通過法夫酵母生產角黃素的製作方法

2023-06-02 15:29:36 2

專利名稱：通過法夫酵母生產角黃素的製作方法
技術領域：
本發明涉及葉黃素類胡蘿蔔素的生產，尤其涉及通過法夫酵母(Phaffia)屬的微生物來生產角黃素和海膽烯酮。
更特別的，本發明提供了一種生產葉黃素類胡蘿蔔素的方法，尤其是通過遺傳修飾的法夫酵母屬的重組微生物來生產角黃素和海膽烯酮的方法。
採用本發明的方法，可以在法夫酵母屬的重組微生物中生產除了蝦青素之外的其他有用的葉黃素類胡蘿蔔素，如作為主要葉黃素類胡蘿蔔素的角黃素和海膽烯酮。
任何能生產β-胡蘿蔔素的菌株都可作為合適的宿主菌株。當選擇的宿主菌株是能從β-胡蘿蔔素中生產蝦青素的常規法夫酵母菌株時，在編碼β-胡蘿蔔素酮酶的基因被導入和表達後，可產生蝦青素和其他葉黃素類胡蘿蔔素的混合物。另一方面，當不能產生蝦青素和可積累β-胡蘿蔔素的菌株被選擇作為所述的宿主菌株時，可以預期產生最高水平的葉黃素類胡蘿蔔素如角黃素和海膽烯酮，並且無蝦青素的積累。可通過誘變累積蝦青素的紅法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)獲得累積β-胡蘿蔔素的宿主菌株。可選的，還可通過失活蝦青素合成酶來獲得累積β-胡蘿蔔素的宿主菌株，蝦青素合成酶是一種涉及從β-胡蘿蔔素中合成蝦青素的生物合成過程的酶，其公開於美國專利US 6,365,386中。蝦青素合成酶基因的破壞是酶失活最常規的方法之一。
此外，還可通過公共典型培養物保存中心獲得這類累積β-胡蘿蔔素的宿主菌株。例如，可從美國典型培養物保存中心(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)購買累積β-胡蘿蔔素的紅法夫酵母P.rhodozyma ATCC96815菌株。分離一種新的β-胡蘿蔔素累積紅法夫酵母菌株，它可以是從自然環境中產生蝦青素基因的菌株之衍生物或自發突變體，這將是製備本發明宿主菌株的另一種途徑。
一方面，本發明涉及一種生產角黃素和海膽烯酮的方法，其包括培養表達β-胡蘿蔔素酮酶的重組法夫酵母菌株。
所述的β-胡蘿蔔素酮酶催化β-胡蘿蔔素中的β-紫羅蘭酮環上的4和4′位置上的亞甲基轉化為酮基基團，從而經海膽烯酮產生葉黃素、角黃素。已從許多物種中分離得到編碼該酶的基因，例如從海洋細菌中分離的crtW(橙黃瓊脂桿菌(Agrobacterium aurantiacum)和產鹼菌屬(Alcaligenessp.))，從Paracoccus marcusii中分離的crtW(GenBank登記號No.Y15112)，從Paracoccus carotinifaciens sp.nov.中分離的crtW，和從雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中分離的bkt基因(GenBank登記號No.D45881)。
在本發明中，編碼具有β-胡蘿蔔素酮酶活性的蛋白的任何基因均可採用。
優選的，所述β-胡蘿蔔素酮酶基因可從選自如下屬微生物組的微生物中獲得土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產鹼菌屬、副球菌屬(Paracoccus)、和具有β-胡蘿蔔素酮酶基因的紅球藻(Haematococcus)。
更優選，所述β-胡蘿蔔素酮酶基因可從選自如下組的微生物中獲得橙黃瓊脂桿菌(GenBank登記號No.D58420)、產鹼菌PC-1(GenBank登記號No.D58422)、Paracoccus marcusii MH1(GenBank登記號No.Y15112)、格蘭氏陰性菌E-396(FERM BP-4283)(日本專利JP-A昭和10-155497的說明書中記載了來源於該微生物的β-胡蘿蔔素酮酶基因的DNA序列)、和攜帶β-胡蘿蔔素酮酶基因的雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)(GenBank登記號No.D45881)，其中GenBank登記號表示來源於不同微生物的各自的β-胡蘿蔔素酮酶基因的DNA序列。
更優選，所述的β-胡蘿蔔素酮酶基因可來源於產鹼菌PC-1，或者其基本上同源的DNA序列。
術語「基本上同源的DNA序列」是指所述編碼β-胡蘿蔔素酮酶的DNA序列為編碼胺基酸序列的DNA序列，其中該胺基酸序列與產鹼菌PC-1的crtW胺基酸序列相比具有超過60％，優選超過70％，更優選超過80％，和最優選超過90％的同源性，並且該多肽的胺基酸序列與產鹼菌PC-1的crtW編碼的酶具有相同類型的酶活性。
