大腸腫瘤的檢測方法

2023-06-13 18:50:41

專利名稱：大腸腫瘤的檢測方法
技術領域：
本發明涉及使用標記基因進行的大腸腫瘤、特別是進行性腺瘤、早期癌的檢測方法。更具體地涉及，以糞便中所含的標記基因來源RNA的量作為指標，檢測被採集了該糞便的受驗者是否患大腸腫瘤的方法。本申請要求2010年6月16日在日本國提出的特願2010-137460號的優先權，在此援引其內容。
背景技術：
大腸癌引起的死亡者在增加。大腸癌引起的死亡者在所有癌引起的死亡者中，男性方面排在第4位，女性方面排在第I位，是一種死亡者多的癌(2005年度癌症死亡統計)。此外，在2020年的癌患者估計中，推測在男性中排第二位，在女性中排第一位。因此，強烈 需要包含二次預防在內的綜合性大腸癌對策。與其他癌相比，大腸癌在早期發現、並進行合適治療的情況下的5年生存率非常高,因而大腸癌的群體篩查(mass screening)是最有效果的方法之一。為了大腸癌的確診，一般進行能夠直接視覺確認大腸內的內視鏡檢查，再視需要進行患處的活體檢查。然而，這些方法是侵襲性的，且需要高度的專業技術，因此不適合群體篩查這樣的初篩。為了群體篩查，簡便且非侵襲性的檢測方法是重要的。現在能夠利用的唯一的非侵襲性方法是考察有無潛血的糞便檢查、即便潛血檢查，其作為大腸癌的群體篩查的標準方法被廣泛採用。然而，就便潛血檢查而言，糞便中出現血紅蛋白並不是腫瘤特異性的，因此，缺點是靈敏度以及特異性低(靈敏度30、0%、特異性70、8%)，假陰性、假陽性相當多地存在。非侵襲性檢測大腸癌的方法，有以糞便中所含的成分作為指標的方法。糞便中包含從癌組織剝離的細胞，因而，可以認為糞便的組成能夠反映消化道病變。因此，以正常組織中幾乎不表達、但癌組織中高表達的基因作為生物標記，以糞便中該基因的mRNA量作為指標，將癌患者與健康正常人相區別。這樣，通過用糞便作為分析物，不存在侵襲性，可以飛躍式地改善受驗者的檢查負擔。例如已經報告了檢測糞便中的K-ras、p_53、APC基因突變、微衛星不穩定性等的利用DNA的方法(例如，參照非專利文獻f4)。此外，還開發出了檢測糞便中的蛋白激酶C(PKC)等mRNA的方法(例如，參照非專利文獻5 7)、考察糞便的細胞級分的CD44變體的表達的方法(例如，參照非專利文獻8)、檢測糞便中所含的基因組DNA的甲基化的有無的方法(例如，參照非專利文獻9)等。這樣，報告了許多可作為生物標記利用的基因，可以以它們在糞便中的含量作為指標，來檢測大腸癌。然而，存在的問題是使用這些生物標記時的靈敏度基本上與便潛血法程度等同或者較之更低。特別是，在群體篩查中，早期癌、癌化可能性高的進行性腺瘤這樣的可通過內視鏡或手術切除治癒的腫瘤的檢測是重要的，但上述任何生物標記對早期癌、進行性腺瘤的檢測靈敏度均比便潛血法還要差。因此，強烈希望開發以糞便作為分析物高靈敏度地檢測早期癌等的方法。作為靈敏度高於便潛血法的大腸癌的檢測方法，本發明人公開了以糞便中的C0X_2(環加氯酶-2, Cyclooxygenase-2)基因的表達量作為指標的方法(例如，參照專利文獻廣4。)。C0X-2基因作為大腸癌的基因標記是非常優秀的，但還存在C0X-2基因的表達量不增大的大腸癌(C0X-2陰性大腸癌)，無法檢測這樣的案例。專利文獻3也公開了MMP-7 (基質金屬蛋白酶-7)基因、SnaiI基因等可與C0X-2基因組合使用的基因標記，但這些基因的表達量許多情況下顯示與C0X-2基因的表達量基本相同的行為，因此，即使在將這些基因標記組合使用的情況下，提高C0X-2陰性大腸癌的檢測靈敏度也是困難的。此外，C0X-2基因、MMP-7基因、以及Snail基因存在依賴癌的進行性而糞便中的表達量增大的傾向，因而也存在與進行性癌相比，早期癌的檢測靈敏度低的問題。
