黴病黴素的生產方法

2023-06-02 15:18:01 2

專利名稱:黴病黴素的生產方法
本發明與生產黴病黴素的發酵方法有關。
黴病黴素是一具有結構式〔Ⅰ〕的化合物;通過培養屬於鏈輪絲菌
屬產黴病黴素的菌株，它作為抗菌素首次被發現並命名為「抗菌素B-98891」。我們把注意力集中在它的活性上，特別是它作為多種植物的一種預防和治療白粉病藥或作為殺蟎劑的作用。因此，希望提高黴病黴素的產量，包括在至少含3毫摩爾(毫摩爾/升)N-甲基化合物培養基上或含5-羥甲基胞嘧啶的培養基上培養產黴病黴素的菌株的發酵方法。〔U.S.P.4007267;U.S.P.4334022;U.S.P.4296107;英國專利號1507193;「抗菌素雜誌」31卷，6期511-518頁，519-524頁(1978);「殺蟲劑科學雜誌」4卷3期，349-353頁(1979);「四面體化學」37卷，1317-1327頁(1981);等等〕。
然而，就目前所知的生產黴病黴素的發酵方法，所採用的產黴病黴素菌株生產黴病黴素的能力是有限的，因而通過改進培養基中含有的物質來提高黴病黴素的產率也是限制的，因此這些方法已不能滿足工業化大規模地生產黴病黴素的需要。
本項發明的發明者經過對提高菌株產黴病黴素能力勤奮研究，結果發現;當把產黴病黴素的菌株對具有結構式
〔Ⅱ〕的絲氨酸氧肟酸鹽或對具有結構式
〔Ⅲ〕的刀豆氨酸有抗性時，即便使用普通培養基，菌株生產黴病黴素的能力也得到意想不到的提高，從而使黴病黴素的生產效率變得更高。根據這一發現，完成了本項發明。
更準確地說，本發明是關於(1)一種生產黴病黴素的方法，其特徵在於通過在培養基上培養屬於鏈輪絲菌屬，產黴病黴素的菌株，由於此菌株抗培養基中的絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸，從而引起所說菌株合成和積累黴病黴素，並從最後培養物液中回收黴病黴素。
(2)上述申請專利(1)所述的生產黴病黴素的方法，其特徵在於培養基中至少含有3毫摩爾的N-甲基化合物。
(3)申請專利(1)或(2)所述的生產黴病黴素的方法，其特徵在於培養基中含有5-羥甲基胞嘧啶。
(4)裂生鏈輪絲菌(Streptoverticillium rimofaciens)能抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸並能產生黴病黴素。
在本發明製備黴病黴素的方法中，應用的是屬於鏈輪絲菌屬，有抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸特性的產黴病黴素的菌株(這裡或以後稱「本發明菌株」)。舉例來說，本發明菌株有如下特性〔1〕形態學特性在各種不同的常規培養基上，本發明菌株形成氣生菌絲，呈輪狀具二級輪枝。在合成瓊脂培養基如，葡萄糖、天冬醯胺瓊脂上雖然很少但也能發現孢子絲環和鉤狀孢子絲。孢子形狀為卵形到園筒形，大小為0.6～0.8×0.7～1.3微米。一般孢子產生呈鏈狀，含3到16個，每個孢子表面光滑或瘤狀。在常規培養基上，沒有觀察到孢子囊、鞭毛、菌核等等。
〔2〕培養特性本發明菌株的培養特性如表1所示。如無特殊說明，描述的是在28℃下經21天培養後的結果。表中用括號表明的顏色名稱是根據《色譜手冊》，第4版，Container Corporation of America。
〔3〕生理特性(1)生長溫度範圍在15～38℃範圍內生長，更好地生長和產生氣生菌絲的溫度為28～36℃。
(2)明膠液化(24℃培養28天)不液化。
(3)澱粉水解陽性(4)硝酸鹽還原在細菌硝酸鹽培養液(ISP-No.8)和查氏培養液(Czapek′s solution)中陰性。
(5)脫脂乳凝固反應陽性蛋白腖化陽性(6)黑色素的產生陽性(蛋白腖、酵母液、鐵離子瓊脂培養基)陰性(酪氨酸瓊脂培養基)(7)碳源的利用(在Pridham·Gottlieb瓊脂培養基上)ⅰ)利用相當好的碳源肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、澱粉、甘油、醋酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉。
