鑑別多態性B肝病毒和kras致癌基因突變及其臨床應用的製作方法

2023-06-13 19:41:11

專利名稱：鑑別多態性B肝病毒和kras致癌基因突變及其臨床應用的製作方法
技術領域：
本申請涉及人B肝病毒的突變，人類KRas致癌基因(oncogene)的突 變以及基因突變的檢測和定量的方法。本申請還涉及用於治療監測、疾病早期檢測和/或風險評估篩選以及用於預後的方法和檢測試劑盒。背景B肝病毒(HBV)的慢性感染是全球的主要健康負擔之一。如果沒有進行有效的幹預，多達四分之一的慢性感染者在幾十年的反覆肝損傷後會發展為肝硬化，這些患者的一部分會發生肝癌(Liaw，Y. F.和C.M· Chu，B肝病毒感染。Lancet, 2009, 373 (9663):第582-592 頁；Liang, T. J.，B肝病毒和疾病，Hepatology, 2009,49 (5 增刊):第 S13-21頁；通過參照併入本文)。大量證據特別體現在「高病毒載量和相關的肝臟疾病風險評估」(REVEAL)研究已經表明，活躍的病毒複製，表現為血清HBV DNA水平>每毫升IO4個拷貝，在疾病進展為肝硬化和肝癌中起著至關重要的作用(Chen，C. J.等人，肝癌風險在血清B肝病毒DNA水平梯度的分布。JAMA，2006年295 (I):第65-73頁；Iloe je，U. H.，等人，血液B肝病毒載量的水平預測肝硬化風險。Gastroenterology, 2006年130 (3) :678-86頁；通過參照併入本文)。因此，目前的治療目標是集中在抑制病毒複製(Liaw，Y. F.等人，拉米夫定治療中YMDD變異後出現的急性發作和B肝病毒清除。肝臟病雜誌H印atology，1999年30 (2):第567-72頁，通過參照併入本文)。因為在肝臟中複製的病毒顆粒被直接釋放到血液中，所以檢測療效的途徑是檢測血液中的病毒DNA的量。在美國，已批准五個口服的抗HBV藥物作為慢性B肝的單用或聯合療法。他們是屬於核苷類似物的拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋，以及作為核苷酸類似物的阿德福韋和替諾福韋。與幹擾素治療相比，這些核苷(酸)類似物(NAs)使用方便，能有效地抑制病毒複製，並有很好的耐受性。利用NAs抑制病毒複製伴隨有丙氨酸轉氨酶水平轉向正常，肝纖維化/肝硬化的逆轉所顯示的組織學改善以及HCC發病率的降低(Liaw，Y. F.等人，拉米夫定治療慢性B肝和晚期肝癌。新英格蘭醫學雜誌N Engl J Med，2004年，351 (15):第1521-1531頁，通過參照併入本文)。另一方面，由於病毒基因組被穩定地維持於被感染的肝細胞中並且病毒基因組不被NAs直接靶向，所以多數患者需要長期治療(Moraleda，G.，等人，在不分裂的肝細胞培養中缺乏對土撥鼠肝炎病毒閉合環狀DNA的抗病毒治療效果。病毒學雜誌J Virol，1997年71 (12):第9392-9頁，通過參照併入本文)。然而，長期治療在不同程度上與耐藥病毒突變體的選擇/產生有關，如果不及時啟動救援治療，其會導致急性發作或肝功能失代償(Liaw，Y. F.，等人。拉米夫定治療中YMDD變異後出現的急性發作和B肝病毒清除。肝臟病雜誌Hepatology, 1999年30 (2):第567-72頁；Lok, A. S.等人。患者中，拉米夫定治療慢性B肝的長期安全性。胃腸病學Gastroenterology, 2003年125(6)第1714-1722頁，通過參照併入本文)。因此，早期檢測或預測耐藥性在慢性B肝的管理中非常重要，特別是在高風險的患者，如肝硬化患者中。綜上所述，有效的治療監測需要(I)測量血液中的病毒DNA的量，和(2)早期檢測潛在的耐藥突變體病毒。在臨床上，測定病毒DNA的量是通過使用TaqMan實時PCR方法進行的，但它不能同時檢測突變，而突變目前是使用DNA測序或者線性探針雜交測定方法(LIPA)進行檢測的，但DNA測序或者線性探針雜交測定方法(LIPA)都不能測量病毒DNA的量。針對拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋的耐藥性，都涉及在病毒逆轉錄酶基因的密碼子204(rt204)的突變，其中，該密碼子編碼所謂的「YMDD基序」中的蛋氨酸(M)。基於實時PCR的檢測方法可以同時測量WT病毒DNA的量和突變病毒DNA的量，以便以低成本早期檢 測耐藥性。這樣的測定法在過去的幾年已有報導(Chieochansin,T.,等人。用PCR為基礎的方法快速檢測拉米夫定耐藥的B肝病毒基因突變。Tohoku J Exp Med，2006年。210(1)第67-78頁；Yoshida, S.等人。用變體類型特異性的TaqMan小溝粘結劑探針從慢性B肝患者定量檢測B肝病毒拉米夫定耐藥突突變。Ann Clin Biochem，2008年45 (I) 59-64 ；Shih, Y. H.