包含新的調控元件的載體的製作方法

2023-06-13 12:41:41 1

專利名稱：包含新的調控元件的載體的製作方法
包含新的調控元件的載體背景技術本發明涉及重組DNA技術領域，尤其是開發用於重組蛋白表達的 載體。在真核細胞中表達異源基因是生物技術的一個重要方面，在學 術和商業方面均有應用。這些基因的表達需要RNA聚合酶II (PolII) 進行轉錄，這是被已知為啟動子和增強子的順式遺傳元件驅動的。簡單來說，啟動子是位於下遊少於100 (通常少於50)鹼基對(bp) 的起始序列轉錄的定向元件。它們包含許多作為不同蛋白的結合位點 的短的共有核苷酸序列，這些蛋白參與轉錄起始和已知為前-起始複合 物的多-亞單位複合物的組裝(McKnight and Tjian， 1987， Ce1 46: 795-805 )。在大部分基因中，這發生在非常廣泛的已知為TATA盒 (TATAAA)的保守序列，TATA盒-結合蛋白(TBP，通用轉錄因子 TFIID的一個亞單位)與其結合。隨後超過10種其他轉錄因子有序組裝， 最終形成PolII全酶複合物。RNA轉錄實際起始於下遊約25-30鹼基的起 始{立點(Breathnach禾口Chambon， 1981 , Annu Rev Biochem 50: 349-393)， TBP也與其結合。大部分功能性啟動子還包含上遊啟動子元件(UPEs)，它們中最 保守的是CAAT盒(CCAAT ，轉錄因子CBF 、 C/EBP禾BNF-1的結合位點)， 在上遊大約70-200bp，和GC盒(GGGCGG，通用轉錄因子Sp-l的結合 位點)，位於上遊相似距離。儘管TATA盒單獨就能產生基本水平的轉 錄，但對大部分啟動子來說優選水平的轉錄至少需要CAAT和GC盒。增強子是非定向增強附近但不必直接緊鄰的啟動子的轉錄的序列 (可以到幾千鹼基遠(Kadonaga (2004) Cell 116: 247-257)。增強子 包含代表廣泛的轉錄激活蛋白結合位點的短(8-12bp)共有序列(Ondek
等人，1988， Science 236: 1237-1244)，所述轉錄激活蛋白包括也與啟動 子元件有關的一些蛋白，例如NF-1和SP-1。這些序列經常以串聯或者 反向重複形式重複出現。在一些天然轉錄單位中，包括許多DNA病毒諸如巨細胞病毒的非 常活躍的立即/早期基因轉錄單位，增強子和啟動子元件可以被功能性 組合成有效的擴展的上遊元件。啟動子可被調節，以對細胞類型、溫度、金屬離子或者其他因子 作出應答；或者啟動子可以是組成型的，產生對這些因子沒有應答的 轉錄。出於許多目的，在許多(如果不是全部的)細胞類型中產生持 續高水平轉錄的組成型強啟動子是非常有利的。許多年來在人巨細胞 病毒中驅動立即/早期基因表達的增強子/啟動子元件已被廣泛用於驅 動真核表達載體異源基因的這種表達(Foecking和Hoffstetter， 1986, Gene 45: 101- 105)。人巨細胞病毒(CMV)是3皰疹病毒科成員，引起胃腸和呼吸道 感染、肝炎和視網膜炎。和其他皰疹病毒屬一樣，CMV可持續潛伏感 染，在免疫缺陷病人中被重新激活。在細胞培養中，人CMV在終極分 化細胞諸如成纖維、上皮和內皮細胞以及單核細胞來源的巨噬細胞中 有效複製(Isomura和Stinski, 2003， J Virol 77: 3602-3614及其參考文獻)c在有效感染過程中，CMV基因有一個有序的表達模式，稱為立即-早期(IE)、早期或者晚期。人CMVIE基因被認為在複製效率上起著 關鍵作用(參見Castillo和Kowalik， 2002， Gene 290: 19-34的綜述)。人CMV IE啟動子的上遊區域被分成3個區域，調節子、獨特區和 增強子。增強子還可被分為遠端和近端增強子。遠端增強子是有效IE 基因表達和低MOI下病毒複製必需的。人CMVs具有用於IE基因表達的 非常強的增強子。人CMV增強子具有4個包含NF-K B或者rel結合位點 的18-bp重複元件，5個包含CREB或者ATF結合位點的19-bp重複元件， 2個AP-1結合位點和多個SP1位點(Thomsen等人，1984, Proc Natl Acad Sci USA 81 : 659-663; Meier禾P Stinski, 1996, Intervirology 39: 331-342)。鼠CMV增強子包含6個NF-K B或者rel結合位點、1個CREB 或者ATF結合位點，和至少7個AP-1結合位點(Dorsch-Hasler等人，1985, ProcNatlAcadSci USA 82: 8325-8329)。不同的順式-作用元件單獨以 及協同地穩定啟動子上的RNA聚合酶n轉錄起始複合物。許多優勢地感染其他宿主種類的巨細胞病毒是已知的，但是，在 許多情況下，確切的分類和種間相關性的程度都是暫定的。感染許多 靈長類(包括非洲綠猴、恆河猴和倭黑猩猩)和嚙齒類包括小鼠、大 鼠和豚鼠的巨細胞病毒樣病毒已經被識別。在這些中，只有小鼠和大 鼠的啟動子-增強子已經進行了詳細功能分析。這些種類與人CMV的比 較顯示IE啟動子-增強子的功能沒有直接可比性，這可能是因為還存在 未識別的在不同種的細胞中作用於下遊轉錄的順式-作用元件(Isomura 禾口Stinski， 2003, J Virol 77: 3602-3614)。