ⅱ)一般利用的碳源D-果糖、海藻糖。
ⅲ)不利用的碳源赤蘚醇、核糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、半乳糖醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水楊苷、七葉苷、菊粉。
(8)在蛋白質培養基上的色素生成弱(9)肉湯-瓊脂培養基上的裂化無(10)對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的抗性抑制菌絲生長的最低濃度;抗絲氨酸氧肟酸鹽至少是40微克/毫升，抗刀豆氨酸至少是100微克/毫升。
〔4〕其它特性按照「發酵工程雜誌」63卷，1期，17-21頁(1985)上描述的酶學方法，產生5-羥甲基胞嘧啶的比活力為0.18毫微摩爾/分/毫克蛋白或更大。
具有上述特性的這個菌株是裂生鏈輪絲菌，例如裂生鏈輪絲菌CR3-182(抗絲氨酸氧肟酸鹽)，裂生鏈輪絲菌CVR-48(抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸)和裂生鏈輪絲菌CVR-16(抗刀豆氨酸)。上述裂生鏈輪絲菌CR3-182已於1985年6月28日保藏大阪發酵研究所(IFO)，保藏號為IFO-14448，同時於1985年7月8日把它保藏在工業科學和技術局的發酵研究所(FRI)，保藏號為FERM P-8334，裂生鏈輪絲菌CVR-48 1985年6月28日保藏在IFO，保藏號為IFO-14449，1985年7月8日保藏在FRI，保藏號為FERM P-8333，裂生鏈輪絲菌CVR-16於1986年7月15日保藏在IFO，保藏號為IFO-14527，1986年7月25日保藏在FRI，保藏號為FERMP-8874。
在生產黴病黴素這個方法的菌株培養中，可利用通常微生物可吸收的碳源，易消化的氮源和無機鹽等等組成的培養基。如需要時，培養基中可加入微量營養物，生長促進劑，前體和其它少量就能起作用的物質。通常可同化的碳源包括，如澱粉、糊精、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糖蜜、玉米漿、穀子凝膠，以及有機酸如醋酸、琥珀酸等等或脂肪和油或多羥基醇如甘油，這些物質可單獨用或聯合應用。易消化的氮源包括無機硝酸鹽如各種銨鹽、硝酸鹽和尿素以及有機的天然物質如酵母浸出液，酪素，肉汁、棉籽粉、玉米漿、豆粉等等，它們既可單用也可以聯合使用。當需要時培養基還包含有無機鹽、鐵、鎂、錳、鈷、銅、鈉、鉀、鈣、鋅等金屬鹽。此外如果有必要用的微生物的話，則培養基中應含有適量的特殊營養物，如胺基酸、維生素、核酸鹼基等等物質。只要能達到本發明的目的這些外加物的濃度沒有特別限定，可從常規發酵過程一般使用的範圍中適當選出合適濃度。
為了獲得黴病黴素較高的產量，最好使N-甲基化合物組合在培養基中。這種N-甲基化合物可包括在其分子中具有不少於1個可被1個到4個甲基取代氮原子。較好是在分子中有1個被1個或多個甲基取代的那些化合物，特別是具有三甲基氨基基團(其中氮原子被3個甲基取代，即
的季銨鹽最好。另外，在培養基中具有一個基團能轉化成N-OH3基團的化合物，如，N1N-甲撐雙丙烯醯胺，也能用作為所說的N-甲基化合物。N-甲基化合物通常分子量在50-1000範圍內，最好在90-130範圍內。N-甲基化合物可以是水溶性或水不溶的，但易水溶性的N-甲基化合物應用較為有利。這種N-甲基化合物的實例有;N-甲基酸醯胺，N-甲基氨基化合物、N-甲基胺、N-甲基銨化合物、N1N-甲基雙丙烯醯胺等等。N-甲基酸醯胺類有，例如N1N-二甲基乙醯胺，N-甲基-丙烯醯胺等等，N-甲基氨基化合物有，例如，N-甲基尿素，1，1，3，3-四甲基尿素，2-二甲基氨基乙醇等等;N-甲基胺有例如，三甲基胺，二甲基胺等等;N-甲基銨化合物有，例如，卵磷脂，膽鹼，甜菜鹼，四甲基銨，等等，以上物質都能有利地使用。