等人。用實時定量PCR和退火曲線分析在一個反應中定量B肝病毒並檢測YMDD突變。抗病毒療法雜誌Antivir Ther, 2008,13 (4):第469-80頁，全部引作參考)。然而這些測定法都不能可靠地檢測rt204突變。這是因為病毒的基因組在不同患者之間顯示出高水平的多態性(變化性)；長度為15-20個核苷酸的常規探針有可能遇到多態性，這導致定量和熔解曲線分析的錯誤結果。KRas致癌基因編碼KRas致癌蛋白，其在促進細胞生長中發揮重要作用。KRas蛋白活性被嚴格控制，在特定的時間「打開」和「關閉」。如果KRas蛋白一直被「打開」，則細胞生長就會失去控制，從而引起腫瘤。KRas基因密碼子12和密碼子13的突變可以導致KRas蛋白的組成型(constitutive)激活，即，KRas蛋白現在被鎖定在「持續打開」的狀態(Yamamoto, F. and M. Perucho,人 c-K-ras 致癌基因的激活，核酸研究雜誌 Nucleic AcidsRes，1984年，12 (23):第8873-85頁，通過參照併入本文)。KRas基因密碼子12/13突變已經被認為至少是人類癌症的致病因素之一，經常在胰腺癌、結直腸癌(CRC)和其他一些癌症中被檢測到(Bos，JL，ras致癌癌基因與人類癌症綜述。癌症研究Cancer Res，1989年。49(17):第4682-9頁，通過參照併入本文)。腫瘤細胞死亡時，腫瘤細胞內的突變的KRas DNA可以被釋放到血液循環中。因此，從血液循環檢測到KRas突變有助於癌症的早期檢測。監測癌症外科切除手術前後的KRas突變基因的量也將有助於發現是否有隱藏的腫瘤或腫瘤復發(Diehl，F.，等人，血液循環中的突變DNA評估腫瘤的動態。Nat Med, 2008,14 (9):第985-90頁，列為參考文獻)。為此必須以很高靈敏度定量KRas基因突變。結直腸癌(CRC)是美國第二常見的癌症，也是癌症死亡的第二大原因。約40-50%的CRC組織可以檢測到KRas密碼子12和13的突變，這些突變是腫瘤惡化和對某些化療無響應的原因。目前常規地檢測腫瘤組織中的KRas突變情況用來指導選擇合適的化療。這些方法包括DNA測序、實時PCR和高解析度熔解分析。這些現有的方法需要突變體的量超過「總IRas基因的5%。此外，這些方法是定性的(陽性或陰性)，而不是定量的。因此這些方法不能用於早期檢測或手術後的監測。此外，目前使用的實時PCR檢測KRas密碼子12和13突變使用7個探針在7個獨立的反應中檢測7個最常見的突變。較不常見的基因突變可能是檢測不到的。聚合酶鏈反應(PCR)仍然是最常用的突變檢測方法，因為它可以擴增和檢測微量的靶DNA。在最佳條件下，在沒有未突變的野生型(WT)DNA存在的情況下，可以檢測到最少10個拷貝的突變體。然而，在不使用額外技術前提下，當WT DNA的量超過突變DNA 20倍時，將無法檢測到突變DNA。在血液中，由於正常細胞(如白血細胞)在不斷的死亡和再生，對於任何特定的基因，WTDNA的量可以超過突變DNA的量100倍以上。因此，從血液(或其他體液如尿液)檢測腫瘤衍生的突變DNA在技術上是很具有挑戰性的。在本發明中，開發出一種能抑制WT KRas DNA擴增的寡核苷酸，由此提高突變體的·相對比例和提高突變檢測的靈敏度。該WT抑制性寡核苷酸，或WT PCR阻斷劑，含有修飾的核苷酸如鎖定核酸(LNA)。LNA是一種核苷酸類似物，對互補的鹼基有高特異性和親和性(Singh, S. K.,等人,LNA (鎖定核酸)合成和高親和力的核酸識別。Chem Commun, 1998年，1998(4):第 455-456 頁；Hertoghs,K. M. , J.H.Ellis 和 I. R. Catchpole，利用鎖定核酸寡核苷酸增加質粒DNA新功能。核酸研究雜誌Nucleic Acids Res，2003，31 (20):第5817-30頁，通過參照併入本文)。含LNA的寡核苷酸已經被用於通過抑制WT非突變DNA的擴增以提高突變的檢測靈敏度性(Nagai，Y.，等人，使用含肽核酸(PNA) PCR鉗的快速和敏感的檢測系統發現非小細胞肺癌細胞的表皮生長因子受體的遺傳異質性。癌症研究Cancer Res,2005年。65(16):第7276-82頁；Laughlin, T. S.，等人，急性髓細胞性白血病的核磷蛋白基因突變的快速檢測方法。J Mol Diagn，2008年。10(4):第338-45頁，通過參照併入本文)。然而，這樣的報告是罕見的，因為通常是難以開發含LNA的寡核苷酸來有效地抑制野生型DNA的擴增，同時又不影響突變DNA的擴增。

發明內容