另一方面,有報告稱,在大腸癌中，CKB(肌酸激酶B, Creatine kinase B)以及hnRNP F (異源核核糖核酸 F, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F)的表達量及細胞內定位發生變化(例如，參照非專利文獻10)。還有報告稱，對於CKB，除此之外，子宮癌中的表達量也增大，血清中的CKB含量還可以用作子宮癌標記(例如，參照非專利文獻11)。然而，關於糞便中的CKB含量作為大腸癌標記的利用可能性，目前完全沒有報導。本領域技術人員應當理解的是，編碼表達量的增減依賴於癌化的蛋白質的基因未必一定能夠作為臨床上有用的生物標記加以利用。現有技術文獻專利文獻專利文獻I專利第4134047號公報專利文獻2專利第4206425號公報專利文獻3國際公開第2007 / 018257號小冊子專利文獻4國際公開第2008 / 093530號小冊子非專利文獻非專利文獻ID. Sidransky, et al.，Science, 1992 年、第 256 卷、第 102 105 頁。非專利文獻2S. M. Dong, et al. , Journal of the National Cancer Institute,2001年、第93卷、第11號、第858 865頁。非專利文獻3G. Traverso, et al. , The New England Journal of Medicine, 2002年、第346卷、第5號、第311 320頁。非專利文獻4G. Traverso, et al. , The Lancet, 2002 年、第 359 卷、第 403 404頁。非專利文獻5L. A. Davidson, et al.，Carcinogenesis, 1998 年、第 19 卷、第 2 號、第253 257頁。非專利文獻6R. J. Alexander and R. F. Raicht, Digestive Diseases andSciences, 1998 年、第 43 卷、第 12 號、第 2652 2658 頁。非專利文獻7T. Yamao et al.，Gastroenterology, 1998 年、第 114 卷、第 6 號、第1198 1205 頁。非專利文獻8H.Saito, Japanese Journal of Cancer Research, 1996年、第87卷、第10號、第1011 1024頁。非專利文獻9T.Nagasaka, et al. , Journal of the National Cancer Institute,2009年、第101卷、第18號、第1244 1258頁。非專利文獻10M. Balasubramani, et al.，Cancer Research, 2006 年、第 66 卷、第2號、第763 769頁。非專利文獻11H.G. Huddleston, et al. , Gynecologic Oncology, 2005 年、第 96卷、第77 83頁。

發明內容
發明所要解決的問題本發明的目的是提供以糞便中所含的成分作為指標，高靈敏度檢測大腸腫瘤、特 別是進行性腺瘤、早期癌的方法。解決問題的方法本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果在從大腸腫瘤患者提供的糞便提取RNA，並對該RNA中所含的人基因來源的RNA進行解析時，發現大腸腫瘤患者中，與大腸腫瘤非患者(大腸無特別疾病者)相比，糞便中所含的CKB(肌酸激酶B)基因來源RNA的量更多，從而完成了本發明。即，本發明如下。(I)大腸腫瘤的檢測方法，其是使用標記基因檢測大腸腫瘤的方法，其包括(A)提取從受驗者採集的糞便中所含的RNA的步驟、(B)測定所述步驟㈧中得到的RNA中的標記基因來源RNA的量的步驟、以及(C)對所述步驟(B)中測定的標記基因來源RNA的量、與按標記基因的種類預先設定的閾值進行比較的步驟；其中，所述標記基因是CKB (肌酸激酶B)基因。(2)所述⑴所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用選自 C0X-2 (環加氯酶-2)基因、MMP-7 (基質金屬蛋白酶-7, Matrixmetalloproteinase-7)基因、Snail基因、MMP-1 (基質金屬蛋白酶-I，Matrixmetalloproteinase-I)基因、以及Β2Μ(β2微球蛋白，^2microglobulin)基因中的I種以上的基因。(3)所述⑴所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因還使用C0X-2基因。(4)所述(3)所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用選自MMP-7基因、Snail基因、MMP-I基因、以及B2M基因中的I種以上的基因。(5)所述⑴所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用MMP-7基因。(6)所述(3) (5)中的任何一項所述的大腸腫瘤的檢測方法，其檢測大腸腺瘤或
