鞘氨醇單胞菌的β–胡蘿蔔素羥化酶及其編碼基因與其在生產蝦青素中的應用的製作方法

2023-06-02 15:23:36

本發明專利申請是申請號為「2014104472590」的發明專利的分案申請，原申請的申請日為「2014.09.03」，申請號為「2014104472590」，發明名稱為「鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞菌遺傳操作的方法」。

本發明涉及生物技術領域，具體涉及鞘氨醇單胞菌的β–胡蘿蔔素羥化酶及其編碼基因與其在生產蝦青素中的應用。

背景技術：

蝦青素(astaxanthin，又稱變胞藻黃素或蝦紅素)，屬於酮式類胡蘿蔔素，是一種較強的天然抗氧化劑。其獨特的分子結構不但使其具有超強的抗氧化活性，還具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤及預防心腦血管疾病的作用。目前，蝦青素已在食品、飼料、保健品市場等廣泛應用。然而天然蝦青素的來源非常有限，目前，蝦青素大多採用傳統突變技術產生的pfaffia菌株和微藻生產，但是，pfaffia發酵存在發酵周期長的缺點，而從藻類中獲得產物的生產技術仍不成熟。因此，開發新的天然蝦青素資源具有重要意義。

鞘氨醇單胞菌是革蘭氏陰性菌，1990年被鑑定，專性需氧，以單側生極性鞭毛運動，多呈黃色。其黃色菌落多是由於產生類胡蘿蔔素導致。細胞膜與一般的革蘭氏陰性菌不同，為鞘糖脂，這也使得對其的遺傳操作還未成熟。目前，在sphingomonasatcc55669中尚無任何基因方面的信息報導，也未有相關遺傳操作的文獻，即使是該菌株所在的屬也鮮有報導。目前，鞘氨醇單胞菌多可降解多元化的芳環化合物，是環境微生物的研究熱點，其遺傳操作的建立為進一步利用其降解機制建立了基礎。

蝦青素生物合成途徑已被廣泛研究並取得了巨大進展，大量關鍵酶基因得到克隆。目前已知的類胡蘿蔔素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。其中，非甲羥戊酸途徑mep(nonmevalonatepathway)途徑廣泛存在於細菌中，它以糖酵解中間代謝物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為前體，在脫氧木酮糖磷酸合酶作用下生成脫氧木酮糖磷酸，然後受脫氧木酮糖磷酸還原酶和異構酶催化，通過還原和異構反應將脫氧木酮糖磷酸轉變成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸(mep)。經胞苷三磷酸活化，腺苷三磷酸磷酸化，從而形成甲基赤蘚糖醇環化焦磷酸，然後轉變成ipp(異戊烯焦磷酸)，ipp異構化形成dmapp(二甲基丙烯基二磷酸)。ipp和dmapp是合成蝦青素途徑的前體物質。兩者在ipp異構酶作用下相互轉換達到平衡，在crte(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶)作用下，1個dmapp與3個ipp分子縮合生成ggpp(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸)。2分子ggpp在crtb(八氫番茄紅素合成酶)作用下形成第一個無色的類胡蘿蔔素——八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經過連續的脫氫步驟(crti)生成番茄紅素。番茄紅素在crty(番茄紅素β-環化酶)的作用下生成β-胡蘿蔔素。β-胡蘿蔔素在crtz(β-胡蘿蔔素羥化酶)和crtw(β-胡蘿蔔素酮酶)的一系列作用下生成蝦青素(如圖1)。

通過豐富不同來源的蝦青素生物合成相關基因，經重組dna技術篩選，從而增加蝦青素生物合成的生產能力，是縮短發酵周期，提高蝦青素生物合成產率的重要途徑，從而為蝦青素進一步工業化生產打下基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑中的β–胡蘿蔔素羥化酶，以及該酶的編碼基因。本發明的目的還在於提供所述β–胡蘿蔔素羥化酶或其編碼基因在生產蝦青素中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

本發明通過對鞘氨醇單胞菌的提取產物進行檢測，證實鞘氨醇單胞菌可以產生蝦青素，含有能夠產生蝦青素的生物合成途徑。並進一步證實了在鞘氨醇單胞菌合成蝦青素的這條線性通路中，與現有已知基因同源性較低的crte、crtz基因具有相應的功能。

鞘氨醇單胞菌的ggpp合成酶(crte)，為296個胺基酸組成的蛋白質，其胺基酸序列如seqidno.1所示；該ggpp合成酶的編碼基因為gene3518，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