但是，人和小鼠的CMV IE啟動子-增強子在真核表達載體中產生 異源基因的持續高水平組成型表達，在生物技術中廣泛應用。人CMV 啟動子的這種使用公開於US 5,168,062 (Stinski/University of Iowa)。 US 5,591,639 (Bebbington/Celitech)要求保護利用啟動子、增強子和 包含人巨細胞病毒主要立即-早期基因的第一個內含子的功能完整的5' (上遊)非翻譯區域，其中這不是直接連接到它的天然DNA編碼序列。 US 4,968,615 (Koszinowski等人)公開了小鼠CMV IE增強子的使用。豚鼠CMV (GPCMV)引起與人CMV感染的病理學有很多相似的 豚鼠疾病。力圖表現基因組特徵的努力(Isom等人，1984, J Virology 49: 426-436; Gao和Isom， 1984， J Virology 52: 436-447)表明其基因組的結 構組織在皰疹病毒屬中是獨特的。儘管大小與人和鼠CMV相似， GPCMV基因組比人CMV基因組簡單得多，最接近於小鼠CMV的基因 組。但是，GPCMV基因組具有幾個不尋常的特徵，尤其是在末端區域 的結構。IE基因表達的後續研究通過與人CMV的序列比較發現了IE區 域(Yinetal, 1990， J Virol 64: 1537- 154S)，並分析了IE轉錄本的表達 和加工。但是，還沒有關於IE啟動子-增強子對異源基因表達的有用性 的分析。包含IE1編碼序列的5'端和上遊啟動子/增強子區域的GPCMV基因 組的"HRv" (HindIII-EcoR V )立即-早期上遊片段的序列，被測序(Yin， 1991 ， Guinea pig cytomegalovirus immediate-early gene expression, PhD thesis, Pennsylvania State University, USA)，顯示包含重複序歹U的區±或， 這是典型的CMVIE調節區域。鑑定了三個短重複序列，GP-1、 GP-2和 GP-3 。 GP-1是 一 個出現9次的18-bp重複序列(與 GGCCCGGGACTTTCCA共有序列具有73-100^相似性)，包含NF-k B 結合位點，對應HCMV 18-bp重複序列。GP-2是一個出現10次的17-bp 重複序列(與TGTCCTTTTTGGCAAA共有序列具有86-100。/a目似性)， 包含與共有的SRE (血清應答元件)相似的核心序列。GP-3在接近上遊 區域重複4次，包含GTGACTTT，這個序列鑑定是c-jun或者GCN4的結 合位點(Hill等人，1984， Science 234: 451-457)。儘管這項工作表明GPCMV IE上遊區域包含強啟動子，但是由於報 告構建體的製備方式， 一些假象(artefacts)不能被排除。首先，HRv 片段看起來也包含IE1基因的第一個外顯子和第一個內含子的一部分。 這個內含子包含推定的NF-1結合位點的3個拷貝，它可以人為的促進啟 動子的顯著效果。其次，用於檢測GPCMV片段的報告構建體包含一個 SV40啟動子(自身是一個強病毒啟動子)，這樣的話報告表達來自與 雙GPCMV/SV40啟動子的效果。結果導致不可能將單用GPCMV增強子 /啟動子與其他強啟動子，或者甚至與其他CMV IE增強子/啟動子進行 比較。 本申請人的共同待決專利申請PCT/GB99/02357 (WO 00/05393)， 在此引入作為參考，描述了在其天然染色體環境中負責建立跨越一個 基因座的開放染色質結構的元件，所述基因座完全由遍在表達的持家 基因構成。這些元件不是來自基因座控制區(LCR)，包含擴展的無甲 基化CpG島。術語遍在染色質開放元件(UCOE)被用於描述這種元件。
在哺乳動物DNA中，二核苷酸CpG被DNA甲基化轉移酶識別，所 述DNA甲基化轉移酶將胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶。但是，5-甲基胞 噴啶不穩定，會轉化為胸腺嘧啶。結果就是，CpG二核苷酸比預想的偶 然出現的機率要少得多。不管怎麼說基因組DNA—些部分的CpG頻率 與預想的接近，這些序列已知為"CpG島"。此處使用的"CpG島"定 義為至少200bp的DNA序列，含有的GC含量至少為50X，並且觀察/預 測CpG含量的比例至少為0.6 (即CpG二核苷酸的含量至少是預想的偶 然出現的CpG二核苷酸的含量的60 % ) ( Gardiner-Green M和Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282 (1987); Rice P, Longden I和Bleasby A Trends Genet 16, 276-277 (2000))。