使用N-甲基銨化合物，特別是膽鹼、甜菜鹼或四甲基銨可獲得滿意的結果。這些N-甲基化合物既可單獨使用也可以兩種、數種混合使用。在上述範圍內，為了使培養基中含有多於3毫摩爾的N-甲基化合物，本發明也包括一種方法，即在培養基中加入大量的含N-甲基化合物的物質，如含有甜菜鹼的甜菜糖密，含有卵磷脂的豆漿或含有卵磷脂的雞蛋等等。培養基中N-甲基化合物的濃度在不抑制所用微生物的生長範圍內進行擇優選擇，而且也可調整到大於3毫摩爾。合適的濃度為4毫摩爾到200毫摩爾，最適濃度為7到50毫摩爾，在超過200毫摩爾的更高濃度下，加入N-甲基化合物所獲得的效果與低於200毫摩爾濃度下N-甲基化合物獲得的效果比較，趨向不明顯。含有N-甲基化合物的天然物質用量的選擇，要使其N-甲基化合物濃度達到上述要求，但這種濃度需要用比常規培養所用的天然物質量要大，由此微生物的生長相反受到天然物質中N-甲基化合物以外成份的影響，從而阻止黴病黴素的產生。這時，最好把N-甲基化合物與天然物質聯合使用。考慮到操作方便和有效性，培養基中加入N-甲基化合物的時間。最好是在接種微生物到培養基中以前，但N-甲基化合物也可以在培養過程中的適當時間加入。
此外，在本發明的方法中，為了獲得更多的黴病黴素，培養基中可加入5-羥甲基胞嘧啶或一種能在培養基中能生成5-羥甲基胞嘧啶物質。5-羥甲基胞嘧啶或在培養基中能生成5-羥甲基胞嘧啶物質的濃度，以5-羥甲基胞嘧啶表示的適量為0.01～1.0%(重量/體積)，最適為0.03～0.5%(重量/體積)。培養基中加入這些物質的時間最好在有效的培養開始以前，但也可在培養過程中的適當時期加入。
雖然表面培養是可行的，但通氣的深層培養通常更適用。在進行通氣深層培養時，培養基的PH適宜在微酸到微鹼的範圍內，培養溫度最好保持在15-40℃，特別在24-34℃。這些培養條件當然可以按所應用的微生物的特殊菌株，外部條件和內部因素進行控制和選擇，以得到滿意的結果。不管怎樣，一般在開始培養後4～14天能獲得含有大量黴病黴素的培養液。為了從培養液中回收黴病黴素，最好使用從培養液中分離微生物代謝物的常規方法。例如，由於黴病黴素是一種水溶性鹼，其大部分存在於培養液的液體部分，通過過濾或離心可先把細胞從培養液中除去。然後把這樣得到的液體部分加入適當的吸附劑如活性炭、吸附樹脂、陽離子交換樹脂、活性氧化鋁或矽膠，或者用分子篩，使活性部分吸附在其上面的。然後，用水溶性的有機溶劑水溶液如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等等，以及酸性、鹼性緩衝液作成水溶液和無機或有機鹽的水溶液作為溶劑去洗脫活性部分。這些分離步驟也可以適當地配合進行，活性部分可濃縮並粉碎以得到單體或鹽形式的黴病黴素。
在本發明生產黴病黴素的方法中所使用的屬於鏈輪絲菌屬抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產黴病黴素的菌株，可通過把屬於鏈輪絲菌屬的產黴病黴素菌株誘導突變成抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸菌株而獲得。進行誘導突變的屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素的菌株，常用的是裂生鏈輪絲菌E5-24-5(這裡或以後都稱為「親本菌株」)。這個親本菌株，於1981年6月12日已保藏在IFO，保藏號為IFO-14125，並在1981年6月24日也已保藏在FRI，保藏號為FERM P-6052。為了引起菌株突變產生抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的菌株，應用的突變方法例如，應用屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素菌株的孢子或菌絲進行紫外線照射，或應用屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素的菌株與具有結構式為