大腸早期癌。(7)所述(1Γ(5)中的任何一項所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，所述受驗者有被診斷為患大腸腫瘤的經歷，
對於從所述受驗者隨時間採集的糞便，分別進行所述步驟(A廣(C)，用於監測該受驗者的大腸腫瘤的復發可能性。(8)大腸腫瘤的基因標記，其由CKB(肌酸激酶B)基因組成。(9) 一種用於使用糞便檢測大腸腫瘤的試劑盒，其包含用於提取糞便中所含的RNA的器械或試劑，用於檢測CKB (肌酸激酶B)基因來源RNA的探針或引物中的至少一個。發明的效果通過採用本發明的大腸腫瘤的檢測方法，能夠以從受驗者採集的糞便作為分析物，提供用於判斷該受驗者是否患大腸腫瘤的有用信息。·


圖I示出了將實施例I中得到的、糞便中的各標記基因來源RNA量用作大腸腫瘤的基因標記的情況下的ROC(接受者操作特徵,ReceiverOperating Characteristic)解析結果。發明的
具體實施例方式在本發明以及本申請說明書中，大腸腫瘤是指發生於大腸的腫瘤，不論良性或惡性，包括大腸腺瘤與大腸癌這兩者。大腸癌的進行程度對確定治療方法而言是重要因素。大腸癌一般分為臨床病期(Tiv期。在本發明以及本申請說明書中，各病期分別指以下的狀態。O期癌止於黏膜內的狀態。I期癌止於大腸壁內的狀態。II期癌超越大腸壁的固有肌層、波及壁外的狀態。III期癌轉移至淋巴結的狀態。IV期癌轉移至遠端臟器、淋巴結的狀態。大腸早期癌(early cancer)、進行性癌(advanced cancer)是通過壁侵入深度來規定的。早期癌是指癌的進展部(先進部)局限在大腸壁的黏膜內或黏膜下層，未超出此範圍，是臨床病期中的O期和I期的一部分。進行性癌是指癌的進展部超出黏膜下層，到達比固有肌層更深處，是臨床病期中的I期的一部分、II期、III期和IV期。這些在大腸癌操作規程第7版(大腸癌研究會，金原出版，2006年)中有定義。大腸腺瘤(adenoma)也根據大小、異型度(異型度)分為小腺瘤和進行性腺瘤(advanced adenoma)。在大腸腺瘤中，有些與大腸早期癌、特別是黏膜癌(O期癌)難以鑑另O。其中，超過IOmm大小的進行性腺瘤作為與黏膜癌一樣、存在將來進展至黏膜下層癌(I期癌)的可能性的腫瘤，被認為是癌。因此，在群體篩查等初篩中，像大腸早期癌一樣，檢測大腸腺瘤、特別是進行性腺瘤是重要的。此外，在本發明以及本申請說明書中，「標記基因來源RNA」是指轉錄自標記基因的基因組DNA的全長或一部分的RNA，可以是該基因的mRNA，也可以是該mRNA的一部分(片段)。在本發明以及本申請說明書中，「非患者」是指未患大腸腫瘤者，不僅包括健康正常人，還包括患大腸腫瘤以外的疾病者。
正如本發明人已經 闡明的那樣，糞便中的C0X-2基因來源RNA量是用於檢測大腸癌的非常有效的生物標記(參照專利文獻廣4)。然而，僅以C0X-2基因作為生物標記的情況下，無法檢測C0X-2陰性的大腸癌。因此，本發明人認為通過將能夠檢測C0X-2陰性的大腸癌的標記基因與C0X-2基因組合使用，能夠在群體篩查等中以更好的靈敏度檢測大腸腫瘤，並進行了這樣的新的標記基因的探索。具體地，從通過內視鏡檢查等確診為大腸癌發病、且糞便中的C0X-2基因來源RNA的量與健康正常人相比非常多的患者(C0X-2強陽性大腸癌患者)，以及通過內視鏡檢查等確診為大腸癌發病、但C0X-2基因來源RNA的量僅與非患者程度等同的患者(C0X-2陰性大腸癌患者)分別採集的糞便，從該糞便提取總RNA，用其進行各基因的表達解析。作為對照，對從健康正常人採集的糞便也同樣進行。而且，從這些患者以及健康正常人事前得到了口頭或書面形式的知情同意。此外，所採集的糞便的保存、RNA提取像後面的實施例I所述的方法那樣進行。各基因的表達解析通過使用GeneChip (註冊商標)陣列的Agilent表達測定解析來進行(外包給AKARABio株式會社Dragon Genomics Center)。其結果,糞便中的C0X-2基因來源RNA的量在C0X-2強陽性大腸癌患者中是健康正常人的25. 