無甲基化的CpG島是本領域公知的(Bird等人(1985) Cell 40: 91-99, Tazi和Bird (1990) Cell 60: 909-920)，可以被定義為其中大部分胞嘧 啶沒有被甲基化的CpG島，所述CpG島通常跨越兩個在空間上接近(0.1-3kb)的趨異轉錄的基因的5'端。這些DNA區域據報導在整個發育 期間在所有組織中都保持低甲基化(Wise和Pravtcheva (1999) Genomics 60:258-271)。它們通常與廣泛表達基因的5'端，以及估計40%的顯示 組織限制性表達模式基因相關(Antequera， F. & Bird, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1195-11999 (1993); Cross, S.H.和Bird， A.P. Curr. Opin, Genet. Dev. 5, 309-314 (1995))，並且已知位於活性染色質區域(Tazi, J.和Bird, A. Cell 60, 909-920 (1990))。
"擴展的"無甲基化CpG島是一種無甲基化CpG島，它跨越包括超 過一個轉錄起始位點的區域和/或跨越超過300bp，優選超過500bp。通
過對該區域使用PCR並聯合限制性內切酶，對擴展的無甲基化CpG島的 邊界進行功能性定義，其中所述限制性內切酶在其識別序列消化(切割)DNA的能力對存在的任意CpG殘基的甲基化狀態敏感。 一種這樣 類型的酶是HpaII，它識別並消化通常出現在CpG島中的位點CCGG， 該位點但只是在中心CG殘基未被甲基化的情況下消化。因此，對Hpa n-消化的DNA進行的跨越包含HpaII位點區域的PCR不會產生擴增產 物，因為DNA未被甲基化會導致HpaII消化。只有DNA被甲基化，PCR 才會產生擴增產物。因此，在無甲基化區域之外，HpaII不會消化DNA， 可觀察到PCR擴增產物，因此可以定義"擴展的無甲基化CpG島"的邊 界。國際申請WO00/05393表明跨越無甲基化CpG島的區域，包括來自 人TATA結合蛋白(TBP) /蛋白體組件-Bl (PSMB1)和核內不均一核 糖蛋白A2/B1 (hnRNPA2) /異染色質蛋白lHsY (HPlHsY)基因座位的雙重趨異轉錄的啟動子，使可操作連接的基因表達水平增強。與活躍 轉錄啟動子相關的無甲基化CpG島具有改造染色質的能力，因此被認為是在看家基因座位建立和保持開放結構域的主要決定子。UCOE產生有效基因整合事件的比例增加，以及轉基因表達水平和 穩定性的增加。這具有重要的科研和生物技術應用，包括製備轉基因 動物和在培養的細胞中產生重組蛋白產品。WO00/05393公開了大約4.0kb的功能性UCOE片段，尤其是，圖21 的核苷酸4102到8286定義的"5.5RNP"片段(第11頁，第6和7行公開)。 相同申請公開了一個"1.5kbRNP"片段(圖22和29，衍生過程描述在 第51頁，第1到5行)。但是，這個片段實際是上述"5.5RNP"片段的 一個2165bp BamH I -Tthlll I片段，由該申請圖21的核苷酸4102到 6267組成。另一個申請WO 02/24930，公開了人工構建的UCOEs，由天然產
生的CpG島組成。第三個申請，WO 04/067701描述了包括UCOEs的小 功能片段的多核苷酸。這種多核苷酸包括不超過大約2kb的無甲基化 CpG島，或者更大的但不超過大約2kb的這種島的片段。考慮到生物技術中重組蛋白表達的重要性，仍然需要包括新的啟 動子/增強子組合的改進的表達載體。發明概述貫穿本說明書的描述和權利要求，詞"包含"和"包括"和這些 詞的變形，意思是"包括但不限於"，不是用於(也沒有)排除其也部 分、添加物、組分、整數或者步驟。貫穿本說明書的描述和權利要求，單數包括複數除非上下文另外 限定。尤其是，在使用不定冠詞時，說明書應該理解為包括複數以及 單數，除非上下文另外限定。與本發明的特定方面、實施方式或者實施例相關描述的特徵、整 數、特性、化合物、化學部分或者基團，應了解也可用於此處描述的 任何其他方面、實施方式或者實施例，除非與其不相容。此處使用的術語"可操縱連接的"涉及本發明多核苷酸中元件的 操縱性的關係。"可操縱連接的"是本領域技術人員公知的術語，描 述順式作用DNA序列間的功能關係。確切的結構關係可以是或可以不 是相關的，對不同類型的元件是有區別的。對啟動子來說，它距離其 驅動的開放閱讀框5'端非常接近(通常在少於100bp內)。在擴展的無 甲基化CpG島例子中，顯示對染色質結構的區域效應導致基因表達水平 和一致性的增加。在所述例子中，包含擴展的無甲基化CpG島的元件可 以位於控制可表達的基因轉錄的增強子/啟動子的5'端。但是，"可操 縱連接的"包括其位於其他地方的可能性，只要能夠證明明顯的功能 效果。"功能同源"是指在嚴謹條件下能夠與公開的序列雜交的多核苷 酸序列，所述序列具有能夠在兩種或多種組織中增加可操縱連接的的 可表達的開放閱讀框架的表達的類似性質。嚴謹的雜交/洗滌條件是本領域公知的。例如，在6(TC O.IXSSC、 0.1XSDS洗滌後穩定的核酸雜交物。如果核酸序列是已知的，可以計算出合適的雜交條件，這是本領域公知的。例如，可通過用於雜交的核酸的GC含量確定雜交條件。 參見Sambrook et al (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Approach。