,70)n]]]>其中x為特異性腫瘤模型，n為研究的腫瘤模型總數。如果在試驗的劑量範圍內不能確定IC50或IC70值，則使用研究的最低或最高濃度用於計算。
在均值圖形分析(IC曲線)中，在個別腫瘤類型中得到的試驗化合物的IC70值分布以相對於對全部試驗腫瘤的得到的平均IC70值給出。個別IC70值表示為對數坐標軸中的條(bar)。條左邊顯示低於平均值的IC70值(代表較敏感的腫瘤模型)，條右邊顯示較高的值(代表有相當抗性的腫瘤模型)。因此IC曲線反映了化合物抗增殖圖的指紋。
試驗過程roscovitine與標準藥劑的聯合細胞系下面表1中顯示了6種人腫瘤細胞系的特徵。
表1用於試驗roscovitine與標準藥劑聯合的細胞系
ud＝未分化，pd＝分化不足，md＝中度分化，wd＝充分分化，mm＝惡性黑素瘤；ND＝未測定肺癌細胞系LXFA 629L由人腫瘤異種移植物建立，如Roth等人1999年所述[Roth T，Burger AM，Dengler W，Willmann H，Fiebig HH.Human tumorcell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models foranticancer drug screening.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，54145-156]。Fiebig等人於1992年描述了供體異種移植物源[Fiebig HH，Dengler WA，Roth T.Human tumor xenograftsPredictivity，characterization，and discoveryof new anticancer agents.InFiebig HH，Burger AM(eds)，Relevance of TumorModels for Anticancer Drug Development Contrib.Oncol.1999，5429-50]。
細胞系DLD1和HT29(結腸)以及前列腺癌DU145和PC3M得自US-NCI(National Cancer Institute，USA)。
前列腺癌22RV1購自American Type Culture Collection(ATCC)。
按常規每周傳代細胞1次或2次。在培養物中保持它們不超過20次傳代。在補充有10％胎牛血清(Sigma，Deisenhofen，Germany)和0.1％慶大黴素(Invitrogen)的RPMI 1640培養基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中於37℃下和溼度氣氛(95％空氣，5％CO2)中培育所有細胞。
細胞增殖分析使用改性碘化丙啶(propidium iodide)分析評定roscovitine對人腫瘤細胞系生長的影響[Dengler WA，Schulte J，Berger DP等人(1995).Development ofa propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay.Anti-Cancer Drugs 1995，6522-532]。簡單地說，通過胰蛋白酶化從指數生長期培養物中富集細胞，計數並以與細胞系有關的細胞密度(5-12.000活細胞/孔)接種在96孔平底微量滴定板中。在24小時使細胞重新開始指數生長的恢復期後，向孔中加入20μl培養基(每板3個對照孔)或包含各種濃度的試驗製品No.1(標準藥劑)的培養基。每種濃度一式三份接種。在每個板上，在微量滴定板的4個區域4次施加5種濃度的試驗製品No.1。區域1用於單獨的試驗製品No.1，在區域2-4，在3個不同的時間點分別施加試驗製品No.2(roscovitine)。在試驗製品連續暴露4天後，用200μl碘化丙啶(PI)水溶液(7μg/ml)代替有或沒有藥物的細胞培養基。由於PI只通過滲漏的或細胞溶解的細胞膜，因此可染色並測量死細胞的DNA，而活細胞不能被染色。為測量活細胞的比例，通過冷凍板引起全部細胞死亡使細胞透過。在解凍板後，然後使用Cytofluor 4000微量培養板讀數器(激發530nm，發射620nm)測量螢光，給出與總細胞數的直接關係。生長抑制率表示為處理的/對照×100(％T/C)，通過繪製化合物濃度對細胞存活率的曲線確定每種聯合的IC50、IC70和IC90值。
MTT分析利用MTT分析系統評價有和沒有吉西他濱的roscovitine。MTT分析為基於活細胞將MTT轉化成甲(formazan)的能力的分光光度分析。通過測量在測試波長570nm和參考波長630nm處的吸收度估計細胞濃度。使用自動過程測定這些研究中使用的所有藥劑的IC50值(抑制50％對照物細胞生長的藥物濃度)。考慮未來臨床試驗設計選擇有特異性可能的細胞系。
開始時，分別試驗一系列濃度的roscovitine和吉西他濱。在初始IC50分析完成後，然後測試聯合。對於聯合研究，用於表徵相互作用類型的濃度(表示為單獨藥劑IC50的百分數)圖表示在下面
藥物濃度(表示為IC50的百分數)roscovitine吉西他濱100 0752560405050406025750 1000 0聯合研究的統計分析為了解釋聯合曲線，對每一測試聯合(75∶25roscovitine/吉西他濱)和端點(100∶0-roscovitine和0∶100-吉西他濱)進行統計比較。在聯合(roscovitine和吉西他濱)吸收率值和兩個端點值(單獨roscovitine和吉西他濱)之間存在差異，則認為統計學顯著[Greco等人，The search for synergy；Acritical reviewfrom a response surface perspective。Pharmacol；Review 47331-385，1995；Laska等人，Simple designs and model-free tests for synergy；Biometrics 50834-841，1994]。如果大多數(≥3/5)的值在統計上超過或低於線(端點)，則分別描述拮抗作用或協同作用。否則，模式更與加和相互作用一致。