3倍，相比之下，在C0X-2陰性大腸癌患者中僅為健康正常人的I. 4倍。此外，MMP-7基因以及MMP-I基因的各基因來源RNA量也像C0X-2基因那樣，在C0X-2強陽性大腸癌患者中多，但在C0X-2陰性大腸癌患者中並未明顯高於健康正常人。另一方面可知，CKB基因在C0X-2陰性大腸癌患者中，與健康正常人相比，糞便中的表達量上升28. 8倍。由這些結果可知大腸腫瘤患者中，與非患者相比，存在糞便中的CKB基因來源RNA多的傾向；通過使用CKB基因作為大腸腫瘤的標記基因，不僅能夠檢測C0X-2陽性的大腸腫瘤，還能檢測C0X-2陰性的大腸腫瘤。本發明的大腸腫瘤的檢測方法的特徵是，作為大腸腫瘤的基因標記，使用了 CKB基因。糞便中的CKB基因來源RNA的量存在在大腸腫瘤患者中比非患者多的傾向。因此，以糞便中的CKB基因來源RNA的量作為指標，能夠檢測大腸腫瘤的患的有無。即，本發明可以說是一種為了考察大腸腫瘤的患的有無，而使用CKB基因作為大腸腫瘤的基因標記，來檢測糞便中的大腸腫瘤的基因標記來源RNA的方法。在本發明的大腸腫瘤的檢測方法中，作為大腸腫瘤的基因標記，可以組合使用CKB基因以外的其他標記基因。通過組合使用2種以上的基因，能夠以更好的精度檢測大腸腫瘤。對與CKB基因組合的其他標記基因沒有特殊限制，是糞便中的該基因來源RNA量在大腸腫瘤患者群與非患者群中存在顯著差異的基因即可。在本發明中，作為與CKB基因組合使用的標記基因，優選使用選自C0X-2基因、MMP-7基因、Snail基因、MMP-I基因、以及B2M基因中的I種以上的基因。已經發現，CKB基因是糞便中的該基因來源RNA的量在C0X-2陰性大腸癌患者(C0X-2基因來源RNA的量僅為與非患者等同程度的大腸癌患者)中比非患者高的基因，因而能夠作為大腸腫瘤的基因標記加以利用。因此，在本發明的大腸腫瘤的檢測方法中，作為大腸腫瘤的標記基因，特別優選將CKB基因與C0X-2基因組合使用。通過CKB基因與C0X-2基因組合使用，能夠進一步提高大腸腺瘤、早期癌的檢測靈敏度。
作為本發明中使用的大腸腫瘤的標記基因的組合，具體地可以列舉出，CKB基因與C0X-2基因的組合、CKB基因與C0X-2基因與MMP-7基因的組合、CKB基因與C0X-2基因與Snail基因的組合、CKB基因與C0X-2基因與MMP-I基因的組合、CKB基因與C0X-2基因與B2M基因的組合、CKB基因與C0X-2基因 與MMP-7基因與B2M基因的組合、以及CKB基因與MMP-7基因的組合等。例如，通過組合使用3個基因，通過CKB基因與C0X-2基因與MMP-7基因的組合，與使用CKB基因與C0X-2基因與Snail基因的組合、CKB基因與C0X-2基因與MMP-I基因的組合、或CKB基因與C0X-2基因與B2M基因的組合的情況相比，特別是更能夠改善大腸腺瘤的檢測靈敏度。此外，特別是，通過組合使用CKB基因與C0X-2基因與MMP-7基因與B2M基因這4個基因，能夠以非常高的精度且高的靈敏度檢測大腸腫瘤。本發明的大腸腫瘤的檢測方法具體地具有下述步驟(A)IC)。(A)提取從受驗者採集的糞便中所含的RNA的步驟、(B)測定所述步驟㈧中得到的RNA中的標記基因來源RNA的量的步驟、以及(C)對所述步驟(B)中測定的標記基因來源RNA的量、和按標記基因的種類預先設定的閾值進行比較的步驟。以下，按步驟進行說明。首先，作為步驟(A)，提取從受驗者採集的糞便中所含的RNA。在本步驟中，提取的RNA可以按常規方法純化。對從糞便提取、純化RNA的方法沒有特殊限制，可以採用該技術領域公知的任何方法，可以利用市售的純化試劑盒等。而且，在轉入下面的步驟前，可以預先測定步驟㈧中得到的RNA的量、濃度。對RNA的量、濃度的測定方法沒有特殊限制，可以採用吸光度測定法等該技術領域中公知的任何方法。在步驟(A)中供RNA提取的糞便沒有特殊限制，是人來源的即可，例如，可以使用為定期健康檢查、診斷等而採集的分析物等。此外，可以是剛排洩後的，也可以是採集後保存一定時間的。對糞便的保存方法沒有特殊限制，可以採用臨床檢查等中對糞便採取的任何保存方法。例如，可以將冷凍保存、冷藏保存的糞便用於RNA提取，也可以使用以浸潰、懸浮的狀態保存於各種保存液中的糞便。作為添加到糞便的保存液，優選例如，以水溶性醇類等作為有效成分的糞便試樣製備用溶液(參照例如國際公開第2010 - 024251號小冊子。)等、能夠抑制糞便中的RNA的損傷而保存的溶液。步驟(A)中提取的RNA可以直接用於步驟(B)，也可以保存一定時間後用於步驟
