表面核仁素的多價合成配體在治療癌症或發炎中的用途的製作方法

2023-06-02 15:03:21 1

專利名稱：表面核仁素的多價合成配體在治療癌症或發炎中的用途的製作方法
表面核仁素的多價合成配體在治療癌症或發炎中的用途
本發明涉及一種多價合成化合物在製備用於治療涉及細胞增殖和/或血管生成 下調的疾病以及優選地作為表面核仁素配體的藥物中的用途，該化合物包含或者 由一個載體(support)組成，在所述載體上至少三個假肽單元被接枝，該化合物通式
(I)為 Met/Cys標記的全核仁素和N-和l C-術端部分(分別含有胺基酸1-707， 1-308和 309-707)。然後以生物素化的HB19來溫育標記的粗產物，複合體在親和素-瓊脂糖 柱上純化。如所期望的，全核仁素與HB19相互作用。另一方面，富含酸性殘基的 核仁素的N-末端部分根本不與該化合物相互作用，而核仁素的C-末端含有HB19 的靶位(14)。鑑定了含有HB19靶位的核仁素的C-末端後，製造了這個區域的各種 構建體(N。l-9)。第一個構建體對應於編碼人核仁素(包括4個RBD和RGG結構域) 的C-末端部分的cDNA，與GST蛋白(穀胱甘肽S-轉移酶)融合以進行用抗-GST抗 體的檢測。其它的構建體，也是與GST融合，對應於同樣的部分但一個或多個較 短結構域。所有這些蛋白以五.co/Z產生。HB19與每個構建體相互作用的能力這樣 測定將表達不同的核仁素構建體的細菌粗提物與生物素化的HB19溫育，然後固 定於親和素-瓊脂糖以進行純化。然後以聚丙烯醯胺凝膠和GST分析這些樣品，使 用抗-GST抗體以免疫檢測(Westem Blot)顯示。結果表明RGG結構域的存在對於 HB19與核仁素的C-末端部分相互作用是必需的。而且，RGG結構域自身對這種 相互作用已足夠。
圖2.A.化合物HB19的結構。B.三價化合物Nucant01的結構，所述Nucant 01具有環形六肽作為載體，所述環形六肽由交替的D構型的丙氨酸殘基(A)禾口 L 構型的賴氨酸殘基(K)組成。3個假肽單元KvPR(v^CH2-N)共價連接至每個賴氨酸 殘基(K)的s氨基基團；C.五價化合物Nucant 2(SEQ ID NO: 10)的結構，所述Nucant 2具有直鏈肽作為載體，所述直鏈肽具有SEQIDNO: 8序列的螺旋面結構，其中 5個假肽單元Kv]/PR(fCH2-N)共價逢接至5個賴氨酸殘基中的每個的s氨基基團，Ac代表CH3-CO-基團；D.五價化合物Nucant 3(SEQ ID NO: ll)的結構，所述 Nucant 3具有直鏈肽作為載體，所述直鏈肽具有SEQ ID NO: 9序列的螺旋面結構， 其中5個假肽單元KyPRO-CH2-N)共價連接至5個賴氨酸殘基(K)中的每個的e氨 基基團，Ac代表CH3-CO-基團。E.六價化合物Nucant 6(SEQ ID NO: 16)的結構， 所述Nucant 6具有直鏈肽作為載體，所述直鏈肽具有SEQ ID NO: 15序列的螺旋 面結構，其中5個假肽單元KvPR(vi/《H2-N)共價連接至6個賴氨酸殘基(K)中的每 個的s氨基基團，Ac代表CH3-CO-基團。F.六價化合物Nucant 7(SEQ ID NO: 17)的結構，所述Nucant 7具有直鏈肽作為載體，所述直鏈肽具有SEQ ID NO: 13 序列的螺旋面結構，其中6個假肽單元KvPR(x^CH2-N)共價連接至6個賴氨酸殘 基(K)中的每個的s氨基基團，Ac代表CH3-CO-基團。
圖3. A.抗-核仁素(抗Nu)， B.同位型IgG， C.肽F3和D. HB-19在經HARP 刺激的NIH-3T3細胞增殖中的效應。在所示濃度的HB19存在或不存在的情況下， 不剌激或以4 nM HARP刺激靜止的NIH-3T3細胞。溫育24小時後，通過測定氚 化胸苷的引入來確定細胞增殖。結果以相對於經HARP刺激的對照(100%)的百分 率給出。MSD(起點)，(**p<0.01， ***p<0.001)。