由於不同患者之間病毒基因組顯示出高水平的多態性(變化)，常規的長度15-20個核苷酸的探針很可能會遇到多態性，導致定量和熔解曲線分析二者的錯誤結果。因此有必要設計儘可能短的探針。此外，rt204密碼至少有5個變種，其包括ATG(WT)、ATT、ATC、ATA和GTG。上述提到的檢驗不能被設計用於鑑別ATA和ATC變種。在本發明中，重新設計測試以採用更短的探針。從而首次使用基於實時PCR的測試方法能夠可靠地檢測到HBV密碼子rt204的所有5個變種，包括ATA、ATC。其結果是，這種改進的實時PCR測試現在適合在臨床中使用。本發明提出了一種新的B肝病毒DNA定量檢測和耐藥性突變病毒檢測的單管測試方法，用於接受核苷/核苷類似物長期治療的患者。該測試是採用引物_探針部分重疊方案開發的，使得探針的有效長度是只有幾個核苷酸，從而使檢測不容易發生由HBV基因組多態性引起的錯誤。採用該測試實現了 HBV突變的可靠檢測以及對治療進行成本有效的監測。本發明人已經發現，通過保持探針儘可能的短，多態性檢測被最小化，同時允許有效地檢測編碼rt204密碼子其許多變體的突變，例如ATG (WT)、ATT、ATC、ATA和GTG。此外，本發明還提出兩個高度敏感的檢測平臺用於檢測KRas密碼子12/13的突變。其一是一種基於PCR的定性的突變檢測系統，例如通過DNA測序，另一種是定量的突變檢測系統，例如兩步實時PCR。這兩種方法都需要使用野生型的PCR阻斷劑，可以有效地抑制WT KRas DNA的擴增但不影響KRas突變體的擴增。本發明提出了一種WT PCR阻斷劑，其能夠在野生型KRas DNA 10，000倍過量的情況下對KRas基因的突變體進行定量檢測，本發明還提出設計適用於其他基因突變檢測的這類WT PCR阻斷劑的通用設計原則。本發明還包括一種合理設計的PCR探針(KRas探針I號)，該探針實現可靠地鑑別密碼子12/13的許多變種。其他探針正在開發之中，這些探針可與探針I號一起用於一個反應中，或者各自用於單獨的反應之中。


圖I :短探針設計。 圖2 :引物-探針部分重疊簡化熔解模式。圖3 :在單個測試中定量DNA並鑑別突變。圖4 :用單個實驗監測接受拉米夫定治療的患者。圖5 :使用WT PCR阻斷劑和差異變性抑制WT DNA的擴增。圖6 =KRas密碼子12/13實時PCR以及在臨床樣品中的應用。
具體實施例方式參照圖1，這裡示出的探針覆蓋發生目標突變的DNA序列區域。該探針可以是任何形式的實時PCR探針，如SimpleProbe,分子信標或TaqMan探針。在感應探針(sensorprobe)與引物A重疊時，也可以使用雜交探針(或FRET探針)，但需要確保錨定探針不會受到潛在的核苷酸變異的影響。該探針與目標野生型(WT)或其互補鏈具有超過70%的序列同一性。在探針中設計錯配或複數個錯配，以在突變體和WT之間以及在不同的突變體之間形成更佳的區分。在某些實施例中，如果能夠實現在WT和突變體之間以及在不同的突變體之間足夠的區分，則探針序列可以與野生型序列相同。仍參照圖1，更詳細地描述PCR擴增引物之一與探針部分重疊，並且和探針具有相同的方向。為便於描述，此引物被指定為引物A( 「第一引物」)，另一個擴增引物被指定為引物B( 「第二引物」)。引物A不覆蓋突變位點，因而在擴增過程中以及在擴增之後(通過熔解曲線分析)，可以由探針檢測到突變。引物A可以長達50個核苷酸並可以含有簡併核苷酸。然而，這樣的簡併核苷酸不能與探針重疊。參照圖1B，更詳細地描述可以採用兩步PCR，其中，在第一步PCR中在不存在探針的情況下，使用與探針部分重疊的引物A序列。在第二步實時PCR反應中，在存在探針的情況下，使用於引物A重疊但不與探針重疊的引物C( 「第三引物」)，以便獲得更佳的PCR信號。在一些實施例中，引物B也可以是「第四引物」。兩步PCR允許採用TaqMan探針進行定量。現在參照圖1C，實時PCR中可以使用長度5-10個核苷酸的短探針，探針和引物重疊或不重疊。然而，因為該探針太短不能產生擴增信號，所以擴增必須依賴於DNA結合染料，如SYBR Green0因此，PCR擴增採用對稱濃度或不對稱濃度的引物C和引物B。SYBRGreen信號用於記錄擴增。探針(可以是任何形式的探針)用於熔解曲線分析。但是，探針的螢光通道必須不同於SYBR Green的信號。正因為如此，SimpleProbe或用6-FAM或綠螢光素標記的探針不能與SYBR Green合用。參照圖2，PCR擴增使用引物A(與引物B)將消除任何對探針的潛在的多態影響。因此，探針的有效長度，就是響應突變/錯配的探針部分，也就是不與引物A重疊的部分。與引物A重疊的探針部分是用來增加探針的熔解溫度，以便將具有足夠高熔點/退火溫度的探針用於定量。因此，短探針涉及(最有效地通過引物_探針部分重疊)，簡化了熔解曲線模式(pattern)，使得測試結果更可讀和更可靠。圖2B顯示序列模式被簡化的一個例子。從GenBank通過BLAST檢索到8983個HBV序列。與有效探針長度相對應的序列模式根據它們在GenBank的頻率被排列出來。前5個模式是WT (204位密碼子ATG)、GTG、ATT、ATC和ATA，他們的總和已超過所有HBV序列的99%。因此很明顯，縮短的有效的探針長度(5核苷酸長)使得有可能正確地鑑別GenBank中99%以上的HBV序列。 野生型HBV編碼聚合酶(逆轉錄酶)的序列具有高度多態性。示例性的序列包括GenBank 序列條目AB55402、JF439940、⑶456642 和 HM358328。下面列出了示例性 HBV 引物序列