〔Ⅳ〕的N-甲基N′-硝基-N-亞硝基胍接觸的方法，以及把屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素的菌株生長在含有其結構式
〔Ⅴ〕的D-4-氨基-3-異噁唑酮(俗名「環絲氨酸」)的培養基上的方法，或者把這些方法適當地結合使用。
例如，當採取用屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素菌株的孢子或菌絲用紫外線照射的方法進行突變時，親本菌株的孢子或菌絲用10～100瓦，最好是30～60瓦的紫外燈進行紫外線照射。紫外線波長通常是130～350毫微米，最好為190～290毫微米。照射時間通常30秒到5分鐘，最好為60秒到90秒。應當把親本菌株的孢子和菌絲懸浮在無菌水中後再進行照射。例如，將親本菌株的孢子懸浮在無菌水中，置30瓦紫外燈下方30釐米處，攪拌下照射90分鐘(波長2537
)以引起突變。
在採用把屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素的菌株與N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(Ⅳ)接觸的方法進行突變時，最好把菌株的孢子或單個細胞與化合物〔Ⅳ〕接觸。接觸可用任何一種方式進行，通常是用相互混合。進行接觸時的溫度範圍從0℃到50℃，最好為10℃到40℃，所需時間範圍常從10秒到3小時，最好是10分鐘到2小時。產黴病黴素菌株的孢子或單細胞可分散在適當的分散培養基中，此培養基由，1到9%(重量/體積)蔗糖、1到6%(重量/體積)穀氨酸鈉、0.001～0.1%(重量/體積)吐溫-80(由Kao Atlas Co.，Ltd.生產)和無菌水組成，培養基事先在110～130℃高壓蒸汽滅菌10～30分鐘。化合物〔Ⅳ〕可溶解在緩衝液如三氨基甲烷-鹽酸緩衝液(pH7.5)中後使用，其濃度為1.0到5000微克/毫升，最好為100到200微克/毫升。另外，在採用讓屬於鏈輪絲菌屬產黴病黴素株生長在含有環狀絲氨酸〔Ⅴ〕的培養基上的方法進行突變時，最好把產黴病黴素菌株培養在含環狀絲氨酸〔Ⅴ〕量為10～100微克/毫升的培養基上，最適為20～60微克/毫升。其它的培養條件可從前述的與培養抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產黴病黴素菌株有關的培養條件中適當地選擇。
從用上述引起突變的方法獲得的突變體中選擇抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產黴病黴素的菌株。也可按照在放線菌領域中通常使用的篩選方法進行選擇。例如把孢子懸浮液、孢子混合液或經突變處理獲得的生長菌株塗布或移種到含有絲氨酸氧肟酸鹽(40到200微克/毫升，最好為60到120微克/毫升)或刀豆氨酸(100到300微克/毫升，最好為110到240微克/毫升)的量足以阻止親本菌株生長的培養基上，然後，分離生長在培養基上的菌株。或者，把懸浮液，混合液或經突變處理獲得的生長菌株塗布在含有5-羥甲基胞嘧啶生物合成的抑制劑-氨基蝶吟(2到50微克/毫升，最好為5到20微克/毫升)的培養基上，然後讓菌株生長，接著切下一塊瓊脂，用常規方法測定這塊瓊脂的抗菌活力(測定菌紅色酵母)，篩選那些表現抗菌活力強的菌株，從而確定篩選出有絲氨酸氧肟酸鹽抗性優良的產黴病黴素菌株。通過重複上述獲得產黴病黴素菌株抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸鹽方法，抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸產黴病黴素菌株的性能得到進一步提高。經上述的產黴病黴素菌株對絲氨酸氧肟酸鹽或對刀豆氨酸的抗性突變，產黴病黴素菌株也能同時獲得抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸的抗性。這些菌株也包括在本發明屬於鏈輪絲菌屬抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸菌株的類型中。
