一種新的基因晶片固相載體的製備方法
2023-06-13 08:56:16 1
專利名稱：一種新的基因晶片固相載體的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種新的基因晶片固相載體的製備方法。
本發明的目的在於開發新的基因晶片固相載體，即基因晶片的片基。
基因晶片的發展現狀生物晶片是八十年代末在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術，是繼大規模集成電路之後的又一次具有深遠意義的科學技術革命。它主要是指通過微加工技術和微電子技術在固體晶片表面構建的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。常用的生物晶片分為三大類即基因晶片、蛋白質晶片和晶片實驗室。
基因晶片是生物晶片中研究最早、應用最廣泛、最先實現商品化的晶片。
基因晶片(又稱DNA晶片)是通過微陣列技術，將高密度的DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以螢光標記的DNA探針，藉助鹼基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監測等方面研究的最新革命性技術。目前，該技術應用領域主要包括基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等諸多方面。
基因晶片產業是大有發展前景的世界高科技前沿產業。據專家預測，在未來幾年裡，世界基因晶片產業將以每年增長30％的速度發展，2005年全球基因晶片總營業額將從1998年的180億美元增長到400億美元，診斷的疾病種類可望從目前的100多種擴大到5000種，它的發展將帶來醫療技術革命，並為網際網路上遠程醫療打開新的天地。
國外情況美國繼開展人類基因組計劃以後，美國政府於1998年正式啟動基因晶片計劃，聯合私人投資機構投入20億美元以上的研究經費。美國國立衛生研究院、美國能源部、商業部、司法部、國防部和中央情報局參與了此項目，同時史丹福大學、麻省理工學院及部分國立實驗室如Argonne、Oakridge等國家實驗室也參與了該項目的開發和研究。美國政府和產業界在過去的10年共投入近20億美元用於以基因晶片為主的生物晶片研究開發與產業化。
目前，國際上已經有許多從事生物晶片研究的公司，每家公司的晶片技術都各具特色，應用目的也不盡相同，如加利福尼亞州森尼維爾的Hyseq公司，聲稱擁有最快的基因分析器，它們由機器人製造，機器人把DNA探針滴到過濾紙上，其DNA陣具有優勢，破譯DNA的速度最快。帕洛阿爾託的Syntenl公司聲稱它的晶片衡量細胞中基因活動最有效，公司正在利用基因晶片研究前列腺癌等疾病。聖地牙哥的Nanogen公司計劃進入診斷愛滋病毒和其它傳染病的市場。Incyte製藥公司與Affymetrix公司合作生產針對各種疾病的基因分析晶片供藥品研究使用。
美國Affymetrix公司是世界上最有影響的基因晶片開發製造商，該公司聚集有多位計算機、數學和分子生物學專家，其每年的研究經費在一千萬美元以上，且已歷時六七年之久，擁有多項專例。公司的第一種產品用於研究愛滋病毒的抗藥性，第二種產品將檢查在多種癌症中發生突變的一種基因，1998年生產出帶有13.5萬個基因探針的晶片，使人類DNA解碼速度提高了25倍。目前，該公司正在努力提高其晶片探針陣列的「密集度」，它的原型晶片能容納6.5萬個探針，最近又推出了有40萬個探針的晶片。公司總裁希望能生產出有100萬個探針的DNA晶片。該公司的基因組研究主任正在設計能夠同時監測5萬個人體基因的晶片。Affymetrix公司已開發出的判斷是否攜帶愛滋病病毒的逆轉錄酶基因HIV晶片；確定有無癌症可能的P53基因晶片以及診斷藥物代謝缺乏症的細胞色素P450晶片，現已應用於臨床。
英國劍橋大學、歐亞各國的跨國公司如摩託羅拉、惠普、IBM以及目立公司也正在從事基因晶片的研究。一些具有實力的大型製藥公司對基因晶片用於基因多態性、疾病相關性、基因藥物開發和合成或天然藥物篩選等領域都非常感興趣。相繼投入巨資開發基因晶片技術和相應的設備，嘗試利用基因晶片技術開展新藥的超高量篩選和進行藥理遺傳學、藥理基因組學的研究。
一項為期三年、耗資九百萬美元的計劃由摩託羅拉在坦佩的物理科學實驗室承擔，由亞利桑那州立大學、Hun tsville的CFD研究組和摩託羅拉生物晶片系統組共同研究，目的要研製出一種便宜、快速診斷傳染疾病的基因晶片，以加快對致命的病毒感染的診斷。
國內研究進展從我國的情況來看，作為人類基因組工程的參與國之一，雖然我國還處於初級階段，與發達國家水平還有差距，但有差距並不意味著沒有機會，挑戰與機遇並存。從整個高科技領域來講，生物技術是我國與國際先進國家水平差距最小的，故優先發展生物信息產業是一種運用智慧超越先進大國的戰略。
我國在99年3月國家科學技術部起草《醫藥生物技術「十五」及2015年規劃》所列十五個關鍵技術項目中，就有八個項目(基因組學技術、重大疾病相關基因的分離和功能研究、基因藥物工程、基因治療技術、生物信息學技術、組合生物合成技術、新型診斷技術、蛋白質組學和生物晶片技術)要使用生物晶片，其中，生物晶片技術還被單列為一個專門項目進行規劃，可見生物晶片在我國的重要性。
