一種桶形α芋螺多肽Bt1.3及其應用的製作方法

2023-06-02 15:15:51 1

專利名稱：一種桶形α芋螺多肽Bt1.3及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種桶形α芋螺多肽Btl. 3及其應用。
背景技術：
神經性疼痛是一種由中樞或外周神經系統原發性病變或功能障礙而引起的疼痛綜合症。神經性疼痛的典型症狀包括感覺異常、痛覺過敏和痛覺超敏等。目前許多重大疾病(如癌症、愛滋病、創傷性神經損傷、麻瘋病、硬化症、帶狀皰疹)均可導致神經系統功能的損傷而引發神經性疼痛，臨床上常用的藥物主要有抗驚厥藥(如萊提西酞、奧卡西平)、 阿片類藥(如嗎啡等)和各種抗抑鬱藥的聯用，但是由於毒副作用以及長期用藥帶來的耐受性、成癮性等問題，治療效果不佳。因此，開發新一代高活性、低耐受和非成癮的鎮痛藥物十分必要。最新研究表明神經元型亞型nAChRs α 9 α 10，α 7及α 3 β 2與鎮痛相關，是發展無致癮慢性鎮痛藥物的理想靶點。α -芋螺毒素(a -CTX)是最早從芋螺毒腺管中純化出的一類多肽，屬於A超家族， 一般由9-18個胺基酸組成，含有2對二硫鍵，框架結構為CCXmCXnC (C代表半胱氨酸，X代表非半胱氨酸，m和η表示非半胱氨酸的數量)，根據m和η的不同，α-CTX被劃分為α 3/5、 α 4/3、α 4/6、α 4/7等亞家族。其中α 3/5，如α -MI，主要作用於脊椎動物的肌肉型乙醯膽鹼受體，其他亞型則大多選擇性地作用於脊椎動物的神經型乙醯膽鹼受體的不同亞型(如 α 3 β 2、α 9 β 10等)。在鎮痛活性研究方面，目前發現RglA、Vcl. 1、MII三種α -芋螺多肽具有較好的鎮痛活性(Callaghan B et al. J Neurosci, 2008 ；28 :10943-10951 ；Young T et al. Brain Res. 2008 ；1229 :118-124.)，可以減輕由於創傷、炎症、或神經性損傷引起的疼痛。α芋螺多肽RglA、Vcl. 1的鎮痛作用靶點可能是乙醯膽鹼受體α 9 α 10亞型(Vincler et al.PNAS. 2006，103 06) ,17880-17884)，而MII的作用靶點是乙醯膽鹼受體α3β2亞型(Young Y，et al. Brain Res.，2008，1229 :118-124)。作用於外周神經系統，可以採用多肽皮下、肌肉或腹腔等給藥方式，方便應用。Vcl. 1鎮痛靶點的最新研究表明，Vcl. 1是通過GABAB介導的N型鈣通道的抑制而發揮鎮痛作用(Klimis H et al. PAIN 2011,152 259466)，但也有可能與目前未發現的機制相關。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種桶形α芋螺多肽Btl. 3。本發明提供的多肽，其胺基酸序列為序列表中的序列2。所述多肽的編碼基因也是本發明保護的範圍。所述多肽的編碼基因為如下⑴或(2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能多肽的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能多肽的DNA分子。 上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在68°C下雜交，然後用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。所述的多肽在製備鎮痛的產品中的應用也是本發明保護的範圍。所述產品為藥品。利用α芋螺毒素信號肽的保守區及3』 RACE克隆方法，從中國南海西沙群島海域的桶形芋螺(Conus betulinus)毒腺管中克隆獲得一條新的α 4/7型芋螺多肽Btl. 3基因 (圖1)，NCBI序列比對分析表明該芋螺多肽具有全新的胺基酸組成，與目前報導的α型芋螺多肽在胺基酸組成上具有顯著差異。利用Fmoc-固相肽合成法合成了 Btl. 3線性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然後在 NH4HCO3緩衝液中一步摺疊，產物形成2個峰(第I峰和第II峰，圖2Α)。一般天然α芋螺毒素的二硫鍵連接方式主要為「C1-C3，C2-C4」，呈球狀結構，在反相HPLC分析中出峰較早。 為進一步證實Btl. 3摺疊I峰的二硫鍵排列方式，合成了 Cl及C3位半胱氨酸帶有側鏈保護基 Acm (乙醯胺)的線性肽(RKC (Acm) CSNPAC (Acm)NRYNPAIC)。第一步在 pH 7. 7 的 0. IM Tris-HCl緩衝液氧化約2 後形成含一對二硫鍵(C2-C4)的產物(圖2B_b)，純化該產物並在碘溶液中脫去Acm得到二硫鍵排布為(C1-C3，C2-C4)的產物III峰(圖2B_c)。然後將一步摺疊獲得的產物I峰(圖2A)與二硫鍵已知的兩步法產物III峰共同進樣，結果表明二者保留時間一致(圖2B-d)。證實Btl. 3 一步摺疊I峰的二硫鍵排列方式為「C1-C3， C2-C4」。質譜測定其荷質比「M+1」為1907. 87，與理論計算值相符(理論值為1907.81)。然後，用大鼠坐骨神經半切模型(PSL)測定Btl. 3-1的鎮痛活性，結果表明 Btl. 3-1具有很強的鎮痛活性，肌肉注射很低劑量的Btl. 3(0. 3nmol/只)即可使大鼠痛閾提高約沈.7%，與同劑量Vcl. 1的鎮痛活性相當。在一定劑量範圍內，該肽的鎮痛效果呈現劑量依賴性(圖3)。此外，對Btl. 3的作用靶點進行了研究。將大鼠乙醯膽鹼受體α3β2和α3β4 亞型表達在非洲爪蟾卵母細胞上，用雙電極電壓鉗測定Btl. 3-1對亞型乙醯膽鹼激發電流的抑制作用，結果表明Btl. 3可特異性地作用於α 3 β 2亞型，IOOOnM的Btl. 3-1即可抑制大鼠神經元α 3 β 2亞型乙醯膽鹼激發電流約65. 3%，而對α 3 β 4亞型作用弱(圖4)。本發明的實驗證明，本發明合成的Btl. 3多肽，具有很強的鎮痛活性，此且其可特異性地作用於α3β2亞基。


