一種百合耐寒評價及耐寒品種的篩選方法及應用與流程
2023-06-02 06:40:16
本發明主要涉及百合生理學領域，具體涉及一種百合耐寒評價及耐寒品種的篩選方法及應用，該方法主要通過對百合營養生長期的葉片進行低溫處理，通過測量葉片電導率來求出相對電導率擬合logistic回歸方程，進而求出百合各個品種的半致死溫度(lt50)，對百合品種耐寒性進行評價，並篩選出耐寒性百合品種。
技術背景
百合是百合科(liliaceae)多年生球根花卉植物。通常所說的百合是指百合屬(liliumspp.)植物各種及品種的總稱。百合花朵碩大、花色豔麗、花姿百態、芳香怡人，作為重要觀賞植物既能做切花、盆花，又能在園林綠地中應用，同時有的百合品種可食用和藥用，深受廣大向消費者喜愛。目前，百合已成為世界五大鮮切花之一，在世界鮮切花市場佔有十分重要的地位。近些年，百合培育的新品種越來越多，而中國種植百合的面積也在逐年迅速擴大。但百合在生長過程中對溫度要求比較苛刻，高於30攝氏度或低於5攝氏度則會停止生長。在中國中北部地區，冬春季節氣溫低，雖然大部分生產已經採用日光溫室，但由於總體基礎薄弱，其光照、溫度和可控性較差因此冬春季節低溫已成為北方地區百合設施栽培的制約因素。因此，生產中選育耐寒百合進行栽培尤為必要，而選育耐寒百合品種前提需要建立一套評價百合品種耐寒性的技術體系。目前，在百合品種耐寒性篩選上，主要是通過對百合種球和百合組培苗幼苗進行低溫處理，通過測定低溫脅迫下電導率、mda、pod、保護酶活性等來篩選百合耐寒品種，但這些方法存在一些在弊端，如種球低溫處理篩選在篩選過程中每個品種的處理都要消耗大量的種球，品種較多時，更是費時費力；組培苗低溫處理對幼苗的生長情況要求高，而且組培苗生長周期長，如果從組培開始，則更是費時費力；此外，對百合種球和組培苗的耐寒評價結果往往與百合植株田間耐寒性存在較大差異。因此，建立一個簡單方便且又符合實際生產需要的百合品種的篩選體系是亟待解決的問題。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一個簡單且又符合實際生產所需的百合耐寒品種的篩選方法。首先摘取百合植株生長點以下第二輪第一片葉，清洗乾淨後橫向剪成片段並預處理後放入低溫循環儀內處理，隔一天浸提，然後測出煮沸前和煮沸後電導率(即冰凍電導率和煮沸電導率)，求出相對電導率，算出半致死溫度(lt50)。根據半致死溫度對百合不同品種耐寒性高低進行排序，篩選出抗性強與抗性弱的品種。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的
一種百合耐寒品種的篩選方法，包括以下步驟：
(1)摘取百合植株生長點以下第二輪第一片成熟葉並清洗乾淨；
(2)將清洗後的成熟葉剪切成葉塊，並對葉塊進行預處理；
(3)利用低溫循環儀對預處理後的葉塊進行處理；
(4)將在低溫循環儀中處理結束後的樣品取出解凍，將解凍後的樣品浸提過夜；
(5)測浸提液的冰凍電導率，測完後煮沸並冷卻再次測量電導率得到煮沸電導率，根據公式相對電導率＝冰凍電導率/煮沸電導率×100％，求出相對電導率；
(6)用擬合logistic回歸方程為：y＝k/(1+ae-bx)對相對電導率進行分析，其中y代表細胞傷害率，x代表處理溫度，k為細胞傷害率的飽和容量，a，b為方程參數；為了確定a，b的值，將方程進行線性化處理，ln[(k-y)/y]＝lna-bx，令y＝ln[(k-y)/y]，則轉化為細胞傷害率(y)與處理溫度(x)的直線方程；通過直線回歸的方法求得a，b值及相關係數r2，計算百合品種的半致死溫度lt50＝in[(1/a)]/b；
(7)根據半致死溫度對百合品種耐寒性進行評價，並篩選出耐寒性百合品種。