一個用於計算特定同源性的核酸分子間完成雜交所需的嚴謹條件的通 用公式是Tm = 81.5°C+ 16.6 Log [Na+] +0.41 [ % G + C]-0.63 (%甲醯胺)本發明的一個目的是提供包括轉錄增強子的新DNA分子和載體， 其中增強子能夠在真核細胞中提供可操縱連接的可表達的核酸序列的 非常高水平的表達。具有優勢的是增強子可以與其天然相聯的啟動子 和/或其他促進轉錄的遺傳元件聯用。本發明涉及豚鼠巨細胞病毒早期-立即啟動子/增強子及其在表達 載體中的應用，尤其是為了獲得重組蛋白高水平的表達。本發明提供 真核表達載體，所述載體能夠在許多細胞類型中提供比獲自人類或小 鼠CMV IE增強子/啟動子元件更高的表達水平。豚鼠巨細胞病毒早期-立即上遊調控區由IEl基因上遊的大約 1500bp組成，更具體的是

圖1和SEQ ID NO:l所示的序列。它包括啟動 子和增強子元件。提到"啟動子"至少表示轉錄起始位點，TATA盒和 CAAT盒，是包含圖l (SEQIDNO:l)的核苷酸779-880的片段或者其 功能同源物。因此，本發明提供分離分離的多核苷酸，包括至少100，優選200， 更優選至少500個如圖1和SEQ ID NO:l所示的豚鼠CMV立即/早期調控
區的連續多核苷酸以及可表達的多核苷酸序列，所述可表達的多核苷 酸序列的轉錄被位於增強子和基因之間或者其他可表達序列間的啟動 子驅動，所述啟動子可以是內源性的豚鼠CMV立即/早期啟動子或者一些其他異源的與增強子不是天然相聯的啟動子。可表達的多核苷酸序列不是豚鼠CMV立即/早期基因，不是與啟動子天然可操縱連接的。本領域技術人員應該了解，在環形分離的多核苷酸(如在質粒載體中) 情況下，"之間"表示直接可操縱連接的可表達多核苷酸序列的上遊(就正義鏈而言是5')，及可操縱連接的增強子的下遊(3')。應了解這種分離的多核苷酸可以包括不與感興趣的插入的可表達序列的表達 相聯的其他啟動子(例如那些表達選擇標記物所需要的啟動子或者那 些與其他元件相聯的啟動子)。因此分離的多核苷酸包括a) 包括SEQ ID NO:1的至少200個，優選至少500個連續核苷酸的 元件和b) 包括可表達的多核苷酸序列的元件；其特徵在於所述分離的多核苷酸包括，按可表達的多核苷酸序列 的正義鏈從5'至3'方向，增強子，單一啟動子和所述可表達的多核苷酸序列，其中所述增強子與所述啟動子可操縱連接，所述啟動子與所述 可表達的多核苷酸序列直接可操縱連接，其中所述啟動子與所述表達 多核苷酸序列不是天然可操縱連接的。優選分離的多核苷酸包括立即/早期調控區的包含核苷酸50至550 的5'片段，或者，包括核苷酸275至775的3'片段。這種片段包括功能性 增強子片段，而沒有內源性啟動子。在一個實施方案中，因此，本發明分離的多核苷酸包括至少來自 豚鼠CMV的立即/早期調控區的啟動子與不是天然可操縱連接的的可 表達核酸序列直接可操縱連接，所述啟動子優選包括SEQIDNO:l的核 苷酸779至880。"直接可操縱連接的"表示基因或者其他可表達的核
酸的轉錄被啟動子直接驅動。優選，所述的分離的多核苷酸還包括來自豚鼠CMV的主要立即/早期調控區的增強子，更優選包括SEQIDNO:l的核苷酸l至887。在一個優選實施方案中，所述分離的多核苷酸還包括擴展的、無 甲基化CpG島，所述CpG島與所述可表達核酸序列可操縱連接。更優選， 所述擴展的、無甲基化CpG島包括一個或多個另外的啟動子，尤其是趨 異轉錄的二元或者雙向啟動子。因此本發明提供包括圖l (SEQ ID NO:l)的至少200個連續核苷酸的分離的核苷酸，與可表達的多核苷酸 序列可操縱連接，還包括與所述可表達的核酸序列可操縱連接的的擴 展的、無甲基化CpG島。這種擴展的、無甲基化CpG島可以方便的置於 增強子序列的鄰近或者上遊。優選這種分離多核苷酸包括至少圖1(SEQ IDNO:l)的500個連續多核苷酸，更優選立即/早期調控區的包括核苷 酸50至550的5'片段，或者，包括核苷酸275至775的3'片段。最更優選它 包括SEQ ID NO:l的核苷酸l至887。在一個實施方案中，所述擴展的、無甲基化CpG島包括44kbDNA 片段，跨越人TATA結合蛋白基因和12kb 5'和3'側翼序列，或其功能片 段。優選，功能片段包括25kbDNA片段，跨越具有lkb 5'和5kb 3'側翼 序列的人TATA結合蛋白或者其功能片段。更優選，TATA結合蛋白基 因相聯的擴展的、無甲基化CpG島的功能片段不超過2kb，更優選僅為 大約lkb，最優選包括987bpBspEl -Esp31限制片段。在第二個實施方案中，所述擴展的、無甲基化CpG島包括60kb DNA片段，跨越具有30 kb 5'和20 kb 3'側翼序列的人hnRNP A2基因， 或者其功能片段。優選，所述功能片段包括16kbDNA片段，跨越具有 5kb 5'和1.5kb 3'側翼序列的人hnRNP A2基因，更優選不超過2kb的人 hnRNP A2基因的片段，最優選不超過1.6kb，包括1546bp Esp31限制片 段。優選，所述片段方向為正向。 在第三個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸包括e-肌動蛋白CpG島/啟動子區域的片段，優選人源的，更優選範圍在100bp至2kb的 跨越人e-肌動蛋白CpG島/啟動子區域的DNA片段。