從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的dna的方法

2023-06-02 05:21:51

專利名稱：從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的dna的方法
技術領域：
本方法涉及深度加工食品中轉基因成分的檢測技術，尤其是從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的模板DNA的方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的快速發展，大量以轉基因作物為加工原料的轉基因食品進入商品化生產和銷售，據國際權威機構統計，全球由轉基因作物加工生產的轉基因食品和食品成分達4000餘種(參見U.S.Food and Drug Administration，Office of Food Additive Safety.Listof Completed Consultations on Bioengineering Food[DB/OL].http//www.fda-cfsan/biotechnology.2002-10.)。目前對轉基因食品的安全性尚有爭議。
轉基因食品的潛在的風險引起世界各國政府極大關注，因此紛紛出臺轉基因食品的標籤管理制度和出入境產品報告制度。聯合國和歐盟的要求更為嚴格，規定轉基因食品從研究、生產、運輸、貯存、銷售到進出口等所有環節都需要檢測監控，因此轉基因產品的檢測鑑定成為各主要貿易國檢驗的一項重要工作，並建立相關的標準化檢測體系，以適應於各種轉基因食品的檢測(參見朱光富，世界各國對轉基因食品的態度和管理，糧油食品科技，2001，31-5)。
使用PCR方法檢測深加工食品中的轉基因成分，所面臨的最大挑戰是如何有效地從眾多深度加工產品中提取到用作PCR反應模板的DNA成分，其DNA提取的難度不僅在於加工過程中DNA遭到嚴重破壞，而且加工過程中產生的物理、化學或生物等因子還會影響到DNA質量。不同的加工程序產生的各類不同的深加工製品，其DNA的降解程度和產品中DNA的殘餘量大不相同，因此開發針對不同產品轉基因檢測的模板DNA提取技術，是深加工食品轉基因成分檢測的關鍵。

發明內容
本方法旨在建立從以轉基因番茄加工而成的番茄醬中提取模板DNA，用於轉基因成分的PCR檢測。
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，它可以快速、簡便、可靠、高效率地從番茄醬類深加工食品中將模板DNA提取出來，用於轉基因成分的定性檢測，以確保檢測的可靠性。
本方法針對番茄醬的pH值較低(2.0-3.0)的特點，在正式進行DNA提取之前，必須將沉澱下來的番茄醬的pH值提高到近中性。為此在加入樣品的預處理過程中，利用0.1mol/L Tris(pH8.0)緩衝溶液反覆洗滌番茄醬沉澱，使番茄醬沉澱的pH值提高到7.0以上，這樣在加入溴代十六烷基三甲胺提取液時，可使整個提取緩衝體系的pH值保持在8.0左右，這是DNA提取所必須的。
本發明的技術方案概述如下從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，它由下述步驟組成1.將番茄醬離心，沉澱，取2-4g沉澱，用1-3倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌3-5次。
2.將步驟1獲得的沉澱2-4g，加入10-15mL經65℃預熱的溴代十六烷基三甲胺提取緩衝液，混勻，65℃水浴1-1.5小時，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次。
3.取出靜置冷卻至20-25℃，於12000轉/分鐘，離心12分鐘，取上清。
4.加入與步驟3所得到的上清液等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，10000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清，再加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇抽提一次，取上清。
5.加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置50-90分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
6.沉澱加入1.2mol/L NaCl溶液1mL，溶解沉澱，20-25℃靜置5分鐘，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，顛倒搖勻1分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清。
7.加入所取上清液1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預冷異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000轉/分鐘，離心15分鐘，棄上清。
8.用4℃預冷400μL體積百分比為70％的乙醇洗滌沉澱，除去殘留的乙醇，乾燥沉澱，得到DNA沉澱。
9.加入25-35μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
本發明的有益效果是有效地使番茄醬沉澱的pH值提高到7.0以上，滿足了轉基因成分檢測的要求，此方法快速、簡便、特異性強，效率高，適合番茄醬類製品中轉基因成分的PCR檢測。


圖1番茄醬DNA的內源特異參照PG34基因的PCR擴增結果(1.DNA Marker；2.鮮番茄；3.番茄種子；4.番茄醬)具體實施方式
1.材料和試劑1)材料番茄醬樣品購自超級市場，對照為鮮番茄和番茄種子。
2)提取試劑DNA提取緩衝液(1L)1000ml水中溶解溴代十六烷基三甲胺20g，Tris 12.114g，NaCl 81.816g，Na2EDTA 7.444g，PVP[聚乙烯吡咯烷酮]20g，高壓滅菌。
溴代十六烷基三甲胺沉澱液(1L)1000ml水中溶解溴代十六烷基三甲胺5g，NaCl 2.34g，高壓滅菌。
氯化鈉溶液(1.2mol/L)1000ml水中溶解NaCl 70g，高壓滅菌。
乙酸鈉溶液(3mol/L)800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調pH至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌。
Tris-HCl溶液(0.1mol/L，pH8.0)用800ml水溶解12.114g Tris，冷卻至室溫，用濃鹽酸調pH至8.0，定容至1L。
TE緩衝液Tris 0.01mol/L，Na2EDTA 1.0mmol/L，用鹽酸調pH至8.0，高壓滅菌。
三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)；70％乙醇；異丙醇；去離子無菌水。