圖1為Btl. 3前體肽cDNA序列和預測的翻譯產物，下劃線所示為信號肽序列，陰影部分為成熟肽序列。圖2為合成Btl. 3的檢測圖，圖2A為Btl. 3 —步氧化摺疊產物HPLC分析；a)線性肽；b) —步摺疊產物I和II ； c)純化後的產物I。
圖2B為Btl. 3兩步摺疊產物III及與一步摺疊產物I共進樣HPLC分析；a)線性肽；b)第一步摺疊產物；C)第二步摺疊產物III ；d)摺疊產物I與III的混合樣品。圖3為Bt 1. 3-1給藥後1. 5h痛閾值變化，柱狀圖表示PNL大鼠肌肉注射生理鹽水、Vcl. 1及不同劑量Btl. 3，1. 5h後的平均痛閾值提高率(％)。圖4為Btl. 3對不同神經型nAChR的作用效果，a) -c)分別為10nM、50nM及IOOOnM Btl. 3對大鼠α 3 β 2亞型ACh激發電流的抑制效果。d) IOOOnM Btl. 3對大鼠α 3 β 4亞型ACh激發電流的抑制效果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、α -芋螺多肽Btl. 3的合成一、α -芋螺多肽Btl. 3的基因克隆l、cDNA 的合成從中國南海西沙群島海域採集的活體桶形芋螺(Conus betulinus)作為樣本材料。採用iTrizol法提取芋螺毒腺管總RNA。使用大連TaKaRa公司3，Fu 11-RACE試劑盒 (3』 -Full RACE Core Set Ver 2. 0)進行cDNA的合成，具體方法如下先按比例添加下列組分
權利要求
1.一種多肽，其胺基酸序列為序列表中的序列2。
2.權利要求1所述多肽的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述多肽的編碼基因為如下(1)或 (2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能多肽的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能多肽的DNA分子。
4.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。
5.權利要求1所述的多肽在製備具有鎮痛功能的產品中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述產品為藥品。
全文摘要
本發明公開了一種桶形α芋螺多肽Bt1.3及其應用。本發明提供了一種桶形α芋螺多肽Bt1.3，其胺基酸序列為序列表中的序列2；所述多肽的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cys1-Cys3和Cys2-Cys4；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cys1、Cys2、Cys3、Cys4。本發明的實驗證明，利用Fmoc-固相肽合成法合成了Bt1.3線性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然後在NH4HCO3緩衝液中一步摺疊，得到Bt1.3多肽，鎮痛實驗表明，本發明的α型芋螺多肽在大鼠坐骨神經半切模型中表現出很強的鎮痛活性。
文檔編號C07K7/08GK102190708SQ201110086538
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年3月30日
發明者付超, 劉娜, 劉珠果, 孫婷, 戴秋雲, 胡潔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所