通過上述本發明的方法，製得的黴病黴素能安全地植物上用作防止和治療白粉病製劑的有效成份，或作為殺菌或殺蟎劑的有效成份。(U.S.P.4007267，英國專利號1507193)
本發明中屬於鏈輪絲菌屬，抗絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸的產黴病黴素菌株，除了具有對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸高抗性外，在5-羥甲基胞嘧啶生物合成中有高的活力。
試驗實例1在由2%蔗糖，0.5%可溶性澱粉，0.12%硝酸銨，0.25%磷酸二氫鉀、0.005%硫酸鎂、0.0025%酪蛋白胺基酸、0.0025%酵母浸出液和2.0%瓊脂粉(%指重量/體積)組成的瓊脂培養基(pH7.0)中加入各種不同濃度的絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸。這樣配製成的培養基經120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘後，倒入培養皿中，每皿20毫升。冷卻後，每皿培養基上塗布如下試驗菌株的孢子。培養皿放在28℃下培養10天，確定了MIC即最小抑制生長濃度如表2所示。
試驗菌株(1)裂生鏈輪絲菌E5-24-5(2)裂生鏈輪絲菌CR3-182(3)裂生鏈輪絲菌CVR-48(4)裂生鏈輪絲菌CVR-16表2菌株 最小抑制生長濃度(微克/毫升)絲氨酸氧肟酸鹽 刀豆氨酸(1) 40 100(2) 70 120(3) 100 200(4) 40 400
試驗實例2配製由2.5%葡萄糖、2.0%玉米漿、1.0%棉籽粉(商品名Proflo，Trader Oil Mill Co.)、0.3%硫酸銨、0.05%硫酸鎂和0.3%碳酸鈣(%指重量/體積)組成的培養基，向其中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液以調節pH為7.0。這樣製得的培養基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中，每瓶25毫升，接著在120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。這些培養基上分別接種裂生鏈輪絲菌E5-24-5，CR3-182、CVR-48和CVR-16菌種的孢子，在28℃200rpm下旋搖培養20小時以得到種子培養液。然後配製由11%葡萄糖、3.0%山梨醇、3.0%酪素、0.5%玉米漿、20%Preflo、0.5%硫酸銨、0.5%硝酸銨、0.1%氯化膽鹼、0.005%硫酸鎂、0.005%硫酸鐵和0.003%硫酸銅(%指重量/體積)組成的培養基，向其中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液以調節pH為7.0。培養基中加入碳酸鈣使其濃度達1%(重量/體積)接著充分混合。這樣製得的培養基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中，每瓶25毫升，隨之在120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。每瓶培養基(25毫升)中加入上述的種子培養液2毫升，在28℃以200轉搖動培養3～5天。然後，按照(1985)「發酵工業月刊」63卷17頁所述的步驟製備無細胞提取液，進行酶反應和5-羥甲基胞嘧啶的測定，獲得結果如表3所示的產5-羥甲基胞嘧啶的活力。