通過利用β-胡蘿蔔素酮酶基因，可以使法夫酵母屬的微生物具有生產角黃素和海膽烯酮的能力。可採用公知的重組技術來製備表達β-胡蘿蔔素酮酶基因的法夫酵母重組微生物。
用於分離和克隆編碼本發明β-胡蘿蔔素酮酶DNA的技術為本領域的常規技術，其包括從基因組DNA中的分離。可通過聚合酶鏈反應(下文中稱作PCR)來實現由這種基因組DNA來克隆本發明的DNA序列。
分離或克隆的編碼β-胡蘿蔔素酮酶的DNA在克隆至適當的表達載體後可優選的用於在宿主微生物法夫酵母中表達所述酶。
「表達載體」包括能表達所含的DNA序列的載體，其中所述的序列可操縱的與其他序列，如能影響所述DNA序列在法夫酵母屬的微生物中表達的調控序列相連接。術語「可操縱的連接」是指一種並列方式，其中所述的元件間呈以允許其按照其預期的方式行使功能的關係。術語「調控序列」包括，最小程度，是指感興趣基因表達所需的元件；並且還可包括其他的有用元件。一般而言，調控序列包括啟動子、終止子，和在某些情況下包括增強子、反式激活蛋白、或轉錄因子。組成型啟動子，如來源於紅法夫酵母(P.rhodozyma)(WO 97/23,633)的甘油醛-3-脫氫酶(GAP)基因啟動子可用於實現組成型表達。誘導型啟動子還可被用於實現精確調控表達。誘導型啟動子的實施例之一為編碼熱休克蛋白或澱粉酶基因及其類似物的啟動子。
本領域技術人員公知的方法可被用於構建所述的表達載體。
它的含義是，雖然沒有清楚的闡述，即所述表達載體必須以游離基因的方式或作為整合至染色體DNA的一部分的方式在宿主有機體中進行複製。通常，在後一種情況下可以預計所述基因具有更高的穩定性。為了通過同源重組的方式將表達載體整合至宿主微生物染色體上，製備含有與宿主基因組DNA同源的DNA片段的至少一部分的載體。基於此，在法夫酵母屬的微生物中可有效的採用rDNA基因片段。所述的rDNA為一種在基因組中以多拷貝方式存在的衛星DNAs。通過採用rDNA片段作為表達載體上的靶DNA，所述載體上的待表達目的DNA可被整合至宿主基因組上，並且也可以多拷貝的形式存在。這可提高基因用量效果，從而有助於目標酶的超表達。在本發明實施例中，所述的rDNA片段可以方便的用於該目的。本發明試圖包括那些具有等效功能，並在以後公開的其他形式的表達載體。
可採用各種方式來操縱編碼β-胡蘿蔔素酮酶的分離的DNA序列以實現多肽表達。根據表達載體的需要，在插入表達載體之前，可取的或必須的可對編碼所述β-胡蘿蔔素酮酶的核酸序列進行操作。修飾用於克隆方法的核酸序列的技術是本領域已知的。
克隆於表達載體中的含有所述β-胡蘿蔔素酮酶的重組DNA可被導入宿主微生物中。將外源DNA導入真菌細胞(包括法夫酵母屬的微生物)中的方法是本領域公知的。其包括，例如，通過LiCl方法轉化，原生質體融合，電穿孔，通過採用DNAs包裹的粒子進行轟擊的粒子槍方法。在本發明的實施例中，採用粒子槍方法作為紅法夫酵母的轉化方法。本領域技術人員公知粒子槍方法的操作步驟。
從而獲得的重組有機體可超表達編碼β-胡蘿蔔素酮酶的DNA序列。因此，本發明的重組有機體可用於葉黃素類胡蘿蔔素，尤其是角黃素和海膽烯酮的生產過程。
本發明的另一方面涉及一種生產角黃素和海膽烯酮的生物方法，其包括在需氧條件下，在含有生產類胡蘿蔔素底物的水溶液營養培養基中培養法夫酵母重組微生物，並從所述重組微生物或從培養基中分離獲得的類胡蘿蔔素。
包括葉黃素的類胡蘿蔔素通常通過在培養基中培養法夫酵母菌株來生產，其中所述培養基含有細胞所需的適量的大量和微量營養元素，如作為細胞生長所需的碳源和生產類胡蘿蔔素的底物的糖蜜、蔗糖或葡萄糖，以及氮源如玉米浸出液、酵母提取物、硫酸氫二銨、磷酸銨、氫氧化銨或尿素，以及磷源如磷酸銨和磷酸，和添加的微量營養元素或無機鹽，如硫酸鎂、硫酸鋅和生物素或脫硫生物素。
培養的優選條件為4至8的pH範圍，溫度為15至26℃，培養24至500小時。更優選的培養條件為5至7的pH範圍，溫度為18至22℃，培養48至350小時。
在培養過程中，通氣和攪拌通常有助於獲得更好的類胡蘿蔔素生產效果。
當採用本發明的方法，通過培養重組法夫酵母菌株生產得到類胡蘿蔔素後，當其分泌至培養基中時，可從培養基中分離類胡蘿蔔素，或從微生物細胞中分離；並且當只需要一種特定類胡蘿蔔素時，如果需要，可採用本領域公知的方法將其與其他類胡蘿蔔素分離開。
按照本發明方法生產得到的類胡蘿蔔素可用於食品或飼料的加工。本領域普通技術人員熟知該過程。這類複合食品或飼料可進一步包括常規用於該目的、且本領域公知的添加劑或組分。
如下實施例用於進一步舉例說明本發明，且其不用於限制本發明的範圍。
