一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法與流程
2023-06-13 12:02:46 2
本發明涉及一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
膽鹽水解酶(BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內酶，廣泛存在於腸道微生物中，是降解膽汁的主要組成成份——共軛膽酸第一步所需的酶。膽酸鹽水解酶可將共軛膽酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游離膽酸，後者可由其它腸道微生物在腸道內作進一步降解。膽酸鹽水解酶的生理作用體現在兩個方面：一、影響宿主的脂肪代謝過程，減少脂肪的消化吸收和降低膽固醇水平等；二、膽汁的降解減少了膽汁對腸道微生物的毒性，改善了微生物生存的腸道環境；由降解產生的胺基酸和游離脂肪酸還可為微生物提供營養物質。
由於膽鹽水解酶通常來源於乳酸菌等微生物中，其生長環境和發酵強度不適合大規模工業化生產。另一方面，目前報導的多數膽鹽水解酶表達量低，易形成包涵體。因此，篩選一種能夠酶活較高並能高效表達的膽鹽水解酶基因對於工業化生產膽鹽水解酶，及運用膽鹽水解酶調節生物機體健康狀況具有重要意義。
畢赤酵母宿主雖然具有表達蛋白易於純化等優點，然而目前的膽鹽水解酶在畢赤酵母中表達時，存在表達量不高或者是外源基因原始核苷酸序列並不十分適合於畢赤酵母宿主的問題，從而限制了膽鹽水解酶在畢赤酵母中的高效表達，酵母真核表達系統中存在的糖基化現象對鹼性果膠酶的高效表達及性質存在極大影響。
技術實現要素：
本發明提供一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法，所述方法在產膽鹽水解酶的畢赤酵母的發酵培養基中添加80～120mg/L的粟精胺、30～60mg/L Fe2+，並將所述畢赤酵母在30℃，200～220rpm發酵24～48h。
在本發明的一種實施方式中，所述產膽鹽水解酶的畢赤酵母是以pichia pastoris GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達SEQ ID NO.1所示基因的重組畢赤酵母。
在本發明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母還具有α-MF信號肽。
在本發明的一種實施方式中，所述發酵是以按體積比1-5％的接種量將畢赤酵母接種至發酵培養基中，20～28℃，200～220rpm下發酵。
在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基配方包括：蛋白腖20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L。
在本發明的一種實施方式中，所述Fe2+為FeCl2。
在本發明的一種實施方式中，所述發酵前還進行活化。
在本發明的一種實施方式中，所述活化是挑取畢赤酵母單菌落，接種至BMGY培養基中，30℃，200～220r/min培養16-24h。
在本發明的一種實施方式中，所述BMGY培養基含有蛋白腖20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，
本發明還提供所述的方法在製備含膽鹽水解酶的產品中的應用。
有益效果：本發明提供了一種利用粟精胺和Fe2+提高畢赤酵母膽鹽水解酶分泌效率的方法，使發酵3d膽鹽水解酶酶活達14.96U/mL，與未外源添加物質相比(實施例3)提高了1.74倍。
具體實施方式
LB培養基：酵母提取物5g/L，蛋白腖10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培養基：胰蛋白腖20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
MD培養基：YNB 13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素4×10-4g/L。
BMGY培養基：蛋白腖20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩衝液。
BMMY培養基：蛋白腖20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸鹽緩衝液。