HBV 引物 A5'-ttcccccactgtttggctttcagttat-3'
HBV 引物 B5'-atgacgtcacagacttggcccccaatac-3'
HBV 探針 I5'-[6FAM] -tggctttcagttaTGTTGa [BHQI]
HBV 探針 2CY5-tcagttataTAGa-IowaBlack
HBV 探針 3 HEX-ttggctttcagttatatcga-BBQ大寫字母表不LNA核苷酸。可以採用對稱濃度或不對稱濃度的引物A和引物B進行PCR。在不對稱PCR中，弓丨物A的濃度是引物B濃度的2-100分之一，但典型的是5-10分之一。引物A的濃度是至少
0.01微摩爾，但典型地使用0. I微摩爾。過量引物B的使用允許生產過量可以被探針結合的單鏈DNA，從而增強擴增曲線(圖3)中的探針信號。這也允許擴增後熔解曲線分析(圖3)。參照圖4，使用本發明的單一 PCR檢測對兩例接受拉米夫定治療的慢性B肝患者進行回顧性「監控」。如圖4所示，這兩個病人最初表達野生型密碼子rt204( 「ATG」)，但隨著治療時間的推移，rt204突變成耐藥型，例如，(「ATT」)和(「GTG」)。使用單個測試可以有效地確定病毒效價和變異的病毒。現在參照圖5，這裡示出的WT PCR阻斷劑跨越了這樣一個DNA序列區域，在該區域發生目的突變。在突變位點，WT PCR阻斷劑與WT KRas序列或WT KRas序列的互補鏈具有完美的匹配，並且由於突變的存在與突變DNA序列具有一個或複數個錯配。PCR阻斷劑具有多達50個核苷酸，並且包含至少一個鎖定核苷酸(LNA)。WT PCR阻斷劑在3,-末端被磷酸化，從而它不會作為引物發揮功能。示例性KRas的cDNA序列可以在GenBank登記為NM_004985中找到。KRas基因組DNA序列可以在GenBank登記為NT_009714. 17中找到。示例性引物序列，包括
KRas 野生 PCR 阻斷劑 5i-gcctacgCcaCCagctc-PH KRas 引物 A5'-gtcaaggcactcttgcctacg-3'
KRas 引物 B5'-ggacgtccgtcacattttcattatttttattataaggc-3'
KRas 引物 A25 '-tcaaggcactcttgcctacg-3'
KRas 基因探針 I 號[6FAM] tgcctacgtcattagctccaac [BHQI]大寫字母表不LNA核苷酸。 「-PH」代表3'-末端的磷酸化。仍參照本發明的圖5進一步細節描述，PCR擴增引物中的一個與WT PCR阻斷劑部分重疊，並且是與PCR阻斷劑在相同的方向上。為便於描述，該引物被指定為引物A。另一個擴增用引物被指定為引物B。本發明中的引物A不包括突變位點，因而允許突變被擴增並通過例如DNA測序或實時PCR的下遊應用被檢測出來。引物A可以具有長達50個核苷酸，其與靶序列具有80%以上的序列同一性。引物A和WT PCR阻斷劑之間至少重疊一個核苷酸。引物A和引物B可以含有或可以不含有LNA核苷酸。在熱循環中，由於LNA核苷酸的存在，PCR阻斷劑能夠緊密結合到野生型序列，但是由於錯配(複數個錯配)，因而與突變序列結合較弱。這導致野生型KRas DNA的PCR擴增的抑制，但允許突變KRas DNA的擴增。仍參照本發明的圖5進一步詳細描述，PCR可以被編程為在95°C下變性DNA模板(通常是基因組DNA)少於10個循環，隨後在較低的變性溫度繼續擴增，從而僅僅變性從引物A和引物B獲得的擴增產物。這顯著減少了 WT反義鏈的合成(WT反義鏈的合成不會被WT PCR阻斷劑抑制)，從而引起野生型DNA擴增的更強抑制。檢測KRas突變的超靈敏野生型抑制性直接DNA測序方法包括野生型抑制性PCR(Wi-PCR)和隨後的DNA測序。Wi-PCR通過將WT PCR阻斷劑添加到另外的常規PCR反應中被執行，其中常規PCR反應包含擴增引物(引物A和引物B)、DNA聚合酶、聚合酶緩衝液、dNTP和DNA模板。引物A和引物B的濃度可以是在0. I至IiiM的範圍內。Wi-寡核苷酸的濃度可在0. 2至50 ii M的範圍內。Wi-PCR進行25-55個循環，直到產生足夠量的DNA。將PCR產物純化以除去游離的引物，然後用引物B進行DNA測序。為了和常規的直接DNA測序相區別，我們將它命名為Wi-直接DNA測序用於表示野生型抑制直接DNA測序。除了直接測序以外，Wi-PCR後可以跟隨任何其他的突變檢測方法。這些方法可以是定性的或定量的，並且起初的Wi-PCR可以顯著增加它們的突變檢測靈敏度。這些方法可以包括但並不限於固相雜交(例如，Southern印跡法和斑點雜交)、液相雜交(如熔解曲線分析)、反向雜交(標記的PCR產物與固定化的寡核苷酸雜交)、質譜和實時PCR。超靈敏定量KRas突變檢測系統包括Wi-PCR和隨後的使用螢光標記的寡核苷酸探針的實時PCR。該實時PCR可以是但不僅限於使用水解探針的TaqMan PCR、FRET PCR、SimpleProbe PCR、蠍型探針 PCR (Scorpion probe PCR)或分子信標實時 PCR。Wi-PCR 進行10-20個循環，隨後是30-40個循環的實時PCR。這被稱為Wi-定量PCR或Wi-qPCR。