結果Roscovitine暴露然後暴露于吉西他濱在這些研究中，乳腺腫瘤細胞(MDA-435)預先暴露於Roscovitine中24小時，然後暴露于吉西他濱24小時(表2和3，圖1)。對兩種藥劑的這種暴露順序產生了表明這些藥劑之間協同相互作用的模式。
表2
表3
同時暴露於Roscovitine和吉西他濱當人前列腺腫瘤細胞同時暴露於Roscovitine和吉西他濱時，觀察到加和的藥物-藥物相互作用(表4和5，圖2)。
表4
表5
作為總結，結果表明，與單獨或同時給藥任何一種藥物相比，聯合給藥吉西他濱和Roscovitine能產生增強的效應。這種效應表明了兩種成分之間的協同相互作用。
在不脫離本發明的範圍和精神的情況下，本發明的各種改變和變化對本領域的那些技術人員來說是顯而易見的。儘管已結合具體的優選實施方案描述了本發明，但應該認識到要求的本發明不應該不適當地限制至這種具體實施方案。事實上，對相關領域那些技術人員明顯的用於實施本發明上述方式的各種改變都被本發明覆蓋。
權利要求
1.一種聯合，包括CDK抑制劑和吉西他濱。
2.根據權利要求1所述的聯合，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
3.根據權利要求1或2所述的聯合，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
4.根據任一前述權利要求所述的聯合，其中CDK抑制劑為roscovitine。
5.一種藥物組合物，包括根據任一前述權利要求所述的聯合和藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
6.根據權利要求1至4中任一項所述的聯合在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
7.一種藥物製品，包括CDK抑制劑和吉西他濱，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯合製劑。
8.根據權利要求7所述的藥物製品，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
9.根據權利要求7或8所述的藥物製品，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
10.根據權利要求7至9中任一項所述的藥物製品，其中CDK抑制劑為roscovitine。
11.根據權利要求7至10中任一項所述的藥物製品，以包括藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物的形式存在。
12.根據權利要求7至11中任一項所述的藥物製品，用於治療增殖性疾病。
13.根據權利要求12所述的藥物製品，其中增殖性疾病為癌症。
14.根據權利要求13所述的藥物製品，其中癌症為前列腺癌。
15.一種治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地對患者給藥吉西他濱和CDK抑制劑。
16.根據權利要求15所述的方法，包括在對患者依次或分別地給藥吉西他濱前對所述患者給藥所述CDK抑制劑。
17.根據權利要求15所述的方法，包括在對患者依次或分別地給藥CDK抑制劑前對所述患者給藥吉西他濱。
18.根據權利要求15至17中任一項所述的方法，其中CDK抑制劑為CDK2或CDK4的抑制劑。
19.根據權利要求18所述的方法，其中CDK抑制劑選自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奧羅莫星。
20.根據權利要求19所述的方法，其中CDK抑制劑為roscovitine。
21.根據權利要求15至20中任一項所述的方法，其中相對於單獨成分，分別以治療有效量給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
22.根據權利要求15至20中任一項所述的方法，其中相對於單獨成分，分別以亞治療量給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
23.根據權利要求15至22中任一項所述的方法，其中增殖性疾病為癌症。
24.根據權利要求23所述的方法，其中癌症為肺癌或胰腺癌。
25.CDK抑制劑在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述治療包括同時、依次或分別地對患者給藥吉西他濱和CDK抑制劑。
26.CDK抑制劑和吉西他濱在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途。
27.CDK抑制劑在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用於與吉西他濱的聯合治療。
28.吉西他濱在製備治療增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述藥物用於與CDK抑制劑的聯合治療。
全文摘要
本發明的第一方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱的聯合。本發明的第二方面涉及包括CDK抑制劑和吉西他濱的藥物製品，作為在治療中同時、依次或分別使用的聯合製劑。本發明的第三方面涉及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括同時、依次或分別地對患者給藥CDK抑制劑和吉西他濱。
文檔編號A61K45/06GK1708319SQ200380102233
公開日2005年12月14日 申請日期2003年11月5日 優先權日2002年11月6日
發明者阿索斯·賈內拉－博爾－拉多裡 申請人:西克拉塞爾有限公司