膽鹽水解酶酶活測定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)稀釋至90μL，加入10μL結合膽鹽(200mM)混合，於37℃孵育30min，加入等體積的15％(w/v)三氯乙酸終止反應，離心後取10μL上清液與190μL茚三酮試劑混合，於100℃反應15min，冷卻後於570nm處測定吸光值，根據甘氨酸標準曲線進行計算。其中，茚三酮試劑的組成為：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解於0.5M、pH5.5檸檬酸鹽緩衝液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的檸檬酸緩衝液。
具體實施方式中選用牛磺脫氧結合膽鹽測定酶活。
實施例1重組質粒的構建及鑑定
將植物乳桿菌來源的bsh基因(NCBI登錄號為)進行密碼自由化，並通過化學合成獲得序列如SEQ ID NO.1所示序列，設計引物，通過融合PCR將SEQ ID NO.1所示序列與信號肽α-MF連接，柱回收產物獲得融合片段。將融合片段αMF-bsh和pPIC9K質粒16℃過夜連接。連接產物pPIC9K-αMF-bsh化學法轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞。將轉化液塗布於含50mg/L卡那黴素的LB平板，提取質粒測序驗證構建的重組質粒。
實施例2產膽鹽水解酶的重組畢赤酵母的構建
將重組質粒pPIC9K-αMF-bsh線性化，電擊轉化至pichia pastoris GS115感受態細胞，具體方法如下：
(1)接種YPD平板活化的pichia pastoris GS115於25mL/250mL三角瓶，30℃過夜培養；以1％(按體積比)接種上述培養液於含50mL/500mL培養基的三角瓶，培養菌體濃度OD600為1.3～1.5；
(2)5000r/min，4℃離心10min收集菌體，分別用50mL、25mL無菌水懸浮細胞；
(3)5mL 1M山梨醇重懸上述細胞，5000r/min，4℃離心10min收集菌體；
(4)500μL 1M山梨醇重懸上述細胞，分裝80μL/1.5mL EP管用於電轉化感受態細胞；5)20μL線性化質粒與上述80μL感受態細胞混合，冰上靜置15min；
(5)上述混合物加入預冷的無菌電轉化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω電擊一次，加入1mL1M山梨醇；
(6)取上述混合物150μL塗布MD平板，30℃培養3天；
(7)挑取陽性克隆，分別點種在1、2、3、4mg/mL(遺傳黴素)YPD平板中，挑選在4mg/mL遺傳黴素平板中的單菌落用於搖瓶發酵。
實施例3
將本發明構建的工程菌作為生產菌株，在YPD平板活化。種子液培養，接種50mL/250mL種子培養基，30℃，220r/min培養24h。離心種子液，按發酵培養基中種子終濃度為OD600＝1接種發酵培養基，28℃，220r/min培養3d。測定膽鹽水解酶胞外酶活為5.46U/mL。
實施例4
按實施例3的方法培養和發酵，其區別在於，分別向發酵培養基中添加100mg/L的粟精胺、苦馬豆素和衣黴素，發酵結束後測定膽鹽水解酶酶活，結果顯示，添加粟精胺、苦馬豆素和衣黴素後發酵3d膽鹽水解酶酶活分別為7.49U/mL，5.18U/mL，6.16U/mL。
實施例5
按實施例3的方法培養和發酵，其區別在於，分別向發酵培養基中添加20～140mg/L(每20mg/L為一個梯度)的粟精胺，發酵結束後測定膽鹽水解酶酶活，結果如表1所示，添加80～120mg/L的粟精胺可將膽鹽水解酶酶活提高了125％以上。
表1不同濃度粟精胺對膽鹽水解酶酶活的影響
實施例6
按實施例3的方法培養和發酵，其區別在於，分別向發酵培養基中添加50mg/L的金屬鹽離子，以未添加金屬鹽離子的胞外酶活為100％，測定培養基添加不同金屬鹽離子後膽鹽水解酶酶活，結果如表2所示。添加鐵離子的發酵液中膽鹽水解酶酶活提高至159.17％。
表2各種金屬離子對膽鹽水解酶酶活的影響
實施例7
按實施例3的方法培養和發酵，其區別在於，向發酵培養基中添加50mg/L的Fe2+離子，並添加100mg/L粟精胺，測定發酵結束後膽鹽水解酶酶活，結果顯示，發酵3d膽鹽水解酶酶活達14.96U/mL，與未外源添加物質相比(實施例3)提高了1.74倍。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
SEQUENCE LISTING
曹書華
一種提高膽鹽水解酶分泌效率的方法
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PatentIn version 3.3
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DNA
人工序列
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