KRas密碼子12/13突變的「TaqMan」水解探針被開發用於在非水解非對稱實時PCR0探針被設計成使得它可以在熔解曲線分析中區分11種已知的變體(包括野生型KRas序列) 。本發明提供一種用於評估利用抗B肝病毒(HBV)藥物治療受試者的療法的方法，其中所述受試者具有或可能具有JffiV感染,該方法包括(a)提供來自所述受試者的核酸樣品；(b)確定在編碼鏈或非編碼鏈上，逆轉錄酶基因開放閱讀框204位的密碼子的序列；和(c)評估受試者是否應該接受利用所述HBV藥物的治療。在一些實施例中，所述方法進一步包括鑑別具有HBV感染的受試者。抗HBV藥物可以是核苷類似物或核苷酸類似物。核苷類似物可以是拉米夫定、替比夫定或恩替卡韋。核苷酸類似物可以是阿德福韋或替諾福韋。本發明還提供了一種鑑別受試者中HBV逆轉錄酶rt204突變的方法(a)提供來自所述受試者的核酸樣品；(b)使所述核酸與第一引物和第二引物以及一個或者更多個可檢測標記的探針接觸以形成混合物，其中，第一引物與rt204密碼子編碼序列近端的核苷酸序列雜交，所述第二引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交，所述可檢測標記的探針與rt204密碼子突變體的編碼序列雜交；和(c)擴增所述核酸。該方法可以進一步包括分析所擴增核酸的熔解曲線。在一些實施例中，可檢測標記的探針與rt204密碼子突變體的編碼序列雜交或與該編碼序列的互補鏈雜交，並且該可檢測標記的探針與被第一引物識別的序列的一部分雜交。每個可檢測標記的探針包含不同的標記。該標記可以是6FAM、Cy5或HEX。在一個或更多個可檢測標記的探針中，編碼rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。在一些實施例中，可檢測標記的探針的長度小於約10個核苷酸。本發明還提供了一種鑑別受試者HBV逆轉錄酶rt204突變的方法，該方法包括(a)提供來自受試者核酸樣品；(b)使所述核酸與第一引物和第二引物接觸以形成混合物，其中，第一引物與rt204密碼子編碼序列近端的核苷酸序列雜交，第二引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交；(c)擴增該核酸；(d)使擴增的核酸與第三引物和第四引物以及一個或者更多個可檢測標記的探針接觸，其中，第三引物與rt204密碼子編碼序列近端的序列雜交，第四引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交，可檢測標記的探針與rt204密碼子突變體的編碼序列雜交，其中，rt204密碼子編碼序列不包括被所述第三引物識別的序列；和(e)進一步擴增該核酸。第二引物以及第四引物的序列可以是相同。該方法可以進一步包括分析所擴增核酸的熔解曲線。在一些實施例中，可檢測標記的探針與所述rt204密碼子突變體的編碼序列雜交，並且所述可檢測標記的探針與被所述第一引物識別的序列的一部分雜交。每個可檢測標記的探針可以包括不同的標記。該標記可以是6FAM、Cy5或HEX。該一個或更多個可檢測標記的探針中，編碼rt204核苷酸序列包括ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。在一些實施例中，可檢測標記的探針是小於約10個核苷酸。在一些實施例中，從混合物中分離步驟(c)所擴增的核酸。核酸樣品可以來自生物流體或組織樣本。還提供了一種用於評估利用抗癌藥物治療受試者的療法的方法，該方法包括(a)獲得來自受試者的核酸樣品；(b)確定KRAS原癌基因開放閱讀框在12或13位密碼子的序列；和(C)評估受試者是否可以接受該抗癌藥物的治療。該方法還可以包括鑑別具有突變的KRAS原癌基因的受試者，所述受試者具有或者可能具有癌症。該核酸可以來自生物流體樣品或活檢樣本。該抗腫瘤藥物可以是西妥昔單抗或帕尼單抗。癌症可以是任何在12或13位包含KRAS突變的癌症，例如，結直腸癌、胰腺癌、肺癌或卵巢癌。