在下述實施例中採用如下材料和方法菌株紅法夫酵母ATCC96594菌株(按照布達佩斯條約於1998年4月8日進行再保藏，保藏號No.ATCC 74438)紅法夫酵母ATCC96815菌株(按照布達佩斯條約於1999年2月18日進行再保藏，保藏號No.ATCC 74486)E.coli TOP10F-，mcrA，δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，δ(lacZ M15)，δ(lacX74)，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司，Carlsbad，USA)pGEM-T(Promega公司，USA)方法限制性內切酶和T4DNA連接酶購於Takara Shuzo(Ohtsu，JP)。利用Perkin Elmer2400型熱循環儀進行聚合酶鏈反應(PCR)。每個PCR條件均在實施例中記載。從商業提供商處購得PCR引物。用於DNA測序的螢光DNA引物購於Pharmacia。採用自動螢光DNA測序儀(ALFred，Pharmacia)進行DNA測序。
β-胡蘿蔔素的標準樣品購於WAKO(Osaka，日本)。葉黃素和海膽烯酮購於Roche Vitamins AG(Basle，瑞士)。
實施例1表達載體元件的製備製備了表達載體元件G418抗性基因，紅法夫酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(下稱GAP)的啟動子和終止子區域，和P.rhodozyma的rDNA片段。
按如下方法製備G418抗性基因盒。將Sac I-接頭連接至攜帶有G418抗性基因盒的pUC-G418(US專利No.6,365,386 B1)載體的特定Hind III位點，將得到的載體命名為pG418Sa512。
將從pG418Sa512上切下的1.7kb KpnI/Sac I片段用作G418抗性基因盒。
利用紅法夫酵母ATCC 96594的基因組DNA作為模板，通過PCR得到GAP基因的每一啟動子和終止子以及rDNA片段。為了獲得基因組DNA，使用了QIAGEN血液細胞培養DNA中型試劑盒(QIAGEN，德國)和通過在YPD(Difco實驗室)培養基中過夜培養得到的P.rhodozyma ATCC 96594細胞。
採用製備的基因組DNA作為模板，利用Advantage-HF PCR試劑盒(CLONTECH實驗室，Inc.，USA)和熱循環儀(Perkin Elmer 2400，USA)進行PCR反應。
用於擴增GAP啟動子序列的合成引物為GAP#1(SEQ ID NO1)(具有Not I位點GCGGCCGC)和GAP#5(SEQ ID NO2)(具有Sma I位點CCCGGGG)。
開始的模板變性步驟包括94℃5分鐘。重複25個擴增循環94℃30秒，55℃30秒，和72℃1分鐘。在72℃下反應另外10分鐘後，將反應混合物在4℃下保存。通過該反應，擴增得到了含GAP啟動子(398bp)的DNA片段。採用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司，USA)將該擴增的GAP啟動子與pCR2.1-TOPO載體連接並導入E.coli TOP 10細胞中。挑選了幾個克隆子用於測序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的GAP啟動子序列。將顯示出具有與紅法夫酵母GAP啟動子序列(GenBank登記號No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-pGAP2#1。從pTOPO-pGAP2#1上切下的一398bp NotI/Sma I片段被用作GAP啟動子表達盒。
用於擴增GAP終止子的兩條合成引物為GAP#33(SEQ ID NO3)(具有BamH I-Sal I位點GGATCCGTCGAC)和GAP#4(SEQ ID NO4)(具有Kpn I位點GGTACC)。
其PCR反應條件與上述GAP啟動子的反應條件相同。通過該反應，擴增獲得了含GAP終止子(302bp)的DNA片段。採用TOPO TA克隆試劑盒將擴增的GAP終止子與pCR2.1-TOPO載體連接並導入E.coli TOP 10細胞中。挑選了幾個克隆子用於測序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的GAP終止子序列。將顯示出具有與紅法夫酵母GAP終止子序列(GenBank登記號No.Y08366)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-tGAP#1。從pTOPO-tGAP#1上切下的一302bp BamHI/Kpn I片段被用作GAP終止子表達盒。