鞘氨醇單胞菌的β–胡蘿蔔素羥化酶(crtz)，為172個胺基酸組成的蛋白質，其胺基酸序列如seqidno.3所示；該β–胡蘿蔔素羥化酶的編碼基因為gene2930，其核苷酸序列如seqidno.4所示。或鞘氨醇單胞菌的β–胡蘿蔔素羥化酶(crtz)，為155個胺基酸組成的蛋白質，其胺基酸序列如seqidno.5所示；該β–胡蘿蔔素羥化酶的編碼基因為gene1181，其核苷酸序列如seqidno.6所示。

上述ggpp合成酶、β–胡蘿蔔素羥化酶或其編碼基因在生產蝦青素中的應用。

一種生產蝦青素的方法，包括如下步驟：將產蝦青素質粒中的crte基因或crtz基因替換為上述ggpp合成酶或β–胡蘿蔔素羥化酶的編碼基因；再將基因替換後的質粒轉化到大腸桿菌中，通過誘導表達生產蝦青素。

所述的產蝦青素質粒為pfz153，其構建包括如下步驟：

(1)大腸桿菌來源的idi基因通過pcr擴增克隆到載體pet28a(+)上獲得質粒pgzi，將idi基因片段從pgzi中用ndei和xhoi切下插入到petduet-1相應位點獲得pfz87；

(2)以pfz87為模板用引物pagcrty-idi-r和pagcrtw-petduet-f擴增質粒骨架；

從cgmcc1.2244基因組dna擴增crty和crtz，引物分別為idi-pagcrty-f、crtz-pagcrty-r，crty-pagcrtz-f、crtw-pagcrtz-r；

合成seqidno.7所示的crtw，以其為模板用引物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴增crtw；

crty、crtz、crtw和質粒骨架四個片段用giboson方法連接獲得pfz152；

(3)合成序列分別如seqidno.8、9、10所示的crte、crtb和crti，將crte、crtb和crti分別克隆到pet28a(+)的ndei和ecori位點獲得pfz21、pfz22和pfz23；

(4)以構建pfz152同樣的方法分別以pfz87、pfz21、pfz22、pfz23為模板用引物petduet-ncoi-r、petduet-ecori-t7-f，duet-pancrte-f、pancrti-crte-r，pancrte-crti-f、pancrtb-crti-r，pancrti-crtb-f、duet-ecori-pancrtb-r擴增質粒骨架，crte，crti和crtb，用giboson方法連接獲得質粒pfz112；

(5)將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下插入到pfz152對應的位點獲得pfz153；

上述各引物序列如下：

pagcrty-idi-r:cagatcataccgcggcatagtgtaatcctcctttatttaagctgggtaaatg，

pagcrtw-petduet-f:cttatggcgtggtgagagctaactcgagtctggtaaagaaaccgc，

idi-pagcrty-f:acccagcttaaataaaggaggattacactatgccgcggtatgatctgattc，

crtz-pagcrty-r:gcattccaaatccacaacatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgac，

crty-pagcrtz-f:caggcgatgcaatgaaggaggattactatatgttgtggatttggaatgccctga，

crtw-pagcrtz-r:ccactgcggcggtcattactcattcctcctttacttcccgggtggcgcgtc，

crtz-brecrtw-f:cgccacccgggaagtaaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagag，

brecrtw-r:gcggtttctttaccagactcgagttagctctcaccacgccataag，

petduet-ncoi-r:catggtatatctccttcttaaagttaaac，

petduet-ecori-t7-f:taactagtgaattcgagctcggcgcgcctg，

duet-pancrte-f:gaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgaccgtgtgtgcgaaaaaac，

pancrti-crte-r:tcaccgtggtcggtttcatggttaattcctcctttacgacaccgctgccag，

pancrte-crti-f:ctggcagcggtgtcgtaaaggaggaattaaccatgaaaccgaccacggtga，

pancrtb-crti-r:tcagcagggacggattattcatgagtattacctcctttaaatcaggtcttccagcatc，

pancrti-crtb-f:gatgctggaagacctgatttaaaggaggtaatactcatgaataatccgtccctgctga，

duet-ecori-pancrtb-r:ttgtcgacctgcaggcgcgccgagctcgaattcactagttaaacggggcgctgccagag。