表3菌株產5-羥甲基胞嘧啶的活力＊(毫微摩爾/分/毫克蛋白)E5-24-5 0.17CR3-182 0.24CVR-48 0.27CVR-16 0.19＊3天，4天，5天培養後的平均值。
實例1(1)在裂生鏈輪絲菌E5-24-5(FERM P-6052，IFO-14125)的斜面培養基上前面收集孢子和氣生菌絲，並放在由3%蔗糖、2%穀氨酸鈉和0.01%吐溫-80組成的分散培養基上(經120℃高壓蒸汽滅菌15分鐘)。混合液用陶瓷勻漿器充分研磨，研磨液用Toyo 101號濾紙(由Toyo Filter Paper Co.，Ltd.生產)過濾得到濾液為孢子和氣生菌絲碎片的懸浮液(25毫升)。
(2)在由(1)製得的懸浮液中加入等體積的溶解在三氨基甲烷-鹽酸緩衝液(0.1M，pH7.5)中的N-甲基N′-硝基-N-亞硝基胍，使其濃度達2毫克/毫升。混合液在28℃搖動90分鐘。把這樣得到的混合液塗布在含有濃度為30微克/毫升環狀絲氨酸的瓊脂平板培養基(pH7.0)上，在28℃靜止培養14天，該平板培養基的其他成份為2%蔗糖、0.5%可溶性澱粉、0.2%硝酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鉀、0.05%硫酸鎂、0.0015%硫酸鐵和2.0%瓊脂粉(%指重量/體積)。在長出的菌落中，分離出100個形態正常具有氣生菌絲的菌落。這些菌落分別用無菌玻璃棒研磨，每個被研磨菌落中加入10毫升無菌水，然後用Toyo 101號濾紙過濾得濾液。把濾液塗布在不含環狀絲氨酸的瓊脂平板培養基上，28℃靜止培養10天。把獲得的菌落分別轉接到瓊脂斜面上(培養基成份與上述的瓊脂平板培養基成份相同)。在28℃靜止培養10天。從斜面培養基表面刮面收集氣生菌絲和孢子，接著通過上述(1)中所述的懸浮、研磨、用濾紙過濾等步驟，製得100個懸浮液樣品。
(3)取第(2)步製備的100個懸浮液樣品(活菌量約1×105)分別塗布在100個對應編號的各含有10微克/毫升氨基蝶呤的瓊脂平板培養基的整個表面上，28℃下靜止培養10天。利用鑽孔器打出一個園柱狀塊(直徑6毫米，高約4毫米)，並轉移到測定其抗菌活力的培養基上(測試菌紅色酵母，肉汁瓊脂培養基，pH7.0)。把這樣處理過的培養基在30℃放置過夜。其中有5個懸浮液樣品顯示較大的(直徑14毫米或更大)抑菌圈(抑制生長圈)。
(4)第(2)步得到的100個懸浮液樣品分別用無菌水稀釋使每個樣品含活菌數為1×105/毫升。每個樣品取20微升稀釋後的懸浮液塗布在各含有40毫克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的相應編碼瓊脂平板培養基上，28℃下靜止培養14天。在100個樣品中，觀察到有在7個培養基上的生長，其中有5個樣品都顯示如上第(3)步的那樣較大抑菌圈。在5個樣品中有一個突變菌株形成如上第(3)步所述的最大抑菌圈，分離後標為裂生鏈輪絲菌CR1-18。
實例2用實例1中獲得的CR1-18菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5，按實例1的第(1)和(2)步的相同方法製備這菌株的150個懸浮液樣品。按照實例1中第(3)和(4)步方法，從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR2-125〔只要在第(4)步使用含濃度為50毫克/毫升的絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養基〕實例3用實例2製得的CR2-125菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5，按實例1中的第(1)和(2)步相同方法製備這菌株200個懸浮液樣品。按實例1中的第(3)和(4)步方法從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR3-182(FERM P-8334，IFO-14448)〔只要在第(4)步使用含濃度為6.0毫克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養基〕。