用於擴增rDNA片段的的兩條合成引物為R#1(SEQ ID NO5)(具有Sac I位點GAGCTC)和R#2(SEQ ID NO6)(具有NotI-Sac I位點GCGGCCGCGAGCTC)。
其PCR反應條件與上述GAP啟動子的反應條件相同。通過該反應，擴增獲得了含rDNA(3126bp)的DNA片段。採用TOPO TA克隆試劑盒將擴增的rDNA片段與pCR2.1-TOPO載體連接並導入E.coli TOP 10細胞中。挑選了幾個克隆子用於測序分析。檢查了每一候選克隆子的克隆的rDNA序列。將顯示出具有與紅法夫酵母rDNA序列(GenBank登記號No.D31656,AF139632)完全相同的序列的DNA克隆子之一命名為pTOPO-rDNA#1。從pTOPO-rDNA#1上切下的一1960bp SacII/Not I片段被用作rDNA表達盒。
實施例2攜帶β-胡蘿蔔素酮酶基因(crtW)的表達載體的構建及其在角黃素和海膽烯酮的生產中的用途通過逆向翻譯胺基酸序列(GenBank登記號D58422)，採用基於PCR的基因合成方法獲得了編碼產鹼菌株PC-1的β-胡蘿蔔素酮酶的人工crtW基因。詳細的方法記載於US 6,124,113專利的實施例中。在該情況下，設計了兩條末端引物用於分別向crtW基因的5′-末端和3′-末端導入限制性酶切位點Sma I和BamH I。
採用pGEM-T做為主鏈，按順序連接rDNA表達盒和GAP啟動子表達盒(實施例1中獲得的)，以及上述構建的crtW基因，和GAP終止子表達盒和G418抗性基因表達盒(實施例1中獲得的)，從而構建攜帶crtW基因的表達載體。
採用如EP 1,158,051中所述的粒子槍方法將獲得的表達載體導入紅法夫酵母ATCC 96815中。
將獲得的P.rhodozyma ATCC 96815的crtW-重組菌株首先在盛有7ml種子培養基的試管(直徑21mm)中在20℃下震蕩培養3天，然後將其接種至盛有50ml生產培養基的500ml錐形瓶中在20℃下震蕩培養7天。取適量體積的培養物用於細胞生長分析和類胡蘿蔔素生產。
培養基組分如下種子培養基葡萄糖30.0g/l，NH4Cl 4.83g/l，KH2PO41.0g/l，MgSO4-7H2O 0.88g/l，NaCl 0.06g/l，CaCl2-2H2O 0.2g/l，KH phtalate 20.0g/l，FeSO4-7H2O 28mg/l，微量元素溶液0.3ml，維生素貯存液1.5ml，(調節pH5.4-5.6)微量元素溶液4NH2SO4100ml/l，檸檬酸-H2O 50.0g/l，ZnSO4-7H2O16.7g/l，CuSO4-5H2O 2.5g/l，MnSO4-4，5H2O 2.0g/l，H3BO32.0g/l，Na2MoO42.0g/l，KI 0.5g/l，用於種子培養基的維生素貯存液4N-H2SO417.5ml/l，肌醇40.0g/l，煙酸2.0g/l，D-泛酸鈣(Ca-D-Pantothenate)2.0g/l，維生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-對氨基苯甲酸1.2g/l，維生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液8.0ml生物素貯存液通過向50ml乙醇中添加4N-H2SO4至總體積100ml來製備。然後，加入400mg的D-生物素。
生產培養基葡萄糖22.0g/l，KH2PO414.25g/l，MgSO4-7H2O 2.1g/l，CaCl2-2H2O 0.865g/l，(NH4)2SO43.7g/l，FeSO4-7H2O 0.28g/l，微量元素溶液4.2ml，維生素貯存溶液9.35ml，(調節pH至5.5)用於生產培養基的維生素貯存溶液4N H2SO417.5ml/l，煙酸2.0g/l，D-泛酸鈣3.0g/l，維生素B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-對氨基苯甲酸1.2g/l，維生素B6(吡哆辛HCl)0.2g/l，生物素貯存液30.0ml一部分種子培養物(2.5ml)被轉移至盛有47.5ml生產培養基的500ml的錐形瓶中。然後在20℃下以200rpm的速度旋轉震蕩培養。在發酵後第二天，向培養基中加入50％葡萄糖溶液5ml並繼續發酵。在發酵的第四天，取2ml培養物並再次向培養基中加入5ml 50％葡萄糖溶液，並繼續培養3天。在第七天，取部分培養物用於類胡蘿蔔素產量和細胞生長的分析。