還提供了一種鑑別受試者KRAS原癌基因中突變的方法，該方法包括(a)提供來自受試者的核酸樣品；(b)使核酸與第一引物和第二引物以及野生型PCR阻斷寡核苷酸接觸以形成混合物，其中，第一引物與密碼子12或13編碼序列近端的核苷酸序列雜交，第二引物與密碼子12或13編碼序列遠端的核苷酸序列雜交；該野生型PCR阻斷寡核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交或與密碼子12或13的編碼序列的互補序列雜交；以及(c)擴增該核酸。該野生型PCR阻斷寡核苷酸可以包含一個或更多個鎖定核酸(LNA)。該野生型PCR阻斷寡核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交，並且所述野生型PCR阻斷寡核苷酸與被第一引物識別序列的一部分雜交。該混合物可以進一步包括一個或更多個可檢測標記的核苷酸探針，其中，所述核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交或與密碼子12或13的編碼序列的互補序列雜交。還提供了一種臨床管理具有癌症的受試者的方法，該方法包括(a)獲得來自受試者的核酸樣品；(b)確定KRAS原癌基因開放閱讀框在12或13位密碼子的序列；及(c)評估該癌症是否已經復發。·在一些實施例中，WT PCR阻斷劑與引物A部分重疊，該引物與WT PCR阻斷劑具有相同的方向。WT PCR阻斷劑可以與WT DNA[Tm(阻斷劑/WT)]具有高於70°C但低於90°C的熔解溫度(Tm)。在一些實施例中，WT PCR阻斷劑的Tm(阻斷劑/WT)比它與突變DNA的熔解溫度[Tm(阻斷劑/突變體)]高至少4°C。在一些實施例中，引物A的熔解溫度比Tm(阻斷劑/WT)低，但等於或略微高於或低於Tm(阻斷劑/突變體)。在一些實施例中，引物A和引物B的擴增產物在PCR反應的第一步中被選擇性地變性，以增強抑制野生型DNA擴增。示例示例I :HBV rt204密碼子的定量PCR。探針與擴增引物A和擴增引物B分別為5'
-[6FAM]-tggctttcagttaTGTTGa-[BHQ I],5' -ttcccccactgtttggctttcagttat-31 和5'-atgacgtcacagacttggcccccaatac-3'。大寫字母表不鎖定核酸。使用基因分型母液(Roche公司)、0.1111引物麼、0.5111引物8、0.1111的探針以及模板0嫩進行？0 。加熱程序是950C 10分鐘以激活聚合酶，隨後進行40個循環的95°C 10秒、55°C 10秒並記錄螢光信號(fluorescene requisition)和72。。I秒。擴增後即刻,在從40°C線性溫度升高至75°C的過程中，進行熔解曲線分析。以定量為目的，包括系列稀釋攜帶rt204(ATG)的質粒，以便產生濃度標準曲線。為了區分樣品中是何種rt204變體，實驗還包括攜帶不同變體的質粒以便產生標準的熔解曲線。示例2 :HBV rt204密碼子的定量PCR。擴增引物A和擴增引物B分別為5'-ttcccccactgtttggctttcagttat-3 '和 5 ' -atgacgtcacagacttggcccccaatac-3 '。單個反應中使用三個探針以增強區別五個變種的能力，它們是探針I號(5' -[6FAM]-tggctttcagttaTGTTGa-[BHQl]),探針 2 號(Cy5-tcagttataTAGa-IowaBlack)和探針 3 號(HEX-ttggctttcagttatatcga-BBQ)。大寫字母表示鎖定核酸。使用基因分型母液(Roche公司)、0.111|1引物4、0.511|1引物8、每個探針0.111|1和模板0嫩進行？0 。加熱程序是950C 10分鐘以激活聚合酶，隨後進行40個循環的95°C 10秒、50°C 10秒並記錄螢光信號和72C°C1秒。擴增後即刻，在從20°C線性溫度升高至75°C的過程中，進行熔解曲線分析。為了患者樣品的定量，用從正常人血清中純化的DNA系列稀釋攜帶rt204(ATG)的質粒，並用於PCR以產生濃度標準曲線。為了區分樣品中是何種rt204變體，實驗包括攜帶不同變體的質粒以產生熔解標準。
示例3 =KRas基因密碼子12或13位突變的WT-抑制性PCR檢測。WT PCR阻斷劑，擴增引物A和擴增引物B的序列分別是5 ' -gcctacgCcaCCagctc-PH,5 ' -gtcaaggcactcttgcctacg-3 ' 和 5 ' -ggacgtccgtcacattttcattatttttattataaggc-3/。大寫字母表示LNA核苷酸。「-PH」代表3'-末端磷酸化。使用在適當的PCR緩衝液中的熱啟動Taq DNA聚合酶，200 y M的dNTP，每個擴增引物0. 5 y M，2 y M的WT PCR阻斷齊IJ，和模板DNA進行Wi-PCR。加熱程序是95°C 2-10分鐘以激活聚合酶，然後是20個循環的(用於下遊qPCR)或45個循環(用於DNA測序)的95°C 10秒、76°C 20秒、60°C下10秒和65°C 10秒。加熱程序也可以是2個循環的95°C 10秒、60°C 10秒和68°C 10秒，然後是18個循環的84°C 10秒、60°C 10秒和68°C 10秒。示例4 =KRas基因密碼子12或13位突變的WT-抑制性定量PCR檢測。用水或Tris/EDTA緩衝液對上述20個循環的Wi-PCR反應進行I比32倍稀釋。取I微升稀釋的PCR加入PCR反應，該PCR反應包含基因型母液(Roche)、5mM的氯化鎂、