步驟(2)中所述預處理的過稱為將所述的葉塊用溼紗布均勻包裹1層，放入玻璃試管中，置於4℃冰箱過夜。
步驟(3)中利用低溫循環儀處理葉塊的過程為：在低溫循環儀溫度降到4℃時，將預處理後的樣品放入低溫循環儀內處理；所述低溫循環儀處理溫度為5個梯度0、-3、-6、-9、-12℃；每個梯度處理1h，梯度與梯度之間降溫時間為30min。
步驟(4)中將在低溫循環儀中處理結束後的樣品取出放入4℃冰箱內解凍，將解凍後的樣品取出浸提過夜。
步驟(5)中所述煮沸的時間為15min。
步驟(1)中所述的百合植株生長健壯、無病蟲害感染。同一百合品種第二輪第一片成熟葉大小一致。
步驟(2)中所述的成熟葉用剪刀橫向剪成寬為1cm的小葉塊。
步驟(4)中所述的浸提為每個樣品中加入30ml蒸餾水進行浸提。
上述的方法在百合耐寒品種篩選中的應用。
本發明所述百合耐寒品種的篩選方法的詳細過程包含以下步驟：
(1)摘取百合植株生長點以下第二輪第一片葉，每個品種取得10片大小一致的葉片，用自來水和蒸餾水各清洗三遍，再用吸水紙將葉片上的水吸乾。
(2)將步驟(1)中的葉片用剪刀橫向剪成寬為1cm的小葉塊，然後每2片葉為一份，用溼紗布均勻包裹一層，放入25mm×150mm的玻璃試管中，放進4℃冰箱一夜，第二天待用。
(3)把步驟(2)中的樣取出，平行排在試管架上並用橡皮筋綁緊，然後等低溫循環儀溫度降到4℃時，將其放入低溫循環儀內處理。處理溫度為5個梯度0℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃。每個梯度處理1h，梯度與梯度之間降溫時間為30min。然後把樣取出後放入4℃冰箱內解凍，到第二天再取出來使用。
(4)把步驟3)解凍後的樣取出開始浸提，每個試管中的樣均分三份分別放到試管中，每個中加入30ml蒸餾水，浸提過夜。
(5)把步驟4)浸提過後的樣開始測電導率。測完後煮沸15min，等冷涼後再次測量電導率。然後根據公式i求出其性對電導率：
相對電導率(rec，％)＝冰凍電導率/煮沸電導率×100％(i)
(6)耐寒研究中，相對電導率擬合logistic回歸方程為：y＝k/(1+ae-bx)。其中y代表細胞傷害率，x代表處理溫度，k為細胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數。為了確定a，b的值，將方程進行線性化處理，ln[(k—y)/y]＝lna-bx，令y1＝in[(k—y)/y]，則轉化為細胞傷害率(y1)與處理溫度(x)的直線方程。通過直線回歸的方法求得a，b值及相關係數r2(擬合度)，用方程ii求出半致死溫度。
lt50＝in[(1/a)]/b(ii)
(7)根據半致死溫度對百合不同品種耐寒性高低進行排序，篩選出抗性強與抗性弱的品種。
本發明的有益效果：
本發明針對百合耐寒性品種的篩選提供了一個有效方便的方法，為以後耐寒品種的選育以及研究奠定一定的基礎。同時也具有以下的重要特徵1)在百合營養生長過程中對百合葉片低溫處理，更貼近實際生產。2)多種篩選方法相結合，遞進篩選，既科學又便捷。
附圖說明
圖1為『特拉索橙』相對電導率擬合度曲線；
圖2為『木門』相對電導率擬合度曲線；
圖3為『黑幕』相對電導率擬合度曲線。
具體實施方式
下面結合具體實例對本發明作進一步的詳細說明。
本發明運用葉片低溫處理對30個切花品種進行實驗篩選(表1)。
表1實驗材料的品系及種球規格
實驗材料種植在南京農業大學菊花基地玻璃溫室中，於2016年10月底開始開展實驗，具體實施實例如下：