在第四個實施方案中，本發明的分離的多核苷酸包括PDCD2CpG 島/啟動子區域的片段，優選人源的，更優選範圍在100bp至2kb的跨越 人PDCD2 CpG島/啟動子區域的DNA片段。在最後另一個實施方案中，所述擴展的、富含CpG的無甲基化CpG 島是一個人工序列，天然不存在，包括範圍在lOObp至1.9kb的跨越人0 -肌動蛋白CpG島/啟動子區域的DNA片段和範圍在100bp至2kb的跨越 人PDCD2 CpG島/啟動子區域的DNA片段。優選所述片段與其趨異定向 的啟動子直接毗連。本發明的另一方面提供了包括上述分離多核苷酸的載體。載體可 以是任意能夠將DNA轉移到細胞的載體。優選載體是真核表達載體。 這種載體包括能夠指導和增強真核細胞轉錄的元件，諸如啟動子和增 強子。優選它們優選還包括其他促進和優化其功能的特點。這些特點 包括選擇的複製起點以便在合適的真核宿主細胞和原核細胞中複製用 於製備載體自身， 一種或多種選擇標記物(通常是對抗生素或者毒素 產生抗性)以便在兩種細胞類型中選擇包含載體的細胞，允許載體擴 增或其片段整合的元件，和方便的位於主要增強子/啟動子下遊的多接 頭或者多克隆位點以便方便的插入編碼所需多肽產物的可表達的多核 苷酸序列(通常稱為"插入物")。這種優化是本領域公知的。優選，載體是整合型載體或者游離型載體。優選整合型載體包括重組逆轉錄病毒載體。重組逆轉錄病毒載體 包括逆轉錄病毒基因組的至少部分DNA，所述部分能夠感染靶細胞。
使用的術語"感染"表示病毒將遺傳材料轉移到宿主或者靶細胞的過 程。優選，用於構建本發明載體的逆轉錄病毒是複製缺陷型的，以去 除靶細胞的病毒複製的影響。在這些例子中，根據常規技術可以通過 輔助病毒包裝複製缺陷型病毒基因組。通常，任何滿足上述感染標準 和能夠進行功能基因轉移的逆轉錄病毒均可用於本發明。合適的逆轉錄病毒包括但不限於pLJ、 pZip、 pWe和pEM，這是本 領域技術人員公知的。用於複製缺陷型逆轉錄病毒合適的包裝病毒系 包括，例如iACrip、 ^Cre、 1//2禾卩0Am。用於本發明的其他載體包括腺病毒、腺相關病毒、SV40病毒、牛 痘病毒、HSV和痘病毒載體。優選載體是腺病毒。腺病毒載體是本領 域技術人員公知的，已經被用於遞送基因到許多細胞類型，包括氣道 上皮、骨骼肌、肝、腦和皮膚(Hitt等人，1997; Anderson, 1998)。另一個優選載體是腺相關病毒(AAV)載體。AAV載體是本領域 技術人員公知的，已經被用於穩定轉導人T-淋巴細胞、成纖維細胞、鼻息肉、骨骼肌、腦、類紅細胞和造血幹細胞用於基因治療用途。國際 專利申請WO 91/18088描述了特定的基於AAV的載體。優選游離型載體包括瞬時非複製型游離載體，和自主複製型游離 載體，它們具有衍生自諸如那些來自EBV、人乳多空病毒(BK)和BPV-1的病毒複製起點的功能。這種整合型和游離型載體是本領域技術人員 公知的，在本領域技術人員公知的文獻中有完整描述。尤其是，合適 的游離型載體描述在WO 98/07876。哺乳類人工染色體可在本發明中用作載體。Calos (1996)討論了 哺乳類人工染色體的用途。在一個優選實施例中，本發明的載體是質粒。質粒可以是非複製 型、非整合型的質粒。此處使用的術語"質粒"是指編碼可表達的基因的任意核酸，包 括線性或者環狀核酸以及雙鏈或者單鏈核酸。核酸可以是DNA或者RNA，可以包括修飾的核苷酸或者核糖核苷酸，可以通過諸如甲基化或者添加保護基團或者帽-或者尾結構的方法進行化學修飾。當轉染入宿主細胞時，非複製型、非整合型質粒不複製，也不特 異整合入宿主細胞的基因組(即不以高頻率整合，不整合在特異位點)。本發明載體的高度優選實施方案包括SEQ ID NO: 2的核苷酸1至 1003和1747至5749; SEQ ID NO: 3的核苷酸1至9328和10072至14119; 或者SEQ ID NO: 4的核苷酸1至2592和3336至7383，該表達載體適合在 完整序列編碼的示例增強綠色螢光蛋白報告基因的位置插入可表達的 序列。本發明還提供轉染本發明載體的宿主細胞。宿主細胞可以是任意 真核細胞。優選是哺乳動物細胞，更優選是人或者齧齒動物細胞。已知許多技術可用於根據本發明所述將載體遞送到細胞，包括使 用核酸凝聚劑、電穿孔、與石棉絡合、聚凝胺(polybrene) 、 DEAE纖 維素、葡聚糖、脂質體、陽離子脂質體、脂多胺、聚鳥氨酸、粒子轟 擊和直接顯微注射。通過病毒或者非病毒遞送方法，本發明的載體可以非特異或特異 的(即到指定亞型的宿主細胞)遞送到宿主細胞。優選病毒來源的遞 送方法包括產生病毒顆粒的組裝細胞系作為本發明載體的轉染受體， 其中設計了病毒包裝信號，例如那些腺病毒、皰疹病毒和乳多空病毒 的信號。在本發明中還可使用優選基於非病毒的遞送方式和方法，包 括直接裸核酸注射、核酸凝集肽和非肽，陽離子脂質體和包裹在脂質 體中。構思使用核酸凝集肽遞送本發明的載體。核酸凝集肽對凝集載體並將其遞送到細胞非常有效，在國際專利申請WO 96/41606中有描述。 WO 96/41606描述了官能團可以結合到肽上以便遞送本發明的載體。