為了進行細胞生長分析，採用UV-1200光度計(Shimadzu Corp.，Kyoto，日本)測量660nm處的光密度。
為了進行β-胡蘿蔔素，角黃素和海膽烯酮含量的分析，將提取的培養基與溶劑混合物(乙基乙醇，己烷和乙基乙酸鹽)混合，並通過加入玻璃珠劇烈震蕩從P.Rhodozyma的細胞和培養物中提取類胡蘿蔔素。提取後，通過離心除去破裂的細胞和玻璃珠，取獲得的上清液利用HPLC進行類胡蘿蔔素含量分析。
使用的HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)；溫度室溫；洗脫液丙酮/己烷(18/82)加到1ml/l水用於洗脫；注射體積10μl；流速2.0ml/min；檢測450nm UV。
序列表110Roche Vitamins AG120通過法夫酵母生產角黃素130NDR52241606170PatentIn version 3.1210121128212DNA213人工的4001gcggccgctg gtgggtgcat gtatgtac 28210221126212DNA213人工的4002cccggggatg gtaagagtgt tagaga 26210321133212DNA213人工的4003gga tccgtcg actaaacggt tctctccaaa ccc 33210421128212DNA213人工的4004ggtaccttga tcagataaag atagagat 28210521120212DNA213人工的4005gagctctcga gtggacggtg 20
210621128212DNA213人工的4006gcggccgcga gctcatcccg cttcactc 28
權利要求
1.一種生產角黃素和海膽烯酮的方法，其包括在需氧條件下，在含水營養培養基中培養Xanthophyllomyces(法夫酵母Phaffia)屬的表達β-胡蘿蔔素酮酶基因的重組微生物，並從所述重組微生物細胞或從液體培養物中分離得到的類胡蘿蔔素。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述重組微生物來源於Xanthophyllomyces dendrorhous(紅法夫酵母Phaffia rhodozyma)ATCC96815，或其突變體。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿蔔素酮酶基因來源於選自如下的微生物土壤桿菌屬、產鹼菌屬、副球菌屬、和紅球藻，其具有β-胡蘿蔔素酮酶基因。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿蔔素酮酶基因來源於選自橙黃瓊脂桿菌、產鹼菌PC-1、Paracoccus marcusii MH1、革蘭氏陰性菌E-396(FERM BP-4283)、和雨生紅球藻，其攜帶β-胡蘿蔔素酮酶基因的。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述β-胡蘿蔔素酮酶基因來源於產鹼菌PC-1或與其基本上同源的β-胡蘿蔔素酮酶基因的DNA序列。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述的β-胡蘿蔔素酮酶基因在使用了調控序列的重組微生物中表達。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述培養在pH4至8的範圍和15至26℃的溫度範圍中培養24至500小時。
8.如權利要求7所述的方法，其中培養在pH5至7的範圍和18至22℃的溫度範圍中培養48至350小時。
全文摘要
本發明公開了一種生產角黃素和海膽烯酮的方法，其包括在需氧條件下，在水溶液營養培養基中培養一種來源於Xanthophyllomyces(法夫酵母)屬的、表達β－胡蘿蔔素酮酶基因的重組微生物，並從所述的重組微生物細胞中或從培養基中分離得到類胡蘿蔔素。
文檔編號C12N9/02GK1788091SQ03825474
公開日2006年6月14日 申請日期2003年9月16日 優先權日2002年9月27日
發明者星野達雄, 尾島和之, 瀨戶口豐 申請人:Dsm Ip資產公司