0.I u M 的正向引物(5 ' -tcaaggcactcttgcctacg-3 ' )、0. 5 U M 反向引物(5 ' -ggacgtccgtcacattttcattatttttattataaggc-3),和 O.lyM KRas 探針 I 號(5 1 - [6FAM] tgcctacgtcattagctccaac[BHQ1])。擴增進行 30 個循環的 84°C 10 秒、57°C 10 秒、68°C 10秒和50°C 15秒，使用螢光檢測。擴增後即刻，在25-75°C的溫度範圍內，進行熔解曲線分析。為了可以定量突變體的量，系列稀釋的攜帶突變(12D變體)的質粒被包括在Wi-PCR中，並在實時PCR中進一步擴增。為了進行熔解曲線分析，攜帶不同KRas序列的質粒出於比較目的被包括在實驗中。在某些情況下，當野生型DNA不能被完全抑制時，熔解曲線將顯示兩個峰混合，一個代表突變體，另一個代表野生型DNA。突變DNA的量可以基於兩峰的相對高度來估計。應當指出，額外的探針可以被加入到同一個反應或在分開的反應中以提高不同KRas密碼子12或13位變體之間的區分，特別是在12D和12S之間以及12C和12V之間。示例5 :通過SYBR Green實時PCR的KRas 12或13突變的定量。如在示例3中所描述的，進行PCR反應，添加SYBR Green染料，50個循環。為了能夠定量突變體的量，系列稀釋攜帶突變(12D變體)的質粒被包括在PCR中。然後選擇陽性擴增的樣品，用H2O或Tris/EDTA緩衝液I : 32稀釋，進行實例4中描述的WT抑制定量PCR以進行熔解曲線分析。攜帶不同的KRas序列的質粒被包括作為熔解曲線的標準。本發明的優點包括但不限於，增加功能而無需額外成本(除病毒負荷測定外，半定量HBV藥物抗性突變體)，並因為縮短探針的有效長度而增加準確性。在廣泛的實施例中，本發明可以應用到其它HBV藥物抗性突變體和其他一般的基因突變的檢測。在不對稱PCR中，使用無5' -3'外切功能的Taq聚合酶和TaqMan探針允許低成本的多重熔解曲線分析。在本發明的優點還包括但不限於KRas突變的檢測和定量具有異常高的靈敏度。在廣泛的實施例中，本發明可以應用到其他的基因突變的超高靈敏度檢測。儘管前面的說明書能夠使得本領域技術人員可以製造和利用目前被認為的本發明最佳實施方式，但本領域技術人員能夠理解和接受存在本文所提出具體實施例、方法和示例的變型、組合以及等同。因此，本發明不應該局限於上面所述的實施例、方法和示例，而是要求保護在本發明範圍和主旨內的所有實施例和方法。
權利要求
1.一種用於評估利用抗B肝病毒(HBV)藥物治療受試者的療法的方法，其中所述受試者具有或可能具有HBV感染，所述方法包括 (a)提供來自所述受試者的核酸樣品； (b)確定在編碼鏈或非編碼鏈上逆轉錄酶基因開放閱讀框204位的密碼子的序列；和 (c)評估受試者是否應該接受利用所述HBV藥物的治療。
2.權利要求I的方法，其進一步包括鑑別具有HBV感染的受試者。
3.權利要求I或2的方法，其中，所述抗-HBV藥物是核苷類似物或核苷酸類似物。
4.權利要求3的方法，其中，所述核苷類似物是拉米夫定、替比夫定或恩替卡韋。
5.權利要求3的方法，其中，所述核苷酸類似物是阿德福韋或替諾福韋。
6.一種鑑別受試者中HBV逆轉錄酶rt 204突變的方法，所述方法包括 (a)提供來自所述受試者的核酸樣品； (b)使所述核酸與第一引物和第二引物以及一個或者更多個可檢測標記的探針接觸以形成混合物，其中，所述第一引物與rt204密碼子編碼序列近端的核苷酸序列雜交，所述第二引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交，所述可檢測標記的探針與rt204密碼子突變體的編碼序列雜交；和 (c)擴增所述核酸。
7.權利要求6的方法，其進一步包括分析所擴增核酸的熔解曲線。
8.權利要求6或7的方法，其中，所述可檢測標記的探針與所述rt204密碼子突變體的編碼序列雜交或與該編碼序列的互補鏈雜交，並且所述可檢測標記的探針與被所述第一引物識別的序列的一部分雜交。
9.權利要求6-8任一項的方法，其中，每個可檢測標記的探針包含不同的標記。
10.權利要求6-9任一項的方法，其中，所述標記是6FAM、Cy5或HEX。
11.權利要求6-10任一項的方法，其中，在所述一個或更多個可檢測標記的探針中，編碼rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。
12.權利要求6或7和9-11任一項的方法，其中，所述可檢測標記的探針的長度小於約10個核苷酸。
13.一種鑑別受試者HBV逆轉錄酶rt204突變的方法，所述方法包括 (a)提供來自所述受試者的核酸樣品； (b)使所述核酸與第一引物和第二引物接觸以形成混合物，其中，所述第一引物與rt204密碼子編碼序列近端的核苷酸序列雜交，所述第二引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交； (c)擴增所述核酸； (d)使擴增的核酸與第三引物和第四引物以及一個或者更多個可檢測標記的探針接觸以形成混合物，其中，所述第三引物與rt204密碼子編碼序列近端的序列雜交，所述第四引物與rt204密碼子編碼序列遠端的核苷酸序列雜交，所述可檢測標記的探針與rt204密碼子突變體的編碼序列雜交，其中，所述rt204密碼子編碼序列不包括被所述第三引物識別的序列；和 (e)進一步擴增所述核酸。
14.權利要求13的方法，其中，所述第二引物以及第四引物的序列是相同的。
15.權利要求13或14的方法，其進一步包括分析所擴增核酸的熔解曲線。
16.權利要求13-15任一項的方法，所述可檢測標記的探針與所述rt204密碼子突變體的編碼序列雜交，並且所述可檢測標記的探針與被所述第一引物識別的序列的一部分雜交。
17.權利要求13-16任一項的方法，其中，每個可檢測標記的探針包含不同的標記。
18.權利要求13-17任一項的方法，其中，所述標記是6FAM、Cy5或HEX。
19.權利要求13-18任一項的方法，其中，在所述一個或更多個可檢測標記的探針中，編碼rt204的核苷酸序列包括序列ATG、ATT、ATC、ATA或GTG。
20.權利要求13-15或17-20任一項的方法，其中，所述可檢測標記的探針小於約10個核苷酸。
21.權利要求16的方法，其中從所述混合物中分離步驟(c)所擴增的核酸。
22.權利要求1-21任一項的方法，其中，所述核酸樣品來自生物流體或組織樣本。
23.一種用於評估利用抗癌藥物治療受試者的療法的方法，所述方法包括 (a)獲得來自所述受試者的核酸樣品； (b)確定KRAS原癌基因開放閱讀框在12或13位密碼子的序列；和 (c)評估所述受試者是否應該接受所述抗癌藥物的治療。
24.權利要求23的方法，其進一步包括鑑別具有突變的KRAS原癌基因的受試者，所述受:試者具有或者可能具有癌症。
25.權利要求23或24的方法，其中，所述核酸來自生物流體樣品或活檢樣本。
26.權利要求23-25任一項的方法，其中，所述抗癌藥物是西妥昔單抗或帕尼單抗。
27.權利要求23-26任一項的方法，其中，所述癌症包括結直腸癌、胰腺癌、肺癌或卵巢癌。
28.一種鑑別受試者KRAS原癌基因中突變的方法，所述方法包括 (a)提供來自受試者的核酸樣品； (b)使所述核酸與第一引物和第二引物以及野生型PCR阻斷寡核苷酸接觸以形成混合物，其中，所述第一引物與密碼子12或13編碼序列近端的核苷酸序列雜交，所述第二引物與密碼子12或13編碼序列遠端的核苷酸序列雜交，所述野生型PCR阻斷寡核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交或與密碼子12或13的編碼序列的互補序列雜交；和 (c)擴增所述核酸。
29.權利要求28的方法，其中，所述野生型PCR阻斷寡核苷酸包含一個或更多個鎖定核酸(LNA)。
30.權利要求28或29的方法，其中，所述野生型PCR阻斷寡核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交，並且所述野生型PCR阻斷寡核苷酸與被所述第一引物識別序列的一部分雜父。
31.權利要求28-30任一項的方法，其中，所述混合物進一步包括一個或更多個可檢測標記的核苷酸探針，其中，所述核苷酸與密碼子12或13的編碼序列雜交或與密碼子12或13的編碼序列的互補序列雜交。
32.—種臨床管理具有癌症的受試者的方法，所述方法包括 (a)獲得來自所述受試者的核酸樣品；(b)確定KRAS原癌基因開放閱讀框在12或13位密碼子的序列；和和 (c)評估所述癌症是否已經復發。
全文摘要
本發明提供了一種對慢性B肝病毒(HBV)感染患者在接受核苷類似物/核酸類似物抗病毒治療時的療效監控和耐藥危險評估的方法，這一方法在測定病毒DNA的量的同時可以鑑定耐藥的突變病毒。本發明還提供了方法和試劑用來高度敏感鑑定/定量來自體液或腫瘤組織的KRas致癌基因的突變，以及這些方法用來評估患癌症危險性、早期癌症檢測、治療結果預測和治療監測的用途。
文檔編號C12Q1/70GK102985562SQ201180024608
公開日2013年3月20日 申請日期2011年5月16日 優先權日2010年5月16日
發明者任向東, 愛力克·S·任 申請人:潤尼生命科學公司