這 些官能團可以包括靶向特定細胞類型的配體，例如單克隆抗體、胰島 素、轉鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白，或者糖。因此配體可以釆用非特異 方式或者特異方式靶向定位細胞，這受細胞類型的限制。官能團還可以包括脂、例如棕櫚醯、油醯、或者硬脂醯；中性親 水聚合物例如聚乙二醇(PEG)或者聚乙烯吡咯烷(PVP);融合肽例如流感病毒的HA肽；或者重組酶或者整合酶。官能團還包括細胞內運輸蛋白例如核定位序列(NLS)，內含體逃逸信號例如破膜肽，或者指 導細胞直接到細胞質的信號。本發明還提供包含此處所述的分離的多核苷酸或者載體的宿主細 胞。優選所述細胞是真核細胞，更優選哺乳動物細胞，更優選人或齧 齒動物細胞。在另一方面，本發明提供表達可表達的多核苷酸的方法，優選該 多核苷酸編碼多肽，包括將本發明的分離的多核苷酸插入到此處所述 的合適表達載體，然後將所述載體插入到此處所述合適的宿主細胞， 在合適條件下培養所述宿主細胞以獲得表達。優選，所述多肽是對治療有用的多肽，優選選自免疫球蛋白或者 免疫球蛋白的功能性表位-結合片段、生長因子、受體或其可溶性片段 和血液凝集因子。本發明還提供包括本發明多核苷酸、載體或者宿主細胞和製藥上 可接受的載體、賦形劑、緩衝劑或者介質的藥物製品。
附圖簡述圖l顯示GPCMVIE增強子/啟動子(SEQ IDNO:l)的核苷酸序列。 顯示轉錄因子AP-1， NF-kB， SRF和GCN4的潛在結合部位，以及CAAT 和TATA盒，CRS起始位點和轉錄起點(箭頭)。圖2顯示通過許多EGFP報告構建體獲得的CH0-K1細胞中的表達 水平，表示為通過FACS檢測的螢光中值。結果比較人和豚鼠GPCMV IE 增強子/啟動子，具有和不具有1.5kbhnRNPUCOE元件。圖3顯示報告質粒CET 1005 GPCMV-EGFP的圖譜，包括驅動增強 綠色螢光蛋白報告基因(EGFP)表達的GPCMV IE增強子/啟動豐 (GPCMV)，。真核選擇標記物是表達自小鼠磷酸甘油酯激酶啟動子的 嘌呤黴素抗性基因。原核選擇標記物是氨苄抗性。圖4顯示報告質粒CET1015 8kb-GPCMV-EGFP的圖譜。這與CET 1005 GPCMV-EGFP相似，且在GPCMV IE增強子/啟動子上遊添加8kb hnRNP UCOE。圖5顯示報告質粒CET1015 1.5kb-GPCMV-EGFP的圖譜。這與 CET1015 Skb-GPCMV-EGFP相似，除了用1.5kb hnRNP UCOE元件替代 8kbhnRNP UCOE。圖6比較HEK293細胞(剪切的腺病毒5型DNA轉化的人胚腎細胞) 中人和豚鼠CMV IE增強子/啟動子元件驅動的EGFP表達。圖7顯示使用基於螢光酶的報告構建體的相似比較。詳細描述實施例l使用包括hCMV啟動子或者gpCMV啟動子的載體產生穩定轉染的 CHO-Kl細胞按以下方式製備質粒構建體。氨苄抗性基因通過PCR從 pBluescript ( Stratagene ) 分 離 ， 在 弓l 物 5'-TGTCGCGAGTCTGACAGTTACCAATGCT TAATC 3' ( SEQ ID NO: 5)， 5'-CATCGCGAGCACTTTTCGGGGAAAT GTGTGCGC誦3' (SEQID
NO: 6)的每個末端引入Nru I位點。PCR產物插入pMaeII的PvuII位 點(Nucleic Acids Research 2001 29:E26)產生pCAl。下述寡核苷酸1.5'- TCGAAGTTTAAACATTTAAATCTAGAAGCTTAT-3'(SEQ ID NO :7)2. 5'-CCGGTATCGATAAGCTTCTAGATTTAAATGTTTAAACT-3'(SEQ ID NO:8)3'(SEQ ID NO:9)4. 5'-CCCATTGGGCCAGATCTTAATTAACAATTGGCGCGCCA-3'(SEQ ID NO: 10)5. 5'-CCCAATGGGCCGTACGAATTCCTTAGGCTCGAG-3' (SEQ ID NO: 11)6. 5'-GGCCCTCGAGCCTAAGGAATTCGTACGG-3' (SEQ ID NO:12)進行退火(1和2; 3和4; 5和6;然後三個二聚體再一起進行退火)，用於代替Xho I和Not I位點間pCAl的多克隆位點，在構建過程中這些 位點被破壞。這產生pCAlMCS。通過AgeI限制性消化，Age I位點從 pPGK-Puro-bgh pA內的PGK啟動子中去除，然後用T4 DNA聚合酶補平 並再連接。PGK-嘌呤黴素pA盒作為EcoR I -Xho I片段從這個載體移 除，連接入用EcoRI和Xho I進行相似消化的pCAlMCS。這個載體命 名為pCIA-Puro (CET 1000) 。 pCIA-Puro中的bghpA用HSV TkpA代替。 HSV-Tk polyA作為Ssffi I -Ecol09 I片段從pEGFP-Nl移除，用T4 DNA聚合酶補平，連接入經過Sac I消化和T4 DNA聚合酶補平的 pCIA-Puro。這個載體命名為CET 1005。為構建pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP，用BsmB I從pCET20 (前