實例4用實例3獲得的CR3-182菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5，按實例1中的第(1)和(2)步相同方法從這菌株製備300個懸浮液樣品。按實例1中的第(3)和(4)步方法從這些樣品中分離出裂生鏈輪絲菌CR4-257〔只要在第(4)步使用含濃度為80微克/毫升絲氨酸氧肟酸鹽的瓊脂平板培養基〕。
實例5用實例4獲得的CR4-257菌株代替裂生鏈輪絲菌E5-24-5，按實例1中的第(1)和(2)步相同方法從這菌株製備100個懸浮液樣品。把每個懸浮液樣品塗布在含有濃度為190毫克/毫升刀豆氨酸的瓊脂平板培養基上。100個樣品在28℃下靜止培養14天。把只一個樣品中出現的菌落移接到由2.0%基糖，0.5%可溶性澱粉、0.12%硝酸銨、0.25%磷酸二氫鉀、0.005%硫酸鎂、0.0025%酪蛋白胺基酸、0.0025%酵母浸出液和2.0%瓊脂(%指重量/體積)組成的培養基上(pH7.0)，在28℃下靜止培養10天獲得具有抗絲氨酸氧肟酸鹽和刀豆氨酸特性的突變菌株CVR-48(FERM P-8333 IFO-14449)。
實例6在成份由2.5%葡萄糖、2%玉米漿、1.0%棉籽粉(商品名Proflo，由Trader Oil Mill Co.生產)。0.3%硫酸銨、0.05%硫酸鎂和0.3%碳酸鈣(%指重量/體積)組成的培養基中滴加20%(重量/體積)苛性鈉水溶液使pH達7.0。200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培養基，120℃下高壓蒸汽滅菌15分鐘。把裂生鏈輪絲菌E5-24-5、CR3-182和CVR-48菌株的孢子分別接種到培養基上，並在28℃，200轉下轉速下培養20小時，得到所需的各個種子培養液。然後，製備含11%(重量/體積)葡萄糖、3.0%山梨醇、3.0%乾酪素、0.5%玉米漿、2.0%Proflo、0.5%硫酸銨、0.5%硝酸銨、0.1%氯化膽鹼、0.005%硫酸錳、0.005%硫酸鐵和0.003%硫酸銅(%指重量/體積)的培養基，在其中滴加20%(重量/體積)的苛性鈉水溶液以使pH達7.0。在這培養基中加入碳酸鈣使其濃度達1%(重量/體積)，把混合液充分搖動，接著在每個200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培養基，於120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘製得發酵培養基。每瓶這樣製得的培養基中接入2毫升上述的種子培養液。在28℃200轉下搖動發酵培養10天。培養完後，按照「發酵工程雜誌」62卷537頁(1984)上描述的高效液相色譜方法定量測定黴病黴素。按上述方法進行的黴病黴素生產試驗，所得試驗結果如表4所列。
表4菌株 產生黴病黴素的數量(微克/毫升)E5-24-5 3887CR3-182 5755CVR-48 8000實例7在與實例6相同的條件下，把裂生鏈輪絲菌CVR-48進行發酵。收集發酵液，把1升發酵液經離心獲得的上清液，然後通過由2.5升離子交換樹脂Amberlite IRC-50(H+型)(Rohm Haas Co.)裝成的柱。柱用水洗，再用2.5升0.5%(重量/體積)氨水進行洗脫。活性部分(按實例6的定量測定方法)讓其流到由250毫升層析用活性炭(由Takeda Chemical Industries，Ltd.生產)裝成的柱中，使之吸附。用1.25升丙酮-水(3∶7)混合液洗脫。收集和濃縮洗脫的活性部分。在濃縮液中滴加500毫升甲醇促使粗的黴病黴素沉澱。過濾收集粉狀黴病黴素粗製品。