中國工程院2000年1月6日在京舉辦首次工程科技論壇，專題就是″生物晶片技術″，科學家提出以生物晶片技術為核心的各相關產業正在全球崛起，世界工業發達國家已開始有計劃、大投入、爭先恐後地對該領域智慧財產權進行保護。我國應迅速制定適合中國國情的對策，以避免出現像計算機產業那樣因沒有自己的晶片專利和技術而受制於人的被動局面。最近國務院已決定成立國家生物晶片工程中心，對生物晶片的系統研發作傾斜性支持。
我國科學家從1998年開始正式涉及基因晶片領域以來，已有多家大學和研究院所以及高新技術公司開始生物晶片的研發工作，主要有復旦大學、中科院上海冶金所、中科院上海細胞所、軍事醫學科學院、清華大學等高校和科研單位以及諸多的公司企業。國家級研究經費從1998年至今共投入約700萬元人民幣。清華大學從1999年開始成立專門研究基因晶片的博奧公司，3年內共獲得國家資助3億元。全國範圍內用於生物晶片研發的民間風險資本投入約為1.6億元人民幣，並在以很快的幅度增加。
基因晶片的製備基因晶片作為一項新興的技術，是將特異性寡核苷酸探針固定在俗稱為片基的固相支撐物上的。支持物分為很多種，如玻璃片、矽片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，均需經過特殊處理，才能將探針固定在上面。
用於連接、吸附或包埋各種生物分子使其以水不溶性狀態行使功能的固相材料統稱為載體。這種用於色譜填料的載體，同樣也適用於生物晶片的載體。用作色譜填料的載體絕大多數是以固體顆粒的形式填充到色譜柱中，而生物晶片所用的載體必須是固體片狀或者是薄膜類，而且片狀或薄膜類材料的表面和色譜顆粒填料表面一樣應當具有各種不同的活性基因，以便與各種生物分子連接。除此之外，製作生物晶片的材料應當具有良好的光學性質，能適應透射或反射光的測量。製作生物晶片的片(板)狀透明材料與用做色譜填料的不透明固體顆粒有著根本的區別。但是製作生物晶片的載體材料必須符合下列的要求(a)載體表面必須具有可以進行化學反應的活性基團，以便與生物分子進行偶聯；(b)使單位載體上結合的生物分子達到最佳容量；(c)載體應當是惰性的和有足夠的穩定性，包括機械的、物理的和化學穩定性。所謂惰性的，就是說載體其他性能或特異性吸附都不應該幹擾生物分子的功能。穩定性是在進行分子雜交或結合時，可能遭受一定的壓力或酸、鹼條件而不發生變化；(d)載體具有良好的生物兼容性，人們在從事科學研究和生物晶片的製作時，必須要全面衡量其利弊，選擇適合於自己的研究體系，兼顧其他要求。
在製作生物晶片是，載體材料很多，大致可分為4類無機材料、天然有機聚合物、人工合成的有機高分子聚合物、各種高分子聚合物製成的各種膜。總體來說有幾十種甚至上百種載體材料。目前使用於製作生物晶片的載體材料只有少數幾種，象玻璃片、金屬片、各種有機高分子製作的薄膜等。其中玻璃片受到各國研究者的重視，其研究可能是來源方便，表面羥基可以用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基矽烷作表面處理，然後能夠偶聯核酸、酶、抗體(抗原)、蛋白質多肽等各種生物分子。也可以用巰基標記的生物分子直接和玻璃表面作用等。另一個原因是大多數生物晶片採用了發光檢測的方法，不管透射光或反射光它均合適。第三個原因是可以用光刻的方法在玻璃晶片上刻出微流路，或者它與刻好微流路的矽橡膠壓緊聯合使用的微流路，通過微量注射泵在載體上進行生物分子的連接，DNA雜交，清洗和檢測等。
活化定義為載體的修飾過程，即通過化學反應用各種不同的活化試劑在載體表面健合上各種各樣的活性基團，以便與配基共價結合，形成具不同的生物特異性的親合載體，用來固定各種不同的活性生物分子，如蛋白質、核酸、酶、多肽、抗原、抗體等。
活化的方法有很多種，但到目前為止沒有一種活化方法能夠適合所有的載體的活化和配基的偶聯，所以在活化開始的時候，應當有一個基本的估計，即活化的載體在偶聯試劑作用與配基的偶聯應當是容易進行的。不同載體可以用不同的活化試劑把載體表面活化，例如表面為羧基的載體，用EDC和NHS把表面變成活潑酯，然後再同各種不同的生物分子偶聯。採用類似的方法，可以分別把羥基、氨基、醛基、巰基等的載體表面活化成活性基團，然後再進行不同的鍵合反應。值得提出的是，在金箔表面進行分子自組裝也不難。用DTT還原DNA中的二硫鍵變成巰基或者直接利用DNA分子中的(-S-S-)二硫鍵，都可以把DNA探針特異的結合在金的表面。
我們的基因晶片固相載體的製備方法本發明的基因晶片固相載體的製備方法，所用的材料包括，但不限於，普通玻璃片、石英片和矽片等，通過表面化學修飾，使這些材料表面帶有巰基(-SH)而完成的。
採用本發明的基因晶片固相載體的製備方法，可製備出帶有活性巰基(-SH)的基因晶片片基。基因晶片片基上的活性巰基(-SH)可以與在5』端或3』端被修飾(連接)有活性巰基(-SH)的寡核苷酸的巰基(-SH)反應，生成二硫鍵(-S-S-)，從而將寡核苷酸通過二硫鍵(-S-S-)固定(連接)在基因晶片片基上。這些固定在基因晶片片基上的寡核苷酸通常是作為分子探針，它們與某些基因的DNA序列互補或高度同源，可以與這些序列互補的DNA單鏈通過退火而形成雜交分子，從而將這些序列互補的DNA單鏈捕捉、固定在基因晶片上。這些被捕捉、固定的DNA單鏈被人為標記上螢光素、同位素或酶，可以在基因晶片上顯現出來，人們據此就可判斷出被捕捉的基因。