(B)。RNA的保存可以採用任何方法進行，是能夠抑制RNA的分解而保存的方法即可，例如，可以冷凍乾燥後保存，也可以以溶解於純化水中的溶液的狀態來保存。然後，作為步驟(B)，測定步驟㈧中得到的RNA中的標記基因來源RNA的量。對步驟(B)中的標記基因來源RNA的量的測定方法沒有特殊限制，可以從通常測定具有特定的鹼基序列的核酸的量時採用的公知方法中適宜選擇。而且，在本發明以及本申請說明書中，測定RNA的量不是指嚴格的定量，可以是半定量的，也可以是能夠與指定閾值等進行定量比較的程度的測定。例如，可以採用該技術領域中的公知方法檢測標記基因來源RNA，從所得檢測結果基於由濃度已知的對照試樣的檢測結果製作的標準曲線計算得出。對標記基因來源RNA的檢測方法沒有特殊限制，可以採用該技術領域中公知的任何方法。例如，可以通過使用能夠與標記基因來源RNA雜交的探針的雜交法進行檢測，也可以通過利用使用能夠與標記基因來源RNA雜交的引物和聚合酶的核酸擴增反應的方法進行檢測。其他的，還可以利用市售的檢測用試劑盒等。步驟(B)中的測定，可以是對步驟(A)中得到的RNA中存在的標記基因來源RNA直接定量檢測，也可以將該RNA中的標記基因來源RNA通過核酸擴增反應進行擴增後進行定量檢測。例如，可以通過使用與標記基因來源RNA相鄰雜交的2條探針，在雜交後利用連接酶反應進行結合，定量檢測所得結合體的方法，使用標記的探針進行Northern印跡法、以標記作為指標定量檢測通過雜交形成結合體的探針的量的方法等，直接檢測標記基因來源 RNA。因為標記基因來源RNA的量是微量的，因而可以採用利用核酸擴增反應的方法來測定。例如，相對於步驟㈧中得到的RNA的總量或一部分，通過進行逆轉錄反應合成cDNA後，通過以所得cDNA作為模板進行核酸擴增，檢測標記基因來源RNA，能夠測定其量。作為以cDNA作為模板的核酸擴增法，通常進行PCR(聚合酶鏈式反應，Polymerase Chain Reaction),也可以米用 LAMP (環介導的等溫擴增，Loop-MediatedIsothermal Amplification)法、ICAN(等溫和嵌合引物引發的核酸擴增，Isothermal and ChimericPrimer-initiated Amplification of Nucleic acids)法。此夕卜，作為該核酸擴增，通過進行實時PCR等定量PCR，可以在標記基因來源RNA檢測的同時簡便地進行其定量。其他的，通過從RNA直接擴增RNA的NASBA(基於核酸序列的擴增，Nucleic AcidSequence-Based Amplification)法，也可以擴增標記基因來源RNA。標記基因來源RNA的擴增產物可以採用該技術領域中的公知方法進行定量。例如，通過將該擴增產物適宜用凝膠、毛細管電泳等進行特異性分離後對其進行檢測，能夠定量地進行測定。此外，標記基因來源RNA的檢測可以利用Invader (註冊商標)法等各種增敏方法。增敏法可以在對步驟(A)中得到的RNA中存在的標記基因來源RNA進行直接檢測的情況、和在利用核酸擴增反應進行擴增後進行檢測的情況中的任何情況下進行利用。在作為標記基因組合使用CKB基因與其他基因的情況下，可以分別測定各標記基因來源RNA的量，也可以同時測定。例如，可以以從步驟㈧中得到的RNA的總量或一部分利用逆轉錄反應得到的cDNA作為模板，按基因的種類分別進行PCR得到擴增產物，也可以通過進行多重PCR等，在I個反應中得到多個基因的擴增產物。步驟⑶後，作為步驟(C)，將步驟⑶中測定的標記基因來源RNA的量與按標記基因的種類預先設定的閾值進行比較。該閾值是用於識別大腸癌或進行性腺瘤患者群與非患者群的閾值。在測定的標記基因來源RNA量多於預先設定的閾值的情況下為陽性，少於該閾值的情況下為陰性。步驟(C)中使用的閾值可以由本領域技術人員在考慮步驟(B)中的標記基因來源RNA量的測定方法的種類等的基礎上、或通過進行必要的預備檢查等，來適宜設定。例如，對於從根據內視鏡檢查等其他檢查方法的結果可知未患大腸疾病的集團(非患者群)採集的糞便、與從根據內視鏡檢查等其他檢查方法的結果可知患大腸癌或者大腸進行性腺瘤的集團(患者群)採集的糞便，通過採用與步驟(B)相同的測定方法求出標記基因來源RNA量，並比較兩集團的測定值，能夠適宜設定用於識別兩個群的閾值。