1.1摘取百合植株生長點以下第二輪第一片成熟葉，每個品種取10片大小一致的葉片，用自來水和蒸餾水各清洗三遍，再用吸水紙將葉片上的水吸乾，然後用剪刀把葉片橫向剪成寬為1cm的小葉塊，然後每2片葉為一份，分成5份，用溼紗布均勻包裹一層，放入25mm×150mm的玻璃試管中，放進4℃冰箱一夜，第二天把樣取出，平行排在試管架上並用橡皮筋綁緊，然後等低溫循環儀溫度降到4℃時，將其放入低溫循環儀內處理，儀器是polyscience公司的的pp28-r30低溫循環儀。處理溫度為5個梯度0℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃、。每個梯度處理1h，梯度與梯度之間降溫時間為30min。每個樣取出後放入4℃冰箱內解凍，到第二天再取出來使用。解凍後的樣取出開始浸提，把每個試管中的樣均分3份(3個重複)分別放到試管中，每個中加入30ml蒸餾水，浸提過夜。浸提過後的樣開始測電導率，測完後煮沸15min，等冷涼後再次測量電導率。相對電導率(rec，％)＝冰凍電導率/煮沸電導率×100％，從而求出其相對電導率。
1.2數據處理
相對電導率擬合logistic回歸方程為：
y＝k/(1+ae-bx)
半致死溫度(lt50)
lt50＝in[(1/a)]/b
y代表細胞傷害率，x代表處理溫度，k為細胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數。
1.3結果分析
1.3.1細胞膜與耐寒性
電解質滲漏測定結果表明：30份材料電解質滲漏程度隨著處理溫度的下降而增大，因此相對電導率也隨著溫度下降而上升，且相對電導率曲線明顯呈s型(圖1～3)，圖中的5個點對應的溫度分別是0、-3、-6、-9、-12℃。從圖中可以明顯看到『特拉索橙』和『黑幕』在0℃到-9℃之間，相對電導率呈明顯上升趨勢，在-9℃到-12℃度之間基本不再上升並趨於穩定趨勢；『特拉索橙』在-3℃和-7℃之間相對電導率陡然上升，『黑幕』在-4℃到-8℃之間相對電導率陡然上升，說明這2個品種在這對應的溫度裡傷害最大。s型拐點就是它們分別對應的半致死溫度。『木門』所對應的曲線在0℃到-12℃，基本是呈上升趨勢，在0℃到-5℃之間緩慢上升，在-6℃到-10℃之間呈快速上升趨勢，在-10℃之後才開始有放緩趨勢，它的s型拐點則在-6℃和-10℃之間。
1.3.2半致死溫度(lt50)比較分析
30個百合品種在不同的低溫處理下，根據相對電導率所得到的擬合回歸方程、擬合度及半致死溫度見表3，按照半致死溫度升序排列。30個百合品種葉片電解質外滲法耐寒性試驗結果表明，實驗材料的電解質滲出率隨著溫度的降低而升高，並且所以的品種相對電導率的擬合曲線都成明顯的s型，且擬合度較好，這說明實驗設計的溫度梯度是合理的。lt50作為植物耐寒性評價指標，lt50越低耐寒性越強，反之，則越弱。從表3可以看出，30份實驗材料的半致死溫度在-5℃和-9℃之間，這說明這些百合品種耐寒性相對較弱。其中抗性比較弱的品種有『特拉索橙』、『卡斯太白』、『耶羅林』、『小羅賓』，但也有幾個品種相對耐寒性較強如『木門』、『紅衣主教』(表2，表3)。
表230個百合品種logistic方程和r2
表330個百合品種lt50
由以上實例可以看出：30個百合品種葉片經過低溫處理後，電導率也隨著溫度下降而上升，且相對電導率曲線明顯呈s型，擬合度都比較高，每個品種的半致死溫度都很容易求出，進而判斷出其耐寒性強弱。這中篩選百合耐寒品種的方法與其他篩選方法相比更簡單更易操作，尤其是對多個品種進行篩選時，更能體現這一方法的優越性。同時，這一方法比其他方法更貼合實際，是在百合植株生長期進行篩選，而其他方法要麼是對百合鱗莖或組培苗處理來篩選，則與實際栽培表現出來的還相差較遠。因此，本方法對百合耐寒性評價結果更能反應百合田間的實際耐寒性，比傳統方法更具代表性。上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。