2.DNA提取的流程1)樣品預處理取番茄醬等液態加工樣品30mL，室溫，10000轉/分鐘，離心15分鐘，棄上清，取沉澱2-4g轉入預冷的研缽中，置於冰上研磨，全部轉入50mL離心管中，用0.1mol/LTris-HCl溶液反覆洗滌樣品3-5次，方法為加入30mL 0.1mol/L Tris-HCl溶液，反覆搖勻，於4℃，10000轉/分鐘，離心15分鐘棄上清，使沉澱的pH值達到接近中性。該沉澱用於DNA提取。
2)取經預處理的樣品加入10mL經65℃預熱的溴代十六烷基三甲胺提取緩衝液，混勻。65℃水浴1小時，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次。
3)靜置冷卻至室溫，12000轉/分鐘，離心12分鐘，取上清。
4)加入等體積的三氯甲烷+異戊醇緩慢顛倒搖勻5分鐘，於10000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇重複抽提一次，取上清。
5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，室溫靜置1小時，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
6)沉澱加入1.2mol/L NaCl溶液1mL溶解沉澱，室溫靜置5分鐘，加入等體積三氯甲烷+異戊醇顛倒搖勻1分鐘，於12000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清。
7)加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的冷異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000轉/分鐘，離心15分鐘，棄上清。
8)加入400μL 70％冷乙醇洗滌沉澱，除去殘留的乙醇，乾燥沉澱。
9)加入30μL滅菌的去離子水溶解番茄醬中提取的DNA沉澱，取15μL用作PCR反應的模板；用作對照的鮮番茄或番茄種子的DNA提取物用100μL TE溶解，置-20℃保存備用。
10)是否提取到可用於PCR檢測的DNA，採用特異內源參照基因PCR定性擴增法進行鑑定。實驗方法和條件如下(1)特異內源參照基因的PCR引物序列(見表1)
表1 特異內源參照基因的PCR引物序列檢測基因 引物序列 擴增片斷長度 原料作物正5』-gga tcc tta gaa gca tct agt-3』PG34 383 bp 番茄反5』-cgt tgg tgc atc cct gca tgg-3』(2)特異內源參照基因的PCR反應體系組成(見表2)反應體系中各試劑的量根據反應體系的總體積進行適當調整，每個反應體系應該設置兩個平行管。番茄醬DNA質量檢測採用的反應體系相同。
表2 PCR檢測參考反應體系(25μL體系)試劑名稱加入PCR反應體系的量10×PCR反應緩衝液(含Mg2+) 2.5μLDNTP溶液(每種為10mmol/L)0.5μL正向引物(10pmol/μL)2.5μL反向引物(10pmol/μL)2.5μLTaq酶(2U/μL) 2.0μL*模板DNA10～15μL水 補足反應體系，使總體積為25μL*表中陽性對照樣品的DNA模板用量為1μL。
(3)特異內源參照基因的PCR反應條件(見表3)表3 特異內源參照基因的PCR檢測參考反應條件被擴增的基因 變性 擴增 循環次數 最後延伸94℃，30sPG34 94℃，3min60℃，30s35 72℃，5min72℃，45s(4)電泳條件用1×TAE電泳緩衝液製備2％的瓊脂糖凝膠(凝膠融化後室溫放置到60℃左右時加入溴化乙錠，含量為0.5g/mL)。按比例將10μL的PCR產物與上樣緩衝液均勻混合，然後加入到凝膠孔中，選擇合適的電壓(3V/cm～5V/cm)進行電泳，電泳時間為40min～60min。將瓊脂糖凝膠置於凝膠成像儀上或紫外透射儀上觀察並照相。
下面結合具體實施例對本發明作進一步地說明。
實施例1以天津市通茂工貿有限公司生產的金水牌番茄醬為材料，採用本方法提取番茄醬DNA，(1)將番茄醬離心，沉澱，取3g沉澱，用1倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌3次，使沉澱的pH值接近中性。
(2)將步驟(1)獲得的沉澱3g，加入10-15mL經65℃預熱的溴代十六烷基三甲胺提取緩衝液，混勻，65℃水浴1-1.5小時，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次。
(3)取出靜置冷卻至20-25℃，於12000轉/分鐘，離心12分鐘，取上清。
(4)加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，10000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清，再加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇抽提一次，取上清。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置60分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)沉澱加入1.2mol/L NaCl溶液1mL溶解沉澱，20-25℃靜置5分鐘，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，顛倒搖勻1分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清。
(7)加入10％的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預冷異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000轉/分鐘，離心15分鐘，棄上清。
(8)用400μL 4℃預冷，體積百分比為70％的乙醇洗滌沉澱，除去殘留的乙醇，乾燥沉澱，得到DNA沉澱。
(9)加入30μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例2(1)將番茄醬離心，沉澱，取2g沉澱，用1倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌5次。
(2)-(4)步同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置90分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步同實施例1。
(9)加入25μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例3(1)將番茄醬離心，沉澱，取2g沉澱，用1倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌5次。
