與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑑定方法
2023-06-02 12:53:11 1
與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑑定方法，用於鑑定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，由上遊引物和下遊引物組成，上遊引物是SEQ?ID?No1所述序列，下遊引物是SEQ?ID?No2所述序列。利用本發明的引物序列及其擴增出的黃瓜抗黑斑病基因片段和黃瓜感黑斑病基因片段對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行黑斑病抗性評價，其結果與人工接種鑑定符合率分別達95.60%、93.42%，在黃瓜育種中進行資源抗性篩選具有很大的應用價值。以這些序列為依據，可以進行抗黑斑病標記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗黑斑病基因的探針；可以為進行抗黑斑病基因定位、作圖與克隆。
【專利說明】與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物基因工程【技術領域】，涉及黃瓜常規雜交育種、分子標記輔助育種的方法與技術。特別是與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段、與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法。
【背景技術】
[0002]黃瓜(CucumisSativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis)—年蔓生草本植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中國種植面積最大的蔬菜之一。黃瓜黑斑病[Cucumber alternaria leaf spot, Alternaria cucumerina]是近幾年發展起來的一種由瓜鏈格孢菌引起、為害嚴重的真菌性病害，目前已成為黃瓜保護地、露地栽培的重要病害之一。俗稱烤葉病、燒葉病，幼苗、成株均可發病。主要危害葉片，一般先從黃瓜的中、下部葉片開始發 生，而後逐漸向上蔓延，最後僅剩下頂端幾片綠葉，病株似火烤狀。病斑多數沿葉脈兩側的葉肉組織發展，主脈一般不受害。發病嚴重時多個病斑連成一片，葉肉組織枯死，葉緣向上捲起，葉子焦枯，但不脫落。黃瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬發生，發病率高達60%以上，減產10~20%。結瓜期發病，如果防治不及時，會造成絕產，給種植戶造成巨大經濟損失。尤其在蔬菜高度產業化的今天，基於傳統的抗病育種模式嚴重製約著黃瓜品種的更新換代、生產產業化的步伐，利用現代生物技術手段進行黃瓜抗病分子標記輔助育種勢在必行。
[0003]分子標記的應用為蔬菜育種學開闢了嶄新的研究和應用領域，它使蔬菜育種學家能直接從分子水平了解物種間的差異，也使育種過程更直觀，目的性更強。分子標記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection,MAS)技術目前已成為育種研究的熱點和重要手段，將分子遺傳技術應用於蔬菜抗病遺傳育種的研究上，為材料的選擇提供了全新的手段。可在早代對表現優良的基因型進行鑑定，苗期即可在DNA水平上對目標性狀進行選擇，抗病性鑑定可在室內完成，鑑定周期縮短到2天，而且穩定可靠，不受季節、環境條件等因素的影響，可提高選擇速度，增強選擇的準確性和可靠性，加快育種進程，因此具有廣闊的應用前景。
[0004]隨著蔬菜集約化生產和栽培技術的提高，黃瓜抗病育種已提到重要位置。黃瓜黑斑病是黃瓜生產上的重要病害。查閱國內外文獻，迄今為止，有關黃瓜黑斑病的分子標記輔助育種研究尚缺乏系統的研究和報導。因而將黃瓜抗黑斑病基因與不抗黑斑病的其它品種的優良品質基因相結合，培育優良抗病的黃瓜新品種和創造黃瓜新種質是生產實踐中亟需解決的實際問題。篩選與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的分子標記，獲得與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，建立黃瓜抗黑斑病分子標記輔助育種體系，將會推動傳統的「經驗育種」向高效的「精確育種」轉變，提升育種效率和技術水平，加速抗病育種的進程，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供用於鑑定黃瓜黑斑病抗性的引物序列。[0006]本發明的第二個目的是提供一種與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段。
[0007]本發明的第三個目的是提供一種與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段。
[0008]本發明的最後一個目的是提供一種鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法。
[0009]本發明的技術方案概述如下:
[0010]用於鑑定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，它由上遊引物和下遊引物組成，上遊引物是序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列，下遊引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
[0011]與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，是SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
[0012]與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，是SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。
[0013]一種鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步驟:
[0014](I)提取被鑑定樣品黃瓜基因組DNA ;
[0015](2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下遊引物，進行PCR擴增；
[0016](3)將步驟(2)獲得的PCR擴增產物進行凝膠電泳，凝膠經硝酸銀染色後在可見光下觀察、照相；
[0017](4)依據各被鑑定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑑定黃瓜黑斑病的抗性:凡擴增產物出現SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴增產物出現SEQID N0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質資源或對黃瓜進行抗黑斑病分子標記輔助育種。
[0018]利用本發明的鑑定黃瓜黑斑病抗性的引物序列及其擴增出的黃瓜抗黑斑病基因片段和黃瓜感黑斑病基因片段對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行黑斑病抗性評價，其結果與人工接種鑑定符合率分別達95.60%,93.42%，在黃瓜育種中進行資源抗性篩選具有很大的應用價值。以這些序列為依據，可以進行抗黑斑病標記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗黑斑病基因的探針；可以為進行抗黑斑病基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的抗病性奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是利用鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法獲得的與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段和感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段電泳圖:
[0020]A為與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.3所示，122bp)；
[0021]B為與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.4示，126bp)；
[0022]1、4、7、8、10、11為抗病單株；2、3、5、6、9為感病單株，純合抗性株僅有抗性基因片段，純合感性株僅有感性基因片段。
[0023]圖2是利用一種鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法，獲得的黃瓜感黑斑病母本L63和抗黑斑病父本L9雜交後代F2代分離情況圖譜:1、2、7、9、10、12、16、18、21、24、26、37、44、48、50、55、65、67、68、70、75、82、83、85 為抗病單株;3、6、13、17、20、28、31、42、43、46、49、52、58、59、60、62、63、64、69、71、76、80 為感病單株；4、5、8、11、14、15、19、22、23、25、27、29、30、32 ~36,38 ~41、45、47、51、53、54、56、57、61、66、72 ~74,77 ~79、81、84、86 為雜合類型
單株，M為DNA標準，純合抗性株僅有抗性基因片段，純合感性株僅有感性基因片段，雜合類型單株同時具有抗性基因片段和感性基因片段。
[0024]圖3是利用一種鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法，對黃瓜種質資源進行黑斑病抗性檢測:A為與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.3所示，122bp)，B為與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.4所示，126bp) ;51、52、89~92、102、104、127 ~129、131、135 ~137、144、151 為抗病種質資源；1 ~50,53 ~70、72 ~88、93 ~101、103,105 ~126、130、132 ~134、138 ~141、143、145 ~149、152 ~189 為感病種質資源；71、142、150為雜合類型種質資源。純合抗病種質資源僅有抗性基因片段,純合感病種質資源僅有感性基因片段，雜合類型種質資源同時具有抗性基因片段和感性基因片段。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0026]實施例1 [0027]( I)提取被鑑定樣品黃瓜基因組DNA ；
[0028](2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下遊引物，進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入:所述黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列25ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列25ng、dNTP0.20mM、Mg2+L 5mM、I倍的PCR緩衝液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無菌重蒸餾水至20 μ 1，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為:94°C預變性180秒，94 V變性60秒，51V退火60秒，72 °C延伸120秒，35個循環，再72 °C延伸350秒，擴增完成；
[0029](3) PCR擴增產物的凝膠電泳分析:將步驟(2)獲得的PCR擴增產物採用5%變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩衝液，上樣於經30分鐘預電泳的變性聚丙烯醯胺凝膠上，70W恆功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色後在可見光下觀察、照相；
[0030](4)依據各被鑑定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑑定黃瓜黑斑病的抗性。由於抗病單株、感病單株或中間類型單株經擴增以後產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜黑斑病材料的抗性進行快速鑑定凡擴增產物出現SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴增產物出現SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質資源或對黃瓜進行抗黑斑病分子標記輔助育種。
[0031]實施例2
[0032]鑑定黃瓜種質資源黑斑病抗性
[0033]根據實施例1的方法，對不同黃瓜種質資源基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產物出現122bp (SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列)的特異片段的材料，為抗黑斑病資源；凡擴增產物出現126bp (SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列)的特異片段的材料， 為感黑斑病資源；凡同時擴增出該兩個特異片段的材料，為不純合材料，見圖3。抗黑斑病資源，或者是抗黑斑病基因的攜帶者，可以用作進一步抗病品種選育的材料和育種種質。
【權利要求】
1.用於鑑定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特徵是它由上遊引物和下遊引物組成，上遊引物是序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列，下遊引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，其特徵是SEQID N0.3所述的核苷酸序列。
3.與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，其特徵是SEQID N0.4所述的核苷酸序列。
4.一種鑑定黃瓜黑斑病抗性的方法，其特徵是包括如下步驟: (1)提取被鑑定樣品黃瓜基因組DNA； (2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下遊引物，進行PCR擴增； (3)將步驟(2)獲得的PCR擴增產物進行凝膠電泳，凝膠經硝酸銀染色後在可見光下觀察、照相； (4)依據各被鑑定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑑定黃瓜黑斑病的抗性:凡擴增產物出現SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴增產物出現SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質資源或對黃瓜進行抗黑斑病分子標記輔助育種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555857SQ201310576852
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】王惠哲, 楊瑞環, 鄧強, 曹明明, 李淑菊 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司