本發明具有如下優點和效果：

本發明證實鞘氨醇單胞菌可以產生蝦青素，含有能夠產生蝦青素的生物合成途徑；並進一步證實了與現有已知基因同源性較低(gene3518基因與目前已知crte基因的同源性低於30％，gene2930和gene1181與目前已知crtz基因的同源性約為60％)的crte、crtz基因具有相應的功能。

本發明的ggpp合成酶、β–胡蘿蔔素羥化酶及其編碼基因，豐富了細菌生物合成類胡蘿蔔素的基因多樣性，並為生物合成代謝改造類胡蘿蔔素提供了更多資源。

附圖說明

圖1是蝦青素合成路線圖。

圖2是lc-ms檢測sphingomonasatcc55669中蝦青素結果。

圖3是pfz153質粒圖譜。

圖4是ptm3518質粒圖譜。

圖5是ptm2930質粒圖譜。

圖6是ptm1181質粒圖譜。

圖7是hplc檢測轉化不同質粒的mg1655菌株的蝦青素生成；2-5分別是轉化pfz153、ptm3518、ptm2930和ptm1181的菌株，1是蝦青素標準品(濃度為1ppm)。

圖8是轉化不同質粒的mg1655菌株的蝦青素產量對比。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。

除非有特殊說明，本發明中的寡核苷酸引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；dna序列測定由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；除非特殊說明，本發明所用限制性內切酶、核酸外切酶、連接酶均購自neb，dna片段回收採用omegadna凝膠回收試劑盒，按說明書方法操作；pcr純化採用axygen試劑盒，按說明書方法操作。

下述實施例中所用引物見下表。

實施例1鞘氨醇單胞菌中蝦青素產物的檢測

提取鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669(從atcc購買)代謝產物，方法如下：

將菌種在#272培養基平板(營養肉湯8g/l，葡萄糖5g/l，瓊脂1.6％)上活化，於26℃培養。挑菌落至5ml#272培養基(營養肉湯8g/l，葡萄糖5g/l)中26℃、220rpm培養，24h後轉接至100ml#272培養基中26℃、220rpm培養，od600至0.8時，轉接至300ml#272培養基中26℃、220rpm培養，60h後收菌。

將菌液於8000rpm離心10min，收集菌體，加入10ml萃取劑(v丙酮:v甲醇＝4:1)，震蕩打散菌體後，萃取10min，8000rpm、4℃離心5min，移出上清，按上述步驟再萃取3次，收集上清，旋幹，加入3ml丙酮溶解，13000rpm離心10min，取上清lc-ms檢測，提取過程避光。lc-ms檢測結果見圖2，蝦青素的分子量為596.39，經過質譜檢測器帶一個h+，為597.39，表明鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669可以產生蝦青素。

實施例2鞘氨醇單胞菌中相關蝦青素生物合成基因的確定

由實施例1可知，鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669可以產生蝦青素，該菌株中含有能夠產生蝦青素的生物合成途徑。將鞘氨醇單胞菌基因組信息在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)blastp中進行比對，發現鞘氨醇單胞菌中存在mep途徑，該途徑從丙酮酸經dxs，dxr，ispe，ispdf，ispg，isph合成ipp和dmapp。ipp和dmapp經類胡蘿蔔素合成途徑通過crte，crtb，crti，crty，crtz，crtw生成蝦青素。在鞘氨醇單胞菌合成蝦青素的這條線性通路中，所得基因除crte、crtz，其他基因均為唯一。

實施例3鞘氨醇單胞菌crte基因和crtz基因的擴增

從鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669中提取基因組dna，提取方法如下：

(1)取50ml新鮮菌液至尖底離心管，7000rpm×5min離心，棄上清。

(2)加10ml的ddh2o，于振蕩器上打散，7000rpm×5min離心，棄上清。

(3)加10ml的setbuffer(75mmnacl，25mmedta，20mmtris-cl)，于振蕩器上打散，7000rpm×5min離心，棄上清。

(4)加5ml的setbuffer，于振蕩器上打散，加150μl的溶菌酶(lysozyme，100mg/ml，-20℃)，37℃水浴30-60min，每隔5-10min緩慢搖勻一次，至細胞壁完全裂解(鑑定細胞壁完全裂解：取少量菌液，加1滴10％sds，菌液清澈，拉絲)。

(5)加10μlrnasea(10mg/ml)，37℃水浴10min。加250μl的蛋白酶k(proteinasek，20mg/ml，-20℃)，37℃水浴30min。