採用本發明的基因晶片固相載體的製備方法，製備出帶有活性巰基(-SH)的基因晶片片基後，利用微排序法按照設計將所述的被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針有序地點樣到載體上，通過核酸探針末端修飾的活性基團與載體表面相應的活性基團反應，形成二硫鍵(-S-S-)，將探針固定於載體上，從而製成基因晶片。同時，在所製備的基因晶片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交後，通過對所捕獲陽性信號的尋址即可明確其對應的特定核酸探針，從而確定與其對應的目標DNA序列。
採用本發明的基因晶片固相載體的製備方法所製備的基因晶片，可以用於醫療(診斷、治療、療效判斷)、海關檢疫、衛生防疫、軍方生物戰劑的快速檢定傳感器等應用領域。
本發明通過以下實施例對本發明的基因晶片固相載體的製備方法及其應用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來說明而非限制本發明，本領域技術人員所熟知的、其他通過採用本發明的基因晶片固相載體的製備方法而製備的基因晶片的應用均在本發明的範圍內。實施例1、基因晶片玻璃固相載體的製備方法材料1、普通載玻片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧矽烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法載玻片用強酸浸泡後，用去離子水反覆洗滌，用無水乙醇洗滌並浸泡48小時。
將載玻片取出，浸於25％氨水中48小時，取出後，用去離子水衝洗，然後用無水乙醇洗滌。
洗滌結束後，將載玻片浸於以下溶液中一小時，進行矽化1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配製方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶於50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧矽烷於1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將載玻片逐片放入「3」的溶液中，室溫放置1小時。
將載玻片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然後將載玻片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然後取出，每片單獨碼放於支架上。
將支架移入真空乾燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空乾燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷浸泡後，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍後，於氬氣中放置48小時，取出。
置於陰涼閉光處保存。基因晶片玻璃固相載體即製備完成。實施例2、基因晶片石英固相載體的製備方法材料1、石英片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧矽烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法石英片用強酸浸泡後，用去離子水反覆洗滌，用無水乙醇洗滌並浸泡48小時。
將石英片取出，浸於25％氨水中48小時，取出後，用去離子水衝洗，然後用無水乙醇洗滌。
洗滌結束後，將石英片浸於以下溶液中一小時，進行矽化1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配製方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶於50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧矽烷於1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將石英片逐片放入「3」的溶液中，室溫放置1小時。
將石英片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然後將石英片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然後取出，每片單獨碼放於支架上。
將支架移入真空乾燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空乾燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷浸泡後，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍後，於氬氣中放置48小時，取出。
置於陰涼閉光處保存。基因晶片石英固相載體即製備完成。實施例3、基因晶片矽片固相載體的製備方法材料1、矽片2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巰丙基)三甲氧矽烷(ACROS)3、氬氣北京氧氣廠方法矽片用強酸浸泡後，用去離子水反覆洗滌，用無水乙醇洗滌並浸泡48小時。