用水溶解6.5克這樣的粉末，並使其流過由125毫升Amberlite CG-50(H+型)(由Rohm Haas Co.生產)裝成的柱。柱用50毫升水清洗，接著用1.25升0.5%(重量/體積)氨水洗脫。收集活性部分並上由250毫升活性碳裝成的吸附柱。用1.25升丙酮-0.1當量濃度甲酸(2∶8)進行分部洗脫，濃縮活性部分。在濃縮液中加入甲醇使黴病黴素沉澱，用離心法收集沉澱，在減壓下乾燥獲得5.5克黴病黴素甲酸鹽。在這甲酸鹽的物化性質中，熔點，比旋度(〔α〕24D水中濃度1.0，在0.1當量HCl中濃度1.0)和271毫微米和280毫微米處紫外吸收值完全符合「抗菌素雜誌」1978年31卷6期第523頁所報導的。
實例8在按實例1第(1)步使用裂生鏈輪絲菌E5-24-5製得的懸浮液中，加入等體積的溶解在三氨基甲烷-鹽酸緩衝液(0.1摩爾，pH7.5)中的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍溶液，使其濃度達2毫克/毫升。混合液28℃下搖動90分鐘。把這樣得到的上述混合液塗布在含300微克/毫升L-刀豆氨酸的瓊脂平板培養基上，28℃靜止培養14天。所得菌落分別移接到斜面瓊脂培養基上(培養基成份與上述的瓊脂平板培養基相同)。28℃下靜止培養10天獲得14個具有抗刀豆氨酸特性的突變菌株。
在與實例6相同的條件下，這些抗刀豆氨酸的突變菌株和親本菌株(E5-24-5)進行發酵，比較它們黴病黴素的產率。在它們中分離到表現最高產率的一個突變菌株，並編為裂生鏈輪絲菌CVR-16(FERM P-8874，IFO-14527)。親本菌株和突變菌株CVR-16按上述方法產生黴病黴素的量如表5所示。
表5菌株 產生黴病黴素的數量(微克/毫升)E5-24-5 3900CVR-16 4680
從上表很明顯看出突變菌株CVR-16生產黴病黴素能力要比親本菌株高得多。
實例9在與實例6相同的條件下，把裂生鏈輪絲菌CVR-16進行發酵。收集發酵液(1升)，按實例7相同的步驟處理髮酵液並分離和純化黴病黴素。通過這些步驟得到3.1克黴病黴素甲酸鹽。在這甲酸鹽的物化性質中，熔點、比旋度和271毫微米和280毫微米處的紫外吸收值與文獻報導的完全符合(文獻在實例7中已講過)。
本發明生產黴病黴素的方法，包括屬於鏈輪絲菌屬對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的產黴病黴素的菌株的培養，高效能的生產黴病黴素，因此是一個大量生產黴病黴素的在工業上優越的發酵方法。
勘誤表
勘誤表
權利要求
1.生產黴病黴素的方法，特徵在於培養屬於鏈輪絲菌屬和對培養液中的絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的菌株，促使所說菌株合成和積累黴病黴素，並從所得的培養物液中回收黴病黴素。
2.如權利要求
1中所述的生產黴病黴素的方法，它的特徵在於培養基中要含有至少3毫摩爾的N-甲基化合物。
3.如權利要求
(1)或權利要求
(2)所述的生產黴病黴素的方法，特徵在於培養基中要含有5-羥甲基胞嘧啶。
4.對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的裂生鏈輪絲菌能夠生產黴病黴素。
專利摘要
黴病黴素，在農業和園藝中用作抗菌劑，殺菌劑或殺蟎劑，通過在培養基中培養屬於鏈輪絲菌屬(Streptoverticillium)，並且對絲氨酸氧肟酸鹽或刀豆氨酸有抗性的產黴病黴素菌株，可以工業上便利地生產黴病黴素。上述培養基最好至少含有3毫摩爾的N-甲基化合物或/和含有5-羥甲基胞嘧啶，以促使所說菌株的合成積累黴病黴素，並從所得培養液中回收黴病黴素。
文檔編號C12P17/10GK86106265SQ86106265
公開日1987年8月12日 申請日期1986年8月20日
發明者沢田秀和 申請人:武田藥品工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan