通過靜脈給藥的用於控制釋放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的組合物的製作方法

2023-06-13 20:45:26 2

專利名稱：通過靜脈給藥的用於控制釋放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種組合物，包括海藻酸或其藥學可接受的鹽類的微粒，通過該微粒達到控制釋放，並且增加經靜脈給藥的活性成分的半衰期，以及使應用次數減少，並在血液中達到更穩定的活性成分水平，由此潛在地減少一般由於定期輸注活性成分而出現的其濃度的峰谷。
本發明說明了具有下列組合的海藻酸鹽的疏水微粒其尺寸適於靜脈輸注且其物理化學特性適於避免該微粒被迅速吞噬，從而能夠控制釋放複雜的活性成分。


發明內容
由於其物理化學和生物化學特性，海藻酸及其鹽類(海藻酸銨、海藻酸鈣、海藻酸鉀、海藻酸鈉和海藻酸丙二醇酯)是在活性成分的包封中最常用和研究最多的聚合物之一。它們是天然來源、從海藻或細菌商業化產生的多糖。
海藻酸鹽是海藻酸的鹽類，是由兩種單體單元，β-(1-4)-D-甘露糖醛酸(M)和α-(1-4)-L-谷洛糖醛酸(G)組成的線性多糖。它們分為形成多種序列的嵌段，最常見的為G、M和MG。
在多價陽離子如鈣(Ca++)的存在下，在形成海藻酸鹽的延伸網絡的連續G嵌段之間形成強鍵。鈣離子作為橋位於具有帶負電荷的谷洛糖醛酸的基團之間。
在一些製劑中，它們經常伴隨著其他多糖諸如殼聚糖。殼聚糖是一種由隨機分布的β-(1-4)D-氨基葡萄糖(脫乙醯單位)和N-乙醯基-D-氨基葡萄糖(乙醯單位)組成的線性多糖。
在一些海藻酸鹽製劑中可使用白蛋白作為帶電荷物質，優選無菌和無熱原的人白蛋白，其還可用作製造過程中活性成分的保護劑或用作產品的長期保存期間的穩定劑。
其在血漿中的釋放要被改變的活性成分可以是複雜的和不穩定的活性成分。更具體地，活性成分的特徵是顯示生物活性。此生物活性可通過酶活性、轉運、與配體的分子相互作用或結合來表現。在兩種情況下活性成分的問題是對製造的能量條件不穩定或敏感，其中尤其是溫度、壓力和/或非極性環境，因為小的結構變化可導致生物活性的不可逆喪失。
作為具有生物活性的活性成分，可列舉人肽類激素諸如褪黑激素、5-羥色胺、甲狀腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、促腎上腺皮質激素、血管緊張素原和血管緊張素、加壓素、心房肽、降鈣素、促紅細胞生成素、卵泡刺激素胰高血糖素、人絨毛膜促性腺激素、人胎盤催乳素、生長激素、抑制素、胰島素、胰島素類生長因子(或生長介素)、黃體生成素、黑色素細胞刺激素、催產素、催乳素、血小板生成素、神經肽Y、組胺、以及其衍生物。
其他實例可以是生物活性蛋白，尤其是諸如白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、α-2-巨球蛋白、抗凝血酶、結合珠蛋白、血漿銅藍蛋白、脂蛋白、轉鐵蛋白、纖溶酶原、纖維蛋白原、補體蛋白、凝血因子和免疫球蛋白。
這些活性成分是生物活性的事實使得由於微小結構損害造成它們特別容易可能喪失功能性。此種結構損害可與溫度、壓力、介質的極性、滲透壓、氧的存在、攪拌等有關。
就此而言，在這些活性成分中凝血因子VIII非常突出，因為它極度不穩定。由於其結構複雜性，其非常難以充分地穩定FVIII的生物活性，尤其是其純化形式。例如，Parti R等人(Haemophilia 2000；6513-522)說明了在大於40℃的溫度下，甚至凍幹形式的FVIII的生物活性都開始受到損害。當FVIII在溶液中時，這種不穩定性最為突出，甚至在25℃下就觀察到不穩定性的跡象。對於IX因子和VIIa因子，對於外界因素諸如溫度的敏感性也是公知的。
就此而言，必需注意，採用的製造工藝要獲得具有FVIII的生物活性的治療製劑。這意味著該方法可應用於顯示難以穩定的生物活性的活性成分，並且因此，本發明可應用於與FVIII一樣不穩定的成分。通過擴展，本發明可應用於比FVIII更穩定的成分。因此，凝血因子是可從如本發明中所述的製劑的應用中獲益的活性成分的明顯實施例。
在本發明中，包括在聚合物微球中的活性成分因此可以是顯示生物活性的肽、蛋白或激素。優選地，活性成分是凝血因子，且更優選地，活性成分是VIII因子、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、由VIII因子和血管性血友病因子形成的複合體、IX因子或VIIa因子。
這些成分可以是人、動物、重組或轉基因來源的。在後一種情況下，合成分子可以是天然分子的複製或可被有意地修飾。
獲得組合物 微囊化是一種用不同特性的材料包被分子、固體顆粒或液體球以產生微米尺寸的微粒的方法。由此技術方法獲得的產品被稱為微粒、微膠囊或微球。
有幾種微囊化技術 -通過化學方法的微囊化 ·界面聚合法 -通過物理化學法的微囊化 ·蒸發溶劑 ·凝聚法 ·凝膠化 ·螯合 ·形成囊泡 -通過機械方法的微囊化 ·擠出 ·共擠出 ·噴霧乾燥 ·噴霧冷凍 選擇用於製造本發明中描述的微粒的技術是噴霧乾燥，該方法記載在Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteins withinalginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′s University，Kingston，Canada]。此製造技術的特徵是單階段，且微粒作為終產物獲得。
包括本發明的用於控制釋放活性成分的海藻酸或其鹽類的微粒的用於靜脈給藥的生物相容組合物的製造工藝的特徵在於以下的階段 -噴霧，其中含有活性成分和聚合物的溶液/混懸液/乳液通過噴嘴被泵出，並且以液滴的形式分散， -在乾燥室中乾燥，在此處熱空氣促進溶劑從液滴蒸發，以及 -收集被包封的產物。
此方法在140～180℃的溫度下進行，供應流速為35～40m3/h，注射流速為3.5～5ml/min且壓力為4～6psi。
在這些條件下能夠獲得尺寸小於或等於5μm，優選1-4.5μm並保持活性成分的活性的顆粒。另外，可在噴霧階段前任選的乳液勻化工藝中改進顆粒的平均尺寸。此附加的勻化工藝藉助於壓力，例如1500～2000psi來進行。
通過噴霧乾燥包封活性成分是一個連續工藝，其中溶液或乳液被脫水，在工藝結束時回收由微粒形成的固體。
為此，含有活性成分的液體以預定的注射流速被機械驅動至噴嘴或旋轉盤，從中其以數百萬個非常小的液滴進行噴霧。液滴的大小在很大程度上由使液體形成噴霧的氣體的壓力來決定。此工藝在密閉室中進行，在該密閉室中控制的氣，通常為空氣的氣流以預定的吸入速率並在可控溫度下連續循環。
作為噴霧的結果，液體極大地增加了其與空氣的接觸表面積，使得當面對乾燥空氣流時，液體溶劑，通常為水迅速蒸發。由於改變狀態需要熱量，因此此迅速蒸發使每個小液滴內部冷卻。以此方式能夠進行快速乾燥，同時儘量減小對活性成分的熱休克。完成該工藝後，產物以固體形式被收集。
組合物的說明 獲得的微粒通過測定其顆粒平均粒徑、其Z電位和生物活性來區分。顆粒的尺寸使用Beckman Coulter LS13320裝置通過雷射衍射來測定。
由於有靜脈給藥的問題，需要顆粒尺寸小於或等於5μm，優選1～4.5μm，因為較大的顆粒尺寸會導致血栓形成。
Z電位使用Malvern Zetasizer裝置測定，Z電位是控制混懸液中顆粒的相互作用的重要參數之一。其通過顆粒表面和分散介質的特性來確定。在此情況下，最佳值為-30mV以上，因為此值確保顆粒之間的斥力並確保沒有凝聚物。已經顯示具有接近0，優選-30mV～0的Z電位的微粒具有很低的肝臟攝取和細胞清除水平。(Szycher，Michael，High PerformanceBiomaterialsA Comprehensive Guide to Medical and PharmaceuticalApplications，CRC Press出版，1991ISB 0877627754，9780877627753，812頁)。
組合物的應用 修飾釋放或控制釋放的藥物形式以下列方式設計相對於以相同方式給藥的常規釋放的藥物形式，改變活性物質釋放的速率和/或位置。
在本發明中，已經觀察到顯示生物活性的活性成分諸如蛋白(更具體地，凝血因子)的包封如何在體內和體外釋放模型中實現控制釋放。由於VIII因子的結構複雜性，其對於外界因素極度敏感而著名。實際上，甚至將FVIII冷凍在其天然基質-人血漿中，仍會導致生物活性的部分損失(Bravo，M.I.等人，Pharmeuropa Scientific Notes，2006-1，1-5頁)。
因此當本發明中所述的含有人FVIII的微粒置於環境非常類似於人血漿的連續流動室中時，與未包封產品相比，已經觀察到介質中FVIII的釋放有延遲。
類似地，在兔中靜脈給予本發明的含FVIII微粒，與常規產品相比，使FVIII在血漿中的半衰期始終顯著地延長。此外，在可能指示有與所述製劑相關的毒性作用的動物中沒有觀察到不良反應。
體內藥代動力學數據非常明顯，因為毫無疑問地證實MPS的調理作用和加速攝取已經被本發明的製劑適當地解決了。
本發明可用於治療需要靜脈給予複雜成分的各種病理狀況，這些病理狀況可包括，例如，出血障礙和凝血障礙、激素紊亂等。在這些情況下，將實現半衰期的顯著延長，例如對於FVIII，可包括減少用於維持一線預防治療方案的給藥次數，例如，每周一次給藥。
可能存在的與使用親水聚合物有關的缺點可以是，在產品懸浮在給藥水性載體，例如，無熱原和無菌注射用水中的時間和靜脈輸注時刻之間的時段期間微粒的部分溶出。此類缺點可使用，例如，部分無極性的生物聚合物溶液，諸如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亞碸、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氫呋喃聚乙二醇醚、異丙叉甘油、甘油縮甲醛或丙酮(Mottu F等人，Journal of Pharmaceutical Science&Technology 2000Vol.54，No.6，456-469)作為本發明中所述的微粒的重懸浮和給藥載體來克服。
例如，本發明可以包裝在真空或惰性氣氛中的脫水或凍乾產品的形式來產生，使得能夠在不同的溫度條件下，例如，在2℃～40℃之間，具有長期穩定性。由此保存的產品可在用溶劑配製後經靜脈給藥，溶劑可以是注射用水，或鹽水溶液，或具有下列可變含量的混合物或鹽水溶液，例如0.5％～50％的生物相容溶劑諸如，例如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亞碸、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氫呋喃聚乙二醇醚、異丙叉甘油、甘油縮甲醛或丙酮。
本發明的有益效果 本發明說明了具有下列組合的海藻酸鹽的親水微粒的產生該微粒具有適於靜脈輸注的尺寸以及適於防止其迅速吞噬的物理化學特性，使得複雜活性成分的半衰期延長。
海藻酸鹽是生物相容的，並經尿清除，並且與任意已知的毒性作用無關。由於具有此特性，本發明與蛋白和複雜活性成分的給藥是可配伍的。
本發明可克服造成可控靜脈給藥系統不實用的所有缺陷，由此減少了治療所需的給藥次數，而靜脈使用的活性成分沒有變化。就此而言，需注意，本發明不需要在胺基酸序列、糖基化作用或導入合成衍生物這些方面對活性成分作任何的修飾。



圖1顯示了BATCH 9和BATCH 1的體外釋放試驗的結果的比較圖。
圖2顯示了在給予未包封的FVIII後和在應用本發明的組合物後在兔血漿中人FVIII:C的藥代動力學。
圖3顯示了在給予未包封的FVIII後和在應用本發明的組合物後在兔血漿中人VWF:Ag的藥代動力學。

具體實施例方式 實施例1 微粒的製備 如Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteinswithin alginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′sUniversity，Kingston，Canada]中的記載使用噴霧乾燥工藝生產海藻酸鹽微粒。基本上，通過產生具有所選擇的聚合物和活性成分的乳液來製備微粒。
使用Büchi小型噴霧乾燥儀B-290裝置在下列條件下對樣品進行噴霧噴霧溫度140℃-180℃，吸入速率35-40m3/h，注射流速3.5-5ml/min，且壓力為4-6psi。
實施例2 微粒的說明 表1、2和3說明了在製造微粒中使用的原料和其特性，包括尺寸、Z電位和收率。使用的製造工藝和條件如實施例1中所述。
表1FVIII微粒(血漿FVIII)的說明 FVIII活性/FVIII抗原比給出了指定樣品中活性蛋白的比例的概念。以此方式，如果我們將初始樣品中的活性/抗原比與包封樣品的活性/抗原比進行比較，則我們可計算微囊化後仍然具有功能的活性成分的比例。在實施例中，我們發現在包封工藝期間的活性收率，以與初始活性收率相比的百分比表示，對於第1批次、第2批次和第3批次分別為57.6％、33.9％和35.7％。
表2FIX微粒(血漿FIX)的說明 在此例子中，我們發現在所有所述批次中，在第4批次、第5批次和第6批次中包封工藝期間的活性收率為100％。
表3rFVIII微粒(重組rFVIII)和rFVIIa(重組rFVIIa)的說明 在重組來源的蛋白的情況下，對於第7批次和第8批次，包封工藝期間測定的活性收率分別為25％和71％。
在所有批次中，使用Beckman Coulter LS 13320裝置通過衍射雷射測定顆粒尺寸，並且使用Malvern Zetasizer裝置測定Z電位。
FVIII的生物活性通過缺陷性血漿凝血試驗或通過生色作用評價FXa的生成來測定。對於FVIIa和FIX，分別通過評價無FVII和FIX的血漿的凝血時間(部分活化凝血活酶時間)來測定生物活性。通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)的免疫檢測方法分別使用針對FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特異性抗體測定蛋白濃度。
指示指定樣品中活性蛋白的比例的活性/抗原比通過獲得樣品中具體活性成分的活性和抗原單位之間的商來計算。通過估計起始樣品和最終的包封產品的活性/抗原比之間的變化百分比來計算活性/抗原收率。