將矽片取出，浸於25％氨水中48小時，取出後，用去離子水衝洗，然後用無水乙醇洗滌。
洗滌結束後，將矽片浸於以下溶液中一小時，進行矽化1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。
配製方法取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶於50ml去離子水中，加入1L容量瓶中，用無水乙醇加至1000ml刻度，測其pH為4.5。取5.8ml 85％的(3-巰丙基)三甲氧矽烷於1L的燒杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。
將矽片逐片放入「3」的溶液中，室溫放置1小時。
將矽片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然後將矽片再浸泡入1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然後取出，每片單獨碼放於支架上。
將支架移入真空乾燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氬氣再抽真空至-0.75mPa，放入氬氣至與大氣等壓，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氬氣，如此，可將真空乾燥起器中的空氣都置換掉。
置室溫(20℃)至少48小時。
用1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷浸泡後，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍後，於氬氣中放置48小時，取出。
置於陰涼閉光處保存。基因晶片矽片固相載體即製備完成。實施例4、用帶有活性巰基(-SH)的基因晶片玻璃片基製備基因晶片利用微排序法，將被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針有序地點樣到所述的「實施例1」、「實施例2」、「實施例3」所製備的基因晶片固相載體上，通過核酸探針末端修飾的活性基團與載體表面相應的活性基團反應，形成二硫鍵(-S-S-)，將探針固定於載體上，從而製成基因晶片。
同時，在所製備的基因晶片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交後，通過對所捕獲陽性信號的尋址即可明確其對應的特定核酸探針，從而確定與其對應的目標DNA序列。實施例5、將本發明的基因晶片固相載體用於臨床病原微生物診斷在「實施例4」中，如果所述的核酸探針是針對某種病原微生物的，則使用所述的「實施例4」所製備的基因晶片就可以檢測出該病原微生物。如肝炎病毒、性病病原微生物、腹瀉病原微生物、呼吸道致病微生物、耐藥細菌的耐藥基因等。實施例6、將本發明的基因晶片固相載體用於食品、衛生防疫在「實施例4」中，如果所述的核酸探針是針對某種通過消化道傳播的病原微生物的，則使用所述的「實施例4」所製備的基因晶片就可以檢測出該通過消化道傳播的病原微生物。如大腸桿菌、霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌等。實施例6、將本發明的基因晶片固相載體用於癌症診斷在「實施例4」中，如果所述的核酸探針是針對癌基因的，則使用所述的「實施例4」所製備的基因晶片就可以診斷出癌症。實施例7、將本發明的基因晶片固相載體用於其他疾病診斷在「實施例4」中，如果所述的核酸探針是針對遺傳病基因的，則使用所述的「實施例4」所製備的基因晶片就可以診斷出該遺傳病，如血友病、先天性心臟病等。
權利要求
1.基因晶片固相載體的製備方法，其特徵在於用1％(3-巰丙基)三甲氧矽烷對洗滌乾淨的玻璃片、矽片和石英片進行矽化。
2.權利要求1的基因晶片固相載體的製備方法，其特徵在於所製備出的基因晶片固相載體的表面帶有活性巰基(-SH)。
3.按權利要求1所製備出的、具備權利要求2所述特徵的基因晶片固相載體，通過其表面的活性巰基(-SH)與被修飾有活性巰基(-SH)的核酸探針通過形成二硫鍵(-S-S-)，將核酸探針固定於載體上，從而製成基因晶片。
4.將權利要求3所述的基因晶片用於臨床病原微生物診斷、食品衛生防疫、癌症和其他疾病的診斷。
全文摘要
本發明涉及一種新的基因晶片固相載體的製備方法。其要點是用一種化學物質對玻璃片、石英片和矽片進行處理，使玻璃片、石英片和矽片表面帶有活性基團，此活性基團與核酸探針上的活性基團反應，通過形成二硫鍵將核酸探針固定於固相載體從而製成基因晶片。按本方法製備出的基因晶片可用於臨床病原微生物診斷、食品衛生防疫、癌症和其他疾病的診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1475578SQ0212604
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月12日 優先權日2002年8月12日
發明者王鶴堯, 鄭文婕 申請人:王鶴堯, 鄭文婕