述)切下1.5kbhnRNPUCOE片段，利用T4 DNA聚合酶補平，然後克隆 入pEGFP-Nl (Clontech, Palo Alto,CA, USA)補平的XhoI位點，產生 pEGFP-Nl 1.5kb-EGFP。然後用Nhe I (平端)/Not I從這個質粒切下 2.4kb " hnRNP-EGFP "盒，亞克隆入已經用Swa I /Not I消化的 pCET1005-EGFP骨架，得到pCET1005 1.5kb-EGFP。然後用Nhe i和 EcoR I從pPCRScript GPCMV (由Geneart， Regensburg， Germany合成) 切下GPCMV啟動子，補平，亞克隆入這個質粒補平的BamH I ，產生 pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP。禾u用Pme I/Sac I切下1.5kb hnRNP UCOE，補平，重新連接骨架產生質粒pCET1005 GPCMV-EGFP。為構建pCET1015 8kb-GPCMV-EGFP， pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP的5.3kb Sac i (平端)/Pac i片段亞克隆入pCET1015的Asc I (平 端)/Pac i -消化的骨架。通過將來自pCET20補平的1.5kb hnRNP BsmB i片段亞克隆入pCET1005-EGFP補平的Cla I位點，構建質粒pCET1005 1.5kb-HCMV-EGFP。CH0-K1在F12 (HAM)營養混合物(Gibco，UK)中培養，其中 添加10%胎牛血清(Invitrogen, UK) ， 5 U/ml青黴素和鏈黴素混合物(Sigma，UK)。為穩定轉染CH0-K1，質粒用Pci I線性化，在酚氯 仿異戊醇和氯仿抽提，乙醇沉澱，重懸於無菌水中，濃度為0.25/ig/Ml。 在無菌電穿孔杯中，等摩爾量的線性化質粒在無菌水中稀釋到25/xl(1.39|tig pCET1005-EGFP, 1.78pg pCET1005 1.5kb-HCMV-EGFP, 1.45pg pCET1005 GPCMV-EGFP 或者 1.85/xg pCET1005 1.5kb-GPCMV-EGFP)，與5xl06 CHO-K1細胞在250/U生長培養基中 混合。在冰浴15分鐘後，細胞在250V/975mF電穿孑l(BioRad Gene Pulser II )，在室溫繼續孵育10分鐘。然後將細胞轉移到10ml生長培養基， 離心收集，轉移到225 cn^組織培養瓶，總體積50ml生長培養基。在 加入嘌呤黴素(Sigma，UK)至濃度12.5/xg/ml前，細胞在37°C 5% C02 孵箱中孵育24小時。在收集穩定轉染子前，細胞培養8天(4天後替 換選擇培養基)，亞培養至6孔組織培養板(維持選擇壓力)，使用21
螢光激活細胞分類術進行分析，利用FL1通道觀察EGFP。圖2清楚顯 示兩個包含gpCMV的構建體pCET1005- GPCMV-EGFP (圖3)和 pCET1005-1.5kb-GPCMV-EGFP (圖5)比使用hCMV啟動子的相應 構建體，pCET1005-EGFP禾a pCET1005-1.5kb-HCMV-EGFP，產生表達 轉基因的水平更高的細胞群。實施例2HEK293細胞在Dulbecco，s Eagle培養基(DMEM; Sigma, UK)中 培養，其中添加10。/。胎牛血清及5U/ml青黴素和鏈黴素混合物(Sigma， UK)。為穩定轉染，HEK293細胞以lxl(^細血/孔密度接種於6孔板， 然後在37。C 5% (302孵箱中孵育24小時。然後用10pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, UK)將4/^所示質粒(pCET1005-EGFP or pCET1005-gpCMV-EGFP)(用Pd I線性化)轉染細胞。DNA和Lipofectamine 2000分另iJ在250jLi1 OptiMEM I (Gibco， UK) 中稀釋，在室溫孵育5分鐘後，混合然後再孵育20分鐘。細胞的生長培 養基替換成lml添加15 % FCS的OptiMEM I ， 然後加入 DNA/Lipofectamine 2000混合物。在加入3.5ml添加10% FCS的OptiMEM I前，細胞在37。C 5% C02孵箱中孵育5小時。收集前細胞在37。C 5% C02 孵箱中孵育24小時，然後轉移到225 cn^組織培養瓶，總體積50ml DMEM生長培養基，添加0.5pg/ml嘌呤黴素。在離心收集穩定轉染子前， 細胞生長大約14天(每隔3-4天更換選擇培養基)，亞培養至6孔組織培 養板(維持選擇壓力)，使用螢光激活細胞分類術進行分析，利用FL1 通道觀察EGFP。圖6顯示用gpCMV構建體產生細胞群表達EGFP的水平 比用hCMV構建體產生的細胞群高3-4倍。實施例3按實施例1所述培養CH0-K1細胞。轉然到12孔前24小時接種 1.5xl05 CH0-K1細胞。