如在所有例子中所見，平均粒徑小於或等於5μm，且Z電位為負。活性/抗原收率的結果還表明工藝期間生物活性得到保持。
各表顯示控制釋放系統適用於不同的活性成分。
實施例3 體外釋放試驗 在Sotax CE1裝置中在閉合迴路中採用連續流動室進行控制釋放試驗以評價活性成分的釋放。
在37℃的溫度下使用含有1％人白蛋白的咪唑緩衝液(pH 7.3)作為溶解介質進行試驗，流速為7-25ml/min。在不同的時刻(5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘和240分鐘)提取代表性樣品用於分析。用相同體積的新鮮介質替換提取的樣品的體積以便糾正體積的損失。
FVIII的生物活性通過缺陷性血漿凝血試驗或通過生色作用評價FXa的生成來測定。對於FVIIa和FIX，分別通過評價無FVII和FIX的血漿的凝血時間(部分活化凝血活酶時間)來測定生物活性。通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)的免疫檢測方法分別使用針對FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特異性抗體測定蛋白濃度。
測試完成後獲得下列的結果 表4.未包封的凍幹FVIII(第9批次)的體外釋放試驗
表5.FVIII納米顆粒(第1批次)的體外釋放試驗
我們可看到與未包封產品相比，應用於活性成分的微粒的組合物改變了產品的釋放動力學。
實施例4 VIII因子在動物中的藥代動力學 為了評價在體內組合物對活性成分的釋放的作用，對兔進行藥代動力學試驗。為此，50IU/kg劑量的來自第9批次的人FVIII(未包封)經靜脈給予三隻雌性紐西蘭白兔。類似地，50IU/kg劑量的來自如實施例1所述和根據實施例2所述製造的第1批次的包封FVIII經靜脈給予另外三隻雌性紐西蘭白兔。在不同的時間，獲取血漿樣品進行分析以檢測人FVIII:C的存在，如表6中所述。在選擇性免疫俘獲人FVIII分子後通過生色作用檢測人FVIII。這樣可使融合的人FVIII的活性與兔FVIII的活性區分開。
表6.在給予未包封FVIII後和應用本發明的組合物後兔血漿中人FVIII:C的藥代動力學
從結果我們可以看出組合物延遲了活性成分在血漿中的釋放。另外，這些結果證明不管其大小如何，都不存在將微粒從循環中迅速清除的細胞機制(肝臟、脾臟或巨噬細胞)。
使用用於此目的的適當軟體(WinNonlin 5.2)分析此數據，使我們能夠計算表7中詳述的藥代動力學常數。
表7.在給予未包封FVIII後和應用本發明的組合物後兔血漿中人FVIII:C的藥代動力學參數
實施例5 動物中血管性血友病因子的藥代動力學 在第9批次製劑(未包封FVIII)和第1批次製劑(包封FVIII)兩種情況下，FVIII的血漿來源具有顯著含量的血管性血友病因子(VWF)。這意味著VWF的包封與FVIII的包封同時發生。對此，可獨立地研究它們的行為。為此，我們繼續通過評價兔血漿中人VWF抗原(VWF:Ag)的存在來單獨地分析VWF藥代動力學。結果顯示在表8中。
表8.在給予未包封VWF後和應用本發明的組合物後兔血漿中人VWF:Ag的藥代動力學
從結果我們可以看出組合物延遲了活性成分在血漿中的釋放。另外，這些結果證明不管其大小如何，都不存在將微粒從循環中迅速清除的細胞機制(肝臟、脾臟或巨噬細胞)。
使用用於此目的的適當軟體(WinNonlin 5.2)分析此數據，使我們能夠計算表9中詳述的藥代動力學常數。
表9.在給予未包封FVIII/VWF後和應用本發明的組合物後兔血漿中人VWF:Ag的藥代動力學參數
可觀察到，活性成分(在此例子中為VWF)的包封明顯地延長了其半衰期。
儘管本發明已經對於優選實施方式的實施例進行了說明，但這些實施例不應被認為是對本發明的限制，本發明由下列權利要求的較寬釋義來限定。
權利要求
1.一種用於靜脈給藥的生物相容組合物，包括用於控制釋放活性成分的海藻酸或其鹽的微粒，其特徵在於這些微粒的尺寸小於或等於5μm，並且具有負Z電位。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於所述微粒的尺寸為1-4.5μm。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於所述Z電位為-70～0，不包括0。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於所述活性成分為肽、蛋白質或激素。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分為人、動物、重組或轉基因來源。
6.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分顯示不穩定的生物活性。
7.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是凝血因子。
8.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是VIII因子。
9.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是VWF。
10.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是由FVIII和VWF形成的複合體。
11.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是IX因子。
12.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於所述活性成分是VIIa因子。
13.一種製造根據權利要求1-12任一項所述的用於靜脈給藥的生物相容組合物的方法，所述生物相容組合物包括用於控制釋放活性成分的海藻酸或其鹽的微粒，其特徵在於所述方法包括以下的步驟
-噴霧，其中含有活性成分和聚合物的溶液/混懸液/乳液通過噴嘴被泵出，並且以液滴的形式分散，
-在乾燥室中乾燥，在此處熱空氣促進溶劑從液滴蒸發，以及
-收集被包封的產物；
此方法在140～180℃的溫度下進行，供應流速為35～40m3/h，注射流速為3.5～5ml/min且壓力為4～6psi。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於在噴霧階段之前另外進行將所述乳液勻化的任選步驟。
15.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於所述附加的勻化步驟通過施加1500-2000psi的壓力進行。
16.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於獲得的所述微粒的尺寸為1-4.5μm。
17.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於獲得的所述微粒的Z電位為-70～0，不包括0。
18.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於所述活性成分為肽、蛋白質或激素。
19.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分可以為人、動物、重組或轉基因來源。
20.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分顯示不穩定的生物活性。
21.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是凝血因子。
22.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是VIII因子。
23.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是VWF。
24.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是由FVIII和VWF形成的複合體。
25.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是IX因子。
26.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於所述活性成分是VIIa因子。
27.根據權利要求1-12任一項所述的生物相容組合物在治療出血障礙、凝血變化和激素疾病中的應用。
全文摘要
通過靜脈給藥的用於控制釋放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的組合物。本發明涉及一種生物相容組合物，其包括海藻酸或其鹽的微粒和活性成分。更具體地，本發明涉及用於包封要靜脈給予需要其的患者的活性成分的微粒。當靜脈給藥時，這些微粒是具有如下的組合其足以增加血液中活性成分的半衰期或存留時間尺寸，在肝臟中的攝取少，並且細胞清除快速。
文檔編號A61K38/00GK101757631SQ200910249539
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者薩爾瓦多·格蘭切·加蒙, 安娜·娜蒂·瑞卡特, 約瑟·瑪利亞·蘇內·尼格, 約瑟·拉蒙·蒂科·格勞, 蒙特塞拉特·米尼亞羅·卡莫納 申請人:基立福有限公司