(6)加5ml10％sds，55℃水浴2h，每隔15min輕輕搖勻一次。

(7)加2ml5mnacl，輕輕搖勻，有白色沉澱析出。

(8)將液體轉移至50ml圓底離心管(beckman)，加10ml氯仿，緩慢搖勻30min(注意放氣)，12000rpm×15min離心(轉子ja25.50，beckman)，取上清液(大口槍頭)，重複步驟(8)2次，最後一次將上清轉移至50ml尖底離心管。

(9)加0.8倍體積的異丙醇，輕搖混勻至出現絲狀dna。將dna挑至ep管中，加70％的乙醇洗2次，倒掉乙醇，自然風乾，室溫溶於一定量的ddh2o中。

將提取的基因組dna作為pcr模板，利用引物duet-pan3518-f2和pancrti-3518-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crte(gene3518)基因。pcr反應體系為40μl：15.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，8μl5×highgcenhancer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；最後以72℃延伸6min。

利用引物crty-pag2930-f和crtw-pag2930-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crtz(gene2930)基因，利用引物crty-pag1181-f2和crtw-pag1181-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crtz(gene1181)基因，兩個反應的pcr反應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；最後以72℃延伸5min。

實施例4crte基因和crtz基因的功能驗證

本實施例通過gibsonmethod構建有關克隆質粒，驗證crte基因和crtz基因的功能。

圖3所示為已知蝦青素生物合成相關基因的克隆質粒pfz153，其構建方法見下。

圖4所示為將pfz153中crte基因替換為gene3518後構建的質粒ptm3518。

圖5所示為將pfz153中crtz基因替換為gene2930後構建的質粒ptm2930。

圖6所示為將pfz153中crtz基因替換為gene1181後構建的質粒ptm1181。

1、產蝦青素的陽性克隆質粒pfz153的構建：

質粒pfz153以petduet-1為骨架載體，插入片段crteib-idi-crtyzw完成，具體構建方法如下：

大腸桿菌來源的idi基因通過pcr擴增克隆到載體pet28a(+)上獲得質粒pgzi(fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli.biotechnol.bioeng.2014；111:1396–1405.)，將idi基因片段從pgzi中用ndei和xhoi切下插入到petduet-1相應位點獲得pfz87。

以pfz87為模板用引物pagcrty-idi-r和pagcrtw-petduet-f擴增質粒骨架。從cgmcc1.2244基因組dna擴增crty和crtz，引物分別為idi-pagcrty-f，crtz-pagcrty-r；crty-pagcrtz-f，crtw-pagcrtz-r。來源於brevundimonassp.sd212的crtw經密碼子優化後合成，以優化的crtw(seqidno.7)為模板，用引物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴增crtw。crty、crtz、crtw和質粒骨架四個片段用giboson方法連接(danielg.gibson,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments,methodsinenzymology,volume498,2011,pages349-361.)獲得pfz152。

將經密碼子優化的pantoeaananatis的crte(seqidno.8)、crtb(seqidno.9)和crti(seqidno.10)基因合成後(基因合成時在序列兩端加ndei和ecori酶切位點)克隆到pet28a(+)的ndei和ecori位點獲得pfz21、pfz22和pfz23。

以構建pfz152同樣的方法分別以pfz87，pfz21，pfz22，pfz23為模板用引物petduet-ncoi-r，petduet-ecori-t7-f；duet-pancrte-f，pancrti-crte-r；pancrte-crti-f，pancrtb-crti-r；pancrti-crtb-f，duet-ecori-pancrtb-r擴增質粒骨架，crte，crti和crtb，用giboson方法連接獲得質粒pfz112。

將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下插入到pfz152對應的位點獲得pfz153。

2、含有目的片段的ptm3518，ptm2930，ptm1181質粒構建：

該步pcr擴增模板均為質粒pfz153。

(1)質粒構建所需片段的擴增

質粒ptm3518由片段gene3518，petduet-1(3518)，crtib-idi-crtyzw(3518)構成。其中，gene3518片段的擴增見實施例3。petduet-1(3518)和crtib-idi-crtyzw(3518)片段的擴增如下：

利用引物pagcrtw-petduet-f和petduet-ncoi-r擴增出petduet-1(3518)片段，利用引物pan3518-crti-f和brecrtw-r擴增出crtib-idi-crtyzw(3518)片段，兩個反應的pcr反應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環；最後以72℃延伸7min。