24小時後，用1.5 pl FUGENE (Roche，UK)將l /xg螢光酶報告質粒(phCMV-LucorpgpCMV-Luc)轉染細胞。為此，FUGENE和DNA分別稀釋到Opti-MEM I (Invitrogen)中，混合，加入 到細胞中前在室溫孵育30分鐘。24小時後用Berthold光度計(Berthold, Wildbad， Germany)分析螢光酶表達。通常，按先前所述迸行細胞裂解 和螢光酶報告分析(Lipinski等人，Gene Therapy, 2001 (8): 274-281)。 轉染進行3個復孔，每個代表性試驗的平均和標準差被顯示(圖7)。 很清楚gpCMV載體的螢光酶活性比hCMV質粒高至少2倍。在先前已經有質粒hCMV-Luc的描述(Lipinski等人，Gene Therapy (2001) 8: 274-281)。通過從pCRScript/gpCMV (用戶基因合成公司 Ge認rt, Regensburg， Germany)製備Nde I /EcoR I片段，並將這個 gpCMV啟動子片段克隆入pGL3basic (Promega)補平的Xho I位點，產 生質粒gpCMV-Luc。
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，包括a.包括SEQ ID NO1的至少200個連續核苷酸的元件和b.包括可表達的多核苷酸序列的元件；其特徵在於所述分離的多核苷酸按可表達的多核苷酸序列的正義鏈從5』至3』方向包括，增強子，單一啟動子和所述可表達的多核苷酸序列，其中所述增強子與所述啟動子可操縱連接，所述啟動子與所述可表達的多核苷酸序列直接可操縱連接，其中所述啟動子與所述可表達的多核苷酸序列不是天然可操縱連接的。
2. 根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，包括SEQIDNO:l的 至少500個連續核苷酸。
3. 根據權利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括SEQ ID NO:l的核苷酸50至550。
4. 根據權利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括SEQ ID N0:1的核苷酸275至775。
5. 根據權利要求1或者2所述的分離的多核苷酸，包括來自豚鼠 CMV的立即/早期調控區的啟動子，所述啟動子與不是與其天然可操縱 連接的可表達的核酸序列直接可操縱連接。
6. 根據權利要求5所述的分離的多核苷酸，包括SEQIDN0:1的 核苷酸679至880。
7. 根據前述權利要求中任意一項所述的分離的多核苷酸，包括 SEQ ID N0:1的核苷酸1至887。
8. 根據前述權利要求中任意一項所述的分離的多核苷酸，還包括 與所述可表達的核酸序列可操縱連接的擴展的、無甲基化CpG島。
9. 一種載體，包括前述權利要求中任意一項所述的分離的多核苷酸。
10. 根據權利要求9所述的真核表達載體。
11. 根據權利要求9或者IO所述的載體，包括SEQIDNO:2的核 苷酸1至1003和1747至5749的多核苷酸序列。
12. 根據權利要求9或者10所述的載體，包括SEQ ID N0:3的核 苷酸1至9328和10072至14119。
13. 根據權利要求9或者10所述的載體，包括SEQ ID NO:4的核 苷酸1至2592和3336至7383。
14. 一種宿主細胞，包括權利要求1至5中任意一項所述的分離 的多核苷酸，或者權利要求11至13中任意一項所述的載體。
15. —種表達多肽的方法，包括將編碼所述多肽的可表達的核酸 序列插入根據權利要求11至13中任意一項所述的表達載體，再導入 合適宿主細胞，並且在合適條件下培養所述宿主細胞以允許表達。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述多肽是治療有用的多肽。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述的多肽選自免疫球蛋 白，免疫球蛋白的功能性表位-結合片段，生長因子，可溶性受體和血 液凝集因子。
18. —種藥物製品，包括權利要求1至8中任意一項所述的多核苷酸，權利要求11至13中任意一項所述的載體，或者權利要求14所述的宿主細胞，和製藥上可接受的載體、賦形劑、緩衝劑或者介質。
全文摘要
本發明涉及重組DNA技術領域，尤其是開發用於重組蛋白表達的載體。異源基因在真核細胞中的表達需要RNA聚合酶II進行轉錄，這是被已知為啟動子和增強子的順式作用遺傳元件驅動的。本發明提供一種用於獲得高水平重組蛋白表達的啟動子，所述啟動子來自豚鼠巨細胞病毒的早期-立即啟動子/增強子。本發明還公開了包含這種啟動子的真核表達載體，在許多細胞類型中所述載體能夠提供比可從人或小鼠巨細胞病毒的增強子/啟動子元件獲得的表達更高的表達水平。
文檔編號C12N15/85GK101120093SQ200680005299
公開日2008年2月6日 申請日期2006年3月3日 優先權日2005年3月5日
發明者喬納森·高恩, 史蒂文·傑蘭特·威廉士, 阿利斯泰爾·辛普森·歐文 申請人:密理博公司