(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置90分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入25μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例4(1)將番茄醬離心，沉澱，取2g沉澱，用3倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌5次，(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置70分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入25μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例5(1)將番茄醬離心，沉澱，取4g沉澱，用1倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌3次。
(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置60分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入25μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例6(1)將番茄醬離心，沉澱，取3g沉澱，用2倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌5次，(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置75分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入35μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例7(1)將番茄醬離心，沉澱，取3g沉澱，用2倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl的溶液洗滌3次。
(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置80分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入35μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
實施例8(1)將番茄醬離心，沉澱，取2.5g沉澱，用1倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/LTris-HCl溶液洗滌4次。
(2)-(4)步驟同實施例1。
(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置90分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清。
(6)-(8)步驟同實施例1。
(9)加入25μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
權利要求
1.從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，它由下述步驟組成(1)將番茄醬離心，沉澱，取2-4g沉澱，用1-3倍番茄醬體積的pH＝8.0的0.1mol/L Tris-HCl的溶液洗滌3-5次；(2)將步驟(1)獲得的沉澱2-4g，加入10-15mL經65℃預熱的溴代十六烷基三甲胺提取緩衝液，混勻，65℃水浴1-1.5小時，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次；(3)取出靜置冷卻至20-25℃，於12000轉/分鐘，離心12分鐘，取上清；(4)加入與步驟(3)所得到的上清液等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，10000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清，再加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇抽提一次，取上清；(5)加入2倍體積的溴代十六烷基三甲胺沉澱液，搖勻，20-25℃靜置50-90分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清；(6)沉澱加入1.2mol/LNaCl溶液1mL，溶解沉澱，20-25℃靜置5分鐘，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，顛倒搖勻1分鐘，12000轉/分鐘，離心10分鐘，取上清；(7)加入所取上清液1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預冷異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000轉/分鐘，離心15分鐘，棄上清；(8)用4℃預冷400μL體積百分比為70％的乙醇洗滌沉澱，除去殘留的乙醇，乾燥沉澱，得到DNA沉澱；(9)加入25-35μL經滅菌的去離子水，溶解從番茄醬中提取的DNA沉澱。
2.根據權利要求1所述的從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，其特徵在於所述步驟(1)中Tris-HCl溶液為1倍番茄醬體積。
3.根據權利要求1所述的從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，其特徵在於所述步驟(1)中用Tris-HCl溶液洗滌的次數為3次。
4.根據權利要求1所述的從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，其特徵在於所述步驟(1)所得到的沉澱的pH值為7.0。
5.根據權利要求1所述的從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，其特徵在於所述步驟(5)中的靜置時間為60分鐘。
6.根據權利要求1所述的從番茄醬中提取用於轉基因成分檢測的DNA的方法，其特徵在於所述步驟(9)中滅菌去離子水的體積為30μL。
全文摘要
本發明的內容是從番茄醬中提取DNA，用於轉基因成分的檢測。與常規方法相比，本方法的特點是在DNA提取過程中增加了樣品的預處理過程，從而使番茄醬沉澱物的pH值能滿足後續提取過程的要求；通過增加三氯甲烷+異戊醇抽提的次數和溴代十六烷基三甲胺沉澱的時間，有效地去除蛋白質和多糖等雜質；將所提取的DNA溶解在30μL體積的去離子水中，取15μL用作一次PCR反應，以增加反應體系中DNA模板的濃度。此方法快速、簡便、特異性強，效率高，適合番茄醬等深度加工食品中轉基因成分的定性檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1597981SQ200410020100
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月23日 優先權日2004年7月23日
發明者金紅, 趙昕, 王永, 程奕, 鄭貴忠 申請人:天津市農業科學院中心實驗室