質粒ptm2930由片段gene2930，crtw-petduet-1(2930)，crteib-idi-crty(2930)構成。其中，gene2930片段的擴增見實施例3。crtw-petduet-1(2930)和crteib-idi-crty(2930)片段的擴增如下：

利用引物2930-brecrtw-f和petduet-ncoi-r擴增出crtw-petduet-1(2930)片段，利用引物duet-pancrte-f和2930-pagcrty-r擴增出crteib-idi-crty(2930)片段，兩個反應的pcr反應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環；最後以72℃延伸7min。

質粒ptm1181由片段gene1181，crtw-petduet-1(1181)，crteib-idi-crty(1181)構成。其中，gene1181片段的擴增見實施例3。crtw-petduet-1(1181)和crteib-idi-crty(1181)片段的擴增如下：

利用引物1181-brecrtw-f和petduet-ncoi-r擴增出crtw-petduet-1(1181)片段，利用引物duet-pancrte-f和1181-pagcrty-r2擴增出crteib-idi-crty(1181)片段，兩個反應的pcr反應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環；最後以72℃延伸7min。

(2)克隆質粒的獲得

電泳鑑定pcr擴增產物正確後，經過膠回收各pcr擴增產物，用nanodrop測定各pcr產物濃度。片段petduet-1(3518)，crtib-idi-crtyzw(3518)，gene3518；crtw-petduet-1(2930)，crteib-idi-crty(2930)，gene2930；crtw-petduet-1(1181)，crteib-idi-crty(1181)，gene1181分別用giboson方法連接獲得質粒ptm3518、ptm2930、ptm1181。

3、將質粒ptm3518、ptm2930、ptm1181、pfz153分別轉化感受態細胞mg1655(內含質粒pmh1、pfz81(fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli,biotechnol.bioeng.2014；111:1396–1405.)。挑轉化子於含有34μg/ml氯黴素、50μg/ml卡那黴素、100μg/ml氨苄青黴素的lb培養基中於37℃、220rpm培養過夜。以1％接種量轉接200ml含有34μg/ml氯黴素、50μg/ml卡那黴素、100μg/ml氨苄青黴素的lb培養基30℃、200rpm培養，陰性對照為內含質粒pmh1和質粒pfz81的mg1655菌株。od600達到0.7-0.9時加終濃度0.1mmiptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)誘導，培養15h後取樣2ml，12000rpm離心3min，去上清，加1ml萃取劑(v丙酮:v甲醇＝4:1)，震蕩打散菌體後，超聲10min，13000rpm、4℃離心10min，取上清hplc檢測，提取過程避光。

4、產物高效液相色譜(hplc)檢測

hplc分析條件：色譜柱：4.6×250mm5μmdionexacclaim120c18。流動相：a：水，b：乙腈(0.1％甲酸)；0min：50％b，5min：100％b，20min：100％b，25min：50％b，27min：50％b。流速1ml/min。上樣量：20μl。柱溫：25℃。檢測器：紫外多波長(vwd)檢測器。標準品為1mg/l蝦青素。

經hplc檢測結果(圖7)可知，分別轉化了pfz153、ptm3518、ptm2930、ptm1181質粒的mg1655(內含質粒pmh1、pfz81)的各個菌株的提取產物，在與蝦青素標準品的同一保留時間下，均可檢測到蝦青素的生成，但含量有高低差別。其中，轉化質粒ptm3518的mg1655菌株(內含質粒pmh1、pfz81)蝦青素產量可達2.5mg/l(如圖8)。上述結果說明鞘氨醇單胞菌的crte(gene3518)基因、crtz(gene2930)基因和crtz(gene1181)基因具有相應的功能。

sequencelisting

武漢生物技術研究院，武漢大學

鞘氨醇單胞菌的β–胡蘿蔔素羥化酶及其編碼基因與其在生產蝦青素中的應用

1

10

patentinversion3.5

1

296

prt

sphingomonasatcc55669

1

metthrthrthrleuaspalaalaleualaargmetseralaaspile

151015

aspalaargphealaargleuleualaileproaspaspproargala

202530

aspleutyrargalametarghisalaalaileglyglyglylysarg

354045

leuargproleuleuvalglyalathralaaspleupheglyvalasp

505560

argaspcysserglyaspvalalaleualavalglualailehisval

65707580

tyrserleuilehisaspaspleuproalametaspaspaspaspleu

859095

argargglylysprothrvalhislysalapheaspglualathrala

100105110

ileleualaglyaspcysleuhisalaleualaphegluileleuala

115120125

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130135140

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