在設定閾值時，還可以考慮希望的檢測精度。在對於非患者群與患者群這兩個群，糞便中的標記基因來源RNA量的分布已明確的情況下，可以對閾值進行設定，使得例如，從大腸癌或大腸進行性腺瘤的患者採集的糞便中的標記基因來源RNA量小於閾值的概率(即，判斷為非患者的概率)在希望的範圍內(例如，10%以下、優選5%以下、更優選2. 5%以下、更優選1%以下、特別優選0%)。此外，在僅對於非患者群，糞便中的標記基因來源RNA量的分布已明確的情況下，可以對閾值進行設定，使得例如在假定受驗者為非患者的情況下，從該受驗者採集的糞便中的標記基因來源RNA量以非患者的百分位數計為希望的值(例如，90%ile、優選95%ile、更優選97. 5%ile、更優選99%ile、特別優選100%ile)。此外，可以對閾值進行設定，使得作為該從受驗者採集的糞便中的標記基因來源RNA量小於閾值的顯著概率(P值)為希望的值(例如，10%、優選5%、更優選1%、更優選O. 1%)。而且，P值可以是雙側概率，也可以是單側概率。在僅對於患者群，糞便中的標記基因來源RNA量的分布已明確的情況下，可以同樣對閾值進行設定。而且，P值可以通過Mann Whitney氏U檢驗等統計學方法來求出。具體地，在步驟⑶中測定的CKB基因來源RNA的量(以下稱CKB來源RNA量)多於預先設定的閾值的情況下，判定所述受驗者為CKB陽性；少於該閾值的情況下，判定所 述受驗者為CKB陰性。CKB來源RNA量存在在大腸腫瘤患者群中高於非患者群的傾向。因此，得到CKB陽性這個檢測結果的受驗者正在患大腸腫瘤的可能性高。因此，通過將本發明的大腸腫瘤的檢測方法用於群體篩查等初篩，對於判斷為CKB陽性的受驗者進行內視鏡檢查等，可以進行確診。這樣，通過本發明的大腸腫瘤的檢測方法所得檢測結果作為用於大腸腫瘤的診斷的信息是有用的。即，通過本發明的大腸腫瘤的檢測方法，能夠提供用於大腸腫瘤的診斷的信息。這樣，糞便中的CKB來源RNA量依賴於有無大腸腫瘤的發病，存在大腸腫瘤發病的受驗者群高於大腸腫瘤未發病的受驗者群的傾向。因此，本發明的大腸腫瘤的檢測方法能夠用於大腸腫瘤的復發可能性的監測。具體地，從具有被診斷為患大腸腫瘤的經歷的受驗者隨時間採集糞便。對於採集的各糞便，分別進行上述步驟(A廣(C)。例如，從通過外科處理等將已經發病的大腸腫瘤的病變部位切除的受驗者，隨時間測定糞便中的CKB來源RNA量的情況下，在所得測定值高於預先設定的閾值的情況下，可以判斷在採集該糞便的時間點上，該受驗者中大腸腫瘤復發的可能性高。本發明的大腸腫瘤的檢測方法中的靈敏度、特異性可以根據設定的閾值適宜調整。例如，在希望得到充分高的靈敏度的情況下，即希望檢測有患大腸腫瘤的情況下，優選設定閾值，使得從大腸腫瘤的患者採集的糞便中的標記基因來源RNA量小於閾值的概率(即，判斷為非患者的概率)為1%以下、特別優選0%。另一方面，在用於健康診斷等初篩的情況下，優選特異性高，即便會多少犧牲靈敏度。因此，例如，可以設定閾值，使得從健康正常人採集的糞便中的標記基因來源RNA量超過閾值的概率(即，判斷為患者的概率)變得充分小，例如為10%以下、優選5%以下。這樣，在本發明的大腸腫瘤的檢測方法中，可以兼顧希望的靈敏度、特異性，來設定閾值。在作為標記基因組合使用CKB基因與其他基因的情況下，按標記基因分別與閾值進行比較，判斷陽性或陰性。至少I個標記基因為陽性的受驗者患有大腸腫瘤的可能性高。根據大腸腫瘤的類型，多存在多個大腸腫瘤標記中某標記基因為陽性但其他標記基因為陰性的情況。因此，通過將標記基因多種組合使用，能夠提高大腸腫瘤檢測的靈敏度。此外，通過使用具備所述步驟(A)以及(B)中使用的試劑、器械等的試劑盒，能夠簡便地實施本發明的大腸腫瘤的檢測方法。該試劑盒具體地包含用於提取糞便中所含的RNA的器械或試劑、以及、用於檢測CKB基因來源RNA的探針或引物中的至少一個，可用於利用糞便檢測大腸腫瘤。作為用於提取糞便中所含的RNA的器械或試劑，可以列舉出例如，用於將採集的糞便均質化、製備從該糞便所含的細胞提取核酸的懸浮物的懸浮用溶液，用於從所得懸浮物回收、純化RNA的試劑等。作為該懸浮用溶液，可以在從糞便回收核酸時通常使用的溶液中適宜選擇。作為該懸浮用溶液，具體地，可以列舉出苯酚溶液、氯仿溶液等。此外，該懸浮用溶液優選包含硫氰酸胍、表面活性劑、螯合劑等RNA分解酶抑制劑。作為用於從懸浮物回收、純化RNA的試劑等，可以列舉出例如，乙醇溶液、二氧化矽等無機載體等。此外，因為步驟(A)中可以利用市售的核酸純化試劑盒等，故而將市售的核酸純化試劑盒、與用於檢測CKB基因來源RNA的探針或引物組合而成的製品，也可以作為本發明的試劑盒。作為用於檢測CKB基因來源RNA的探針或引物，可以使用能夠與CKB基因來源 RNA、或從該RNA得到的cDNA的一部分特異性雜交的寡核苷酸。而且，能夠與CKB基因來源RNA等雜交的寡核苷酸可以採用該技術領域中公知的任何方法來設計、製作。例如，在採用下述方法進行CKB基因來源RNA的檢測的情況下，所述方法是以從糞便提取的RNA作為模板通過逆轉錄反應合成cDNA後、以所得cDNA作為模板使用用於檢測CKB基因來源RNA的引物進行PCR等核酸擴增反應，並檢測所得擴增產物的方法，本發明的試劑盒中可以包含用於逆轉錄反應的逆轉錄酶、隨機引物、核苷酸、緩衝液等，用於PCR的聚合酶、標記核苷酸、非標記核苷酸、緩衝液、PCR裝置等。其他的，本發明的試劑盒中可以包含用於採集以人為代表的動物排洩的糞便的採便棒、採集容器等。實施例以下給出實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明不受以下實施例的限制。[實施例I]由大腸小腺瘤(腫瘤的大小為5、mm)患者10名、大腸進行性腺瘤(腫瘤的大小為IOmm以上)患者24名、大腸癌患者111名(早期癌25名、進行性癌86名)、上消化道癌患者12名(胃腫瘤患者10名、食道癌患者2名)、以及健康正常人113名提供糞便。各患者是經內視鏡、組織學確診的患者。在本實施例中，大腸未確認腫瘤性病變(但不包含小於5mm的腺瘤性息肉、增生息肉)、明顯的炎症性變化,且無出血性病變、全身性疾病以及進行性的癌的人作為健康正常人。此外，大腸癌患者111名中，病期O期11名，病期I期24名，病期II期37名，病期III期25名，病期IV期14名。而且，事先從這些患者以及健康正常人得到了口頭或書面形式的知情同意。分析物(糞便樣品)於內視鏡檢查或活檢2 4星期後、手術或內視鏡切除前採集。採集的糞便樣品先於4°C保存後，在保存開始後24小時以內移至一 80°C保存，直至進行RNA提取處理。在已滅菌的5mL管中加入約O. 5 g的冷凍的糞便樣品和3mL的Isogen (Nippongene公司製造)後，用勻眾器混合，使之均一化。將所得眾料以各約O. 7mL分裝於已滅菌的1.5mL管中後，12，000Xg、4°C離心5分鐘，將其上清分裝在新的已滅菌的I. 5mL管中。在各管中分別加入O. 3mL的Isogen和O. 3mL的氯仿,將管用潤旋攪拌器(Voltex)劇烈攪拌30秒後，12，000Xg、4°C離心15分鐘。從管上面回收所得水相，注意不要汙染，移入新的1.5mL管中。加入等量的70%乙醇溶液後，將管用渦旋攪拌器劇烈攪拌30秒。從所得混合液使用RNeasy小提試劑盒(QIAGEN公司製造)提取並純化RNA。將純化的RNA用NanoDrop 1000 (NanoDrop Wilmington公司製造)進行定量。將RNA保存於一80°C，直至用於以後的解析。使用純化的RNA、隨機六聚體和逆轉錄酶M-MLV (RNAseH-; TAKARABio公司製造)，在最終容量20 μ L的反應液中按使用說明書合成CDNA。
通過以合成的cDNA作為模板進行定量實時PCR，針對該cDNA中的CKB基因、C0X-2基因、匪 -7基因、31^11基因、MMP-I基因、以及B2M基因，對從糞便中的各基因來源RNA合成的cDNA的量進行了定量。用於檢測這些標記基因的TaqMan(註冊商標)引物或探針組分別使用了 AppliedBiosystems公司的市售品。而且，這些組所含的探針是5』端側用螢光物質FAM標記、3』端側用消光物質標記的報告探針。具體地，在I μ L的cDNA溶液和I μ L的 20 X TaqMan 引物與探針混合物(primers and probe mixture, Applied Biosystems 公司製造)中加入已滅菌的純化水，將最終容量製備為20 μ L，以此作為PCR反應溶液。對於按基因分別製備的PCR溶液，以95°C處理20秒後、將95°C 3秒、62°C 30秒進行60個循環的反應條件，使用7500快速實時PCR系統(Applied Biosystems公司製造)，一邊實時測定螢光強度，一邊進行核酸擴增(PCR)。作為計算拷貝數的對照試樣(標準物質)，使用載入了各基因的cDNA的質粒，同時進行了擴增。針對測定結果所得的標記基因來源RNA量(拷貝數)的統計學處理通過MannWhitney氏U檢驗進行。此外，全部統計學處理採用雙側檢驗進行，？值< O. 05為統計上顯著。而且,標記基因來源RNA的大部分是該基因來源的mRNA,因而以下以mRNA記載。對於與用於標記基因來源RNA量的測定的同一糞便，進行免疫學便潛血檢查(MPA)法(I次)，檢測了潛血的有無。免疫學便潛血檢查使用市售的便潛血試劑盒「Magstream(註冊商標)HemSp_N」 (磁性粒子凝集反應藥)(FuJiRebio公司製造,產品號214794)按照附帶的規程進行。各標記基因的mRNA的拷貝數如表I所示。表I中，上部的數值是平均值，下部是分布範圍。此外，「其他癌症」顯示的是上消化道癌患者的結果。由該結果可知，糞便中的CKB的mRNA量像C0X-2等公知的大腸癌標記那樣，在大腸癌、以及大腸進行性腺瘤的大腸腫瘤患者群中，顯著多於健康正常人群。即，由這些結果可知，通過設定適當的閾值，以糞便中的CKB基因來源RNA量作為指標，能夠檢測大腸腫瘤。特別是，與C0X-2等相比，CKB的mRNA量在大腸進行性腺瘤患者群中的拷貝數更加顯著地多於健康正常人群，因此可以說能夠更高靈敏度地檢測大腸進行性腺瘤。
權利要求
1.一種大腸腫瘤的檢測方法，其是使用標記基因檢測大腸腫瘤的方法，該方法包括 (A)提取從受驗者採集的糞便中所含的RNA的步驟、 (B)測定所述步驟㈧中得到的RNA中標記基因來源RNA的量的步驟、以及 (C)對所述步驟(B)中測定的標記基因來源RNA的量、和按標記基因的種類預先設定的閾值進行比較的步驟； 其中，所述標記基因是CKB (肌酸激酶B)基因。
2.權利要求I所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用選自C0X-2 (環加氯酶-2)基因、MMP_7(基質金屬蛋白酶-7)基因、Snail基因、MMP-I (基質金屬蛋白酶-I)基因以及Β2Μ(β2微球蛋白)基因中的I種以上的基因。
3.權利要求I所述的大腸腫瘤的檢測方法，作為所述標記基因，還使用C0X-2基因。
4.權利要求3所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用選自ΜΜΡ-7基因、Snail基因、MMP-I基因、以及Β2Μ基因中的I種以上的基因。
5.權利要求I所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，作為所述標記基因，還使用ΜΜΡ-7基因。
6.權利要求:Γ5中任一項所述的大腸腫瘤的檢測方法，其檢測大腸腺瘤或大腸早期癌。
7.權利要求Γ5中任一項所述的大腸腫瘤的檢測方法，其中，所述受驗者有被診斷為患大腸腫瘤的經歷， 對於從所述受驗者隨時間採集的糞便，分別進行所述步驟(Α廣(C)，用於監測該受驗者復發大腸腫瘤的可能性。
8.一種大腸腫瘤的基因標記，其由CKB(肌酸激酶B)基因構成。
9.用於用糞便檢測大腸腫瘤的試劑盒，其包含 用於提取糞便中所含的RNA的器械或試劑、以及 用於檢測CKB (肌酸激酶B)基因來源RNA的探針或引物中的至少一個。
全文摘要
本發明的課題是提供以糞便中所含的成分作為指標，檢測大腸腫瘤、特別是進行性腺瘤、早期癌的方法。一種大腸腫瘤的檢測方法，其是使用標記基因檢測大腸腫瘤的方法，其包括(A)提取從受驗者採集的糞便中所含的RNA的步驟、(B)測定所述步驟(A)中得到的RNA中的標記基因來源RNA的量的步驟、以及(C)對所述步驟(B)中測定的標記基因來源RNA的量、和按標記基因的種類預先設定的閾值進行比較的步驟；其中，所述標記基因是CKB(肌酸激酶B)基因。
文檔編號C12Q1/68GK102947468SQ20118002906
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月3日 優先權日2010年6月16日
發明者金岡繁, 吉田賢一, 濱屋寧 申請人:國立大學法人浜松醫科大學