圖4.以HB19預處理NIH-3T3細胞1個小時在HARP誘導的增殖中的效應。 NIH-3T3細胞以HB19處理1個小時，然後洗滌，不刺激或以3.6 nM HARP刺激。 溫育24小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞增殖。結果以相對於經HARP 刺激的對照(100%)的百分率給出。MSD(起點)，(**p<0.01， ***p<0.001)。
圖5. HB-19在經0.2 nM FGF-2(A)刺激或5。/。胎牛血清(B)刺激的NIH-3T3細胞 增殖中的效應。在所示濃度的HB19存在或不存在的情況下，以FGF-2或5%血清 刺激靜止的NIH-3T3細胞。溫育24小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞 增殖。結果以相對於經HARP刺激對照(100。/。)的百分率給出。MSD(起點)， (**p<0.01， ***p<0.001)。
圖6.抗-核仁素(抗Nu)(A)， IgG同位型(B)和HB-19(C)對MDA-MB231在溼 瓊脂上生長的效應。MDA-MB231細胞在培養基上培養，所述培養基在0.6%瓊脂 基質上含有0.35%瓊脂。培養10天後，直徑大於50 的克隆被計數。每孔5個 區域，每個點三次重複("pO.Ol)。
圖7.抗-核仁素(抗Nu)(A)和HB19(B)對B16-BL6在溼瓊脂上生長的效應。 B16-BL6細胞在培養基上培養，所述培養基在0.6%瓊脂基質上含有0.35%瓊脂。 培養10天後，直徑大於50 的克隆被計數。每孔5個區域，每個點三次重複 (*p<0.05， **p<0.01)。
圖8. HB-19在血管生成中的效應。A. HB-19在HUVEC細胞體外增殖中的效 應。20000個HUVEC細胞在孔中培養，每天加入不同濃度的化合物HB19。處理 6天後對細胞計數。B.也測定了 HB19(1 pM)在HUVEC細胞分化中的效應，所述 HUVEC細胞在HARP血管生成因子(l nM); VEGF(l nM)和FGF-2(3 nM)存在下以
22三維膠原凝膠培養。結果以任意單位表現。C.體內血管生成模型(matrigel插入檢 領ij)(matrigel plug assay)中，HB-19在HARP或FGF-2引發的血管生成中的效應。 將含有所示濃度的分子的matrigel(300 pl)經皮下注射入小鼠。l周后殺死小鼠，除 去matrigd。進行8 ^m厚的切片。染色後，通過圖像分析估計內皮細胞的數目。 對於每個matrigel，每個實驗點分析5個切片和4隻小鼠。
圖9. MDA-MB231異種移植模型中，HB-19在腫瘤生長中的效應。人乳腺癌 MDA-MB231細胞經皮下注射入無胸腺小鼠(裸)。當腫瘤達到200 mm3的體積時， 以圖A中所示的皮下途徑處理小鼠。B.在第40天殺死的小鼠中腫瘤的觀測和測 量。C.在第40天殺死的小鼠的腫瘤重量。


圖10.MDA-MB231異種移植模型中，HB-19在腫瘤生長中的效應。腫瘤生長 的變化。腹腔內(IP)或皮下(SC)注射。
圖11.MDA-MB231異種移植模型中，HB-19在轉移的腫瘤細胞中的效應。使 用抗HLA-DR抗體，以流式細胞儀(FACS)研究經HB-19處理或未處理的異種移植 小鼠血液中的MDA-MB231細胞。HLA-DR+被環繞，標明了 HLA-DR+細胞在血細 胞中的百分率。A.沒有MDA-MB231異種移植的小鼠的血液，未處理，HLA-DR+ 細胞在外周血細胞中的百分率0.36%。 B.沒有MDA-MB231異種移植的小鼠的 血液，未處理，HLA-DR+細胞在外周血細胞中的百分率22.2%。 C.具有 MDA-MB231異種移植的小鼠的血液，以HB19經皮下途徑處理，HLA-DR+細胞 在外周血細胞中的百分率0.1%。 D.具有MDA-MB231異種移植的小鼠的血液， 以HB19經皮下途徑處理，HLA-DR+細胞在外周血細胞中的百分率0.31%。
圖12. HB-19和Nucant 01在經HARP刺激的NIH-3T3細胞生長中的效應。在 所示濃度的HB19或Nucant 01存在的情況下，不刺激或以4 nM HARP刺激靜止 的NIH-3T3細胞。溫育24小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞增殖。結 果(3個點的平均值)以相對於對照的細胞增殖百分率給出，所述對照在無HB19和 Nucant 01存在下經HARP刺激(100%細胞增殖)。
圖13. HB19、 Nucant 2和Nucant 3在經HARP刺激的NIH-3T3細胞生長中的 效應。在所示濃度(O.l ， 0.25和0.5^M)的HB19、 Nucant 2或Nucant 3存在的情況 下，不刺激或以4 nM HARP刺激靜止的NIH-3T3細胞。溫育24小時後，通過測 定氚化胸苷的引入來確定細胞增殖。結果(3個點的平均值)以相對於經HARP刺激 的對照的百分率(100%細胞增殖)給出。同時給出了 IC50濃度(相對於經HARP刺 激的對照，導致細胞增殖抑制50%的濃度)。
圖14. NUCANT 3， 6和7在經5% FCS刺激的NIH-3T3細胞增殖中的效應。 在濃度範圍為0.125至2 的NUCANT 3， 6和7存在或不存在的情況下，以5% FCS刺激MH-3T3細胞。所述NIH-3T3細胞經血清剝奪而成為靜止的。溫育24 小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞增殖。結果以相對於經5%FCS刺激 的對照細胞的百分率給出。IDso以點線表示。
23圖15. Nucant 6和Nucant 7比HB19表現出更好的抗表面核仁素活性。ID50: 抑制表面核仁素50%的濃度，以pM表示；ID95:抑制表面核仁素95%的濃度，以 )iM表示。
圖16.HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和Nucant 7對MDA-MB231細胞表達核仁 素的抑制效應。MDA-MB231細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中在75cm2培養。 培養2天後，以10 的HB-19(線1)、Nucant 3(線2)、Nucant 6(線3)或Nucant 7(線 4)處理分匯合(subconfluent;)細胞(每瓶約3 x 106個細胞)24或48個小時。線C代表 未經處理的細胞。處理24或48小時後，以PBS洗滌細胞，以10 ml含有1%胎牛 血清和生物素化的HB-19(5 pM)的DMEM在室溫下溫育45分鐘。以含有1 mM EDTA的PBS(PBS-EDTA)徹底洗滌後，用含有20 mM Tris HC1， pH 7.6， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl2， 0.2 mM苯甲基磺醯氟化物，5 mM (3-巰基乙醇，抑肽酶(1000 U/nil)和0.5% TritonX-100的裂解緩衝液製備胞質提取物。使用PBS-EDTA中的親 禾口素-瓊月旨茅唐(lOO)al; ImmunoPure Immobilized Avidin, Pierce Chemical Company, USA)從純化提取物分離表面核仁素和生物素化的HB-19之間形成的複合體。在 4"溫育2小時後，親和素-瓊脂糖樣品以PBS-EDTA徹底洗滌。這些含有純化的 表面核仁素的樣品(A;対'應於2 x 106個細胞的材料)和細胞粗提物(3和C;對應於 4x 105個細胞的材料)在含有SDS的電泳緩衝液中變性，通過SDS-PAGE分析。表 面核仁素的存在使用D3單克隆抗體(A和B)以免疫雜交顯示。C中顯示了考馬斯 藍染色後的電泳分析。線M對應於分子重量標記物。
圖17.體外CAM模型中血管生成的抑制。含有或不含有(對照)HB-19(10 pM; 0.6嗎)或Nucant 7(10 iaM; 0.8嗎)的20 |il水沉澱至CAM表面。溫育48小時後進 行血管的觀測。
圖18. HB-19對經各種LPS製備物刺激的人初級外周單核細胞(PBMC)產生 TNF-a的抑制。使用人全血EDTA-鉀通過Ficoll密度梯度離心分離PBMC並重懸 於含有1%人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(O)或存在(l和5 ^M)的情況下，以100ng/ml的來自大腸桿菌(&t'/;er/c/2/a co/Z)型0111: B4和055: B5的LPS以及來自腸道沙門氏菌(5b/附o恥〃a e"fen'ca)血清型Re 595的LPS刺激濃 度為1(^個細胞/0.5ml的細胞。同樣的PBMC以20 ng/ml: 1 pM的PMA:伊屋諾 黴素(Ionomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯伊屋諾黴素)刺激。在37。C下5% C02的溫育箱中溫育PBMC培養物。溫育20小時後收集培養物上清，以ELISA 測定TNF-a的水平。
圖19. HB-19對經各種LPS製備物刺激的鼠腹膜初級巨噬細胞產生TNF-a和 IL-6的抑制。在4iiMHB-19不存在(-)或存在(+)的情況下，不刺激(B4 0)或以濃度 為100 ng/ml(B4 IOO)和1000 ng/ml(B4 IOOO)的來自大腸桿菌(Eyc/2en'c/^ co")型 0111: B4的LPS刺激鼠腹膜巨噬細胞。在37"下5%(302的溫育箱中溫育細胞培 養物20小時。以ELISA測定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。圖20. Nucant 7對經各種LPS刺激的鼠腹膜初級巨噬細胞產生TNF-a和IL-6 的抑制。在10pMNucant7不存在(-)或存在(+)的情況下，不刺激(-)或以濃度為10 ng/ml， 100 ng/ml和1000 ng/ml的來自大腸桿菌(&cfen'c/u'a co/f)型0111: B4的LPS 刺激(+)鼠腹膜巨噬細胞。在37'C下5% C02的溫育箱中溫育細胞培養物20小時。 以ELISA測定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。
圖21. HB-19對經LPS刺激的人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)產生IL-8和表達 ICAM-l的抑制。HUVEC細胞以10000個細胞/cn^在96孔板中以含有2%胎牛血 清的EBM-2培養液進行培養。在5 |iM HB-19不存在或存在的情況下，以100 ng/ml 的大腸桿菌(&c/ en'c/z/a co/Z)血清型055: B5刺激細胞。在37。C下5% C02的溫育 箱中溫育細胞培養物20小時。以ELISA測定IL-8和ICAM-1蛋白水平。在5 HB-19存在或不存在的情況下，HUVEC細胞用作對照，作為基礎水平。
圖22. HB-19對經熱滅活的金黃色釀膿葡萄球菌(Stop/zj^cocc^ m^^)(HKSA，熱殺死的金黃色釀膿葡萄球菌)刺激的人初級外周單核細胞(PBMC) 產生TNF-ot和IL-6的抑制。使用人全血EDTA-鉀通過Ficoll密度梯度離心分離 PBMC並重懸於含有1%人血清AB(Invi加gen)的RPMI 1640。在HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6或Nucant 7(10 iiM)或地塞米松(Dexamethasone)(Dex. 1 |ig/ml)不存在(對 照)或存在的情況下，以108個HKSA/ml的顆粒(InvivoGen, San Diego, USA)刺激濃 度為106個細胞/0.5ml的細胞。在37。C下5% C02的溫育箱中溫育PBMC培養物。 溫育20小時後收集培養物上清，以ELISA測定TNF-a(A)和IL-6(B)的水平。
實施例
1.1五價化合物HB19對體外腫瘤生長的效應
l丄l表面核仁素在錨定依賴性細胞增殖中的作用和HB-19對這種增殖的抑 制效應
在一系列實驗中研究了核仁素在HARP分子的生物活性中的作用在特異性 識別核仁素的單克隆抗體存在或不存在的情況下評估HARP的有絲分裂活性，所 述有絲分裂活性通過測定NIH 3T3細胞的氖化胸苷的引入而進行測試。結果表明， 這個抗體通過劑量依賴性方式在NIH 3T3細胞中抑制HARP的有絲分裂活性(圖 3A)。
加入50 nM的抗-核仁素抗體完全抑制了來自4 nM HARP的有絲分裂活性， 而針對相同同位型的核仁素的非特異性抗體對HARP誘導的增殖沒有效應。無論 所用的免疫球蛋白濃度如何，總是這樣，因此證明了所觀測到的抑制的特異性(圖 3B)。
肽F3和化合物HB19是核仁素的兩個配體。肽F3結合至核仁素的N-末端部 分(包含酸性胺基酸區域(9))，相反，化合物19結合至位於核仁素的C-末端部分的RGG結構域(見圖1)。也表明了化合物HB19特異性結合至細胞表面不受肽F3存 在的影響(本發明人以FACS進行的實驗)。
' 本發明人研究了肽F3和五價化合物HB19是否能夠抑制生長因子HARP引發 的NIH-3T3細胞的細胞增殖。因此在相同系列實驗中，測定了化合物HB19和肽 F3的效應(特異性結合至表面核仁素)。
肽F3的結果在圖3C中給出，毫不含糊地表明像IgG抗體一樣，肽F3不引 起對HARP引發的NIH 3T3增殖的抑制。
HB19的結果在圖3D中給出，表明HB-19引起對HARP引發的NIH3T3增 殖的劑量依賴性抑制。加入0.5 的HB-19引起對4 nM的HARP引發的效應的 81 %的抑制。這清楚地表明 一個能夠內化而帶來增殖抑制的核仁素配體是不夠的；
暗示了為了有效，'核仁素配體必須是多價的並可結合至一個或多個核仁素分子
的C-末端結構域的一個或多個RGG單元。
此外，有趣的是，注意到當細胞以各種濃度的HB-19預處理1小時、洗滌然 後以HARP剌激時，可觀測到水平相當的抑制(圖4)。這個結果表明HB-19結合至 NIH 3T3上存在的表面核仁素，因此在一個小時後抑制由HARP引發的細胞增殖。
為了研究HB-19對抑制細胞增殖的效應是不是對給定的生長因子例如HARP 是特異性的，進行了兩個系列實驗，其在於研究HB-19對NIH 3T3細胞的效應， 所述NIH 3T3細胞由以下刺激
-FGF-2,另一個生長因子，或
-含有各種生長因子的混合物的5%胎牛血清。
這些實驗的結果表示在圖5中，其表明HB-19在濃度為0.5 pM時能夠抑制 FGF-2(A)或胎牛血清(B)引發的細胞增殖。
因此，結果表明，總的來說，HB-19能夠體外抑制腫瘤細胞的增殖。不管所 用來引發細胞增殖的試劑是什麼，情況都是這樣。
l丄2核仁素在錨定依賴性細胞增殖中的作用和HB-19對這種增殖的抑制效 應
與細胞增殖的研究相平行，使用人類乳腺癌細胞系MDA-MB231和鼠黑素瘤 細胞系B16-BL6在溼瓊脂上以一個生長模型測定了核仁素在錨定非依賴性細胞生 長中的作用，和轉化細胞的表型特徵。
在這些實驗中，在各種濃度的對照抗-核仁素抗體、對照免疫球蛋白或化合物 HB-19存在或不存在的情況下，在瓊脂凝膠上培養細胞。在37。C下溫育IO天后， 對每個培養板上存在的克隆數目計數。如圖6所示，以O.l ^M抗-核仁素(A)處理 的培養物的克隆數目下降60%，而以相同的同位型免疫球蛋白處理的培養物中未 發現有效應(B)。
更特別的，相對於對照，也發現了以HB-19處理的培養物中克隆數目的抑制， 其為劑量依賴性方式。在以1 nM HB-19處理的培養物中觀測到克隆數目減少59%(圖6C)。
使用鼠黑素瘤例如B16-BL6作為靶細胞得到了類似的結果。結果顯示於圖7。 對結果的分析表明抗-核仁素抗體(A)和HB-19分子(B)都以劑量依賴性方式抑制 溼瓊脂上B16-BL6的生長。在l ^M的HB-19存在下，觀測到超過50%的克隆數 目的抑制。
這套結果證明化合物HB-19對錨定非依賴性細胞生長具有抑制效應。這對
兩個細胞模型，人乳腺癌和鼠黑素瘤都是正確的。
1.2五價化合物HB19對血管生成因子引發的血管生成的效應 鑑於表面核仁素存在於激活的內皮細胞表面(9)，測定了 HB-19對內皮細胞分
化的效應。
首先，在內皮細胞的體外增殖中測試了這種效應(HUVEC:人臍帶血管內皮細 胞)。培養每孔20000個HUVEC細胞並在每天加入不同濃度的化合物HB19。處理 6天後對細胞計數。結果在圖8A中給出，其表明與Huang等人的文章(16)中所 用的抗-核仁素多克隆抗體製備物相反，HB19引起內皮細胞增殖的抑制。
也測定了 HB19(1 ^M)的存在對HUVEC細胞分化的效應，所述HUVEC細胞 在HARP血管新生因子(angiogens)(l nM)、 VEGF(l nM)和FGF-2(3 nM)存在下在三 維膠原凝膠培養。4天後，對管網結構計數。結果以任意單位表示於圖8B，其表 明，HB19也抑制血管生成因子存在下在三維膠原凝膠培養的HUVEC細胞的分 化。
最後，在體內血管生成模型中測定了 HB-19對內皮細胞分化的效應。這個測 試模擬弓1起血管形成的過程的第 一個時期。
這個血管生成實驗模型在於，以含有待分析其血管生成刺激或抑制特性物質 的matrigel經皮下注射小鼠。1周後除去matrigel，進行組織切片，在免疫組化後 以圖像分析對內皮細胞(CD31+，因子VIII+)的數目進行定量。如圖8中所示，HB-19 自身對matrigel中內皮細胞的補充無效應。另一方面，它抑制HARP或FGF-2引 發的血管生成。
對結果的分析表明HB-19能夠抑制促血管生成因子例如FGF-2或HARP引 發的血管生成。這顯示了 HB-19(特異性靶向血管生成中相關的內皮細胞)的一般的
血管生成效應。
因此，化合物HB19徹底地抑制HARP、 VEGF和FGF-2引發的HUVEC細胞
的增殖和分化。因此它具有比黃等人的文章(16)所用的抗-核仁素單克隆抗體更加 顯著的效應。
使用內皮細胞作為抗癌靶細胞具有幾個優點。與腫瘤細胞所呈現的遺傳不穩 定相反，內皮細胞在遺傳上是極其穩定的，因此限制了抗性機制。而且，由於分 子靶標是表面核仁素，HB-19主要靶向激活的內皮細胞從而靶向那些己進入新血 管生成期的。應該注意，腫瘤內皮細胞比正常內皮細胞分裂快70倍，這就是為何
27腫瘤內皮細胞是主要的靶點，從而限制了潛在的副作用。 1.3五價化合物HB19的體內抗腫瘤效應
在無胸腺小鼠的腫瘤生長模型中測試了五價化合物HB-19在體內對腫瘤生長 的效應。在本實驗中，靶細胞起源自人乳腺癌MDA-MB231。
以2 x 106個細胞在腰窩處注射每組4隻無胸腺(裸/裸)小鼠。當腫瘤體體積達 到至少200 mm3時，每兩天以100 pl的PBS溶液(對照組)或HB-19溶液(5 mg/kg) 或一種廣泛使用的臨床試劑它莫西芬(tamoxifen，也稱為紫杉醇，10 mg/kg)注射腫 瘤(癌周的或皮下途徑)來處理小鼠，或者不處理小鼠。在第7、 14、 21、 28、 34 和40天以卡鉗測量腫瘤體積。
結果在圖8中顯示，其表明相對於未處理的對照小鼠(具有7倍大的腫瘤體 積)，以5 mg/kg的劑量使用肽HB-19引起腫瘤生長的抑制。
此外，儘管經它莫西芬處理的小鼠其腫瘤體積從處理丌始沒有顯著性變化， 但是以HB-19處理的小鼠的腫瘤在處理21天後已檢測不到(圖9A)。雖然它莫西芬 在10 mg/kg只是引起腫瘤體積的穩定或部分退化，五價化合物HB-19在5 mg/kg 實際上引起明顯的總腫瘤退化。
為了對照這些結果，在處理40天後殺死小鼠，除去腫瘤並稱重。未處理的小 鼠的平均腫瘤重量為0.22 g(分布於0.083-0.34 g)，經10 mg/kg它莫西芬處理的為 0.06 g(分布於0.006-0.22 g)，以HB-19處理的小鼠中未發現腫瘤(圖9B和C)，因 此確定了經體外測量大小來估計的腫瘤體積。
在另一個實驗中，經腹腔內(IP)途徑和癌周(SC)途徑使用HB19(5 mg/kg)(圖 10)。結果表明，通過腹腔內(IP)途徑和癌周(SC)途徑，HB-19的抗癌作用是同樣有 效的，不僅證明了五價化合物HB-19的未預料到的功效，而且證明了其在體內腫 瘤位置的生物可利用率，包括全身使用的情況。
也應該注意，在HB-19處理的過程中，在經處理的小鼠中沒有觀測到不JH常 的生理或行為跡象。而且，在實驗末尾對器官的解剖學檢驗沒有揭示任何的組織 毒性的可見跡象，或者任何的血管和血小板計數上的變化。
此外，在經HB-19處理的異種移植小鼠的外周血細胞中，不可能檢測HLA-DR+ 人類細胞(從而檢測MDA-MB231腫瘤細胞)(圖11)。事實上，與未處理小鼠(PBS)(其 中MDA-MB231細胞(HLA-DR+)的比例代表外周血細胞的22.2%)相反，在經皮下 或腹腔內以HB-19處理的小鼠的情況下，這個比例只有0.1%至0.31%。這些結果 暗示，HB-19也能夠在血液中防止腫瘤細胞循環，從而防止轉移現象。
1.4繼
實施例2中呈現的結果表明，因為其在腫瘤生長和血管生成上的雙效應，五 價化合物HB-19是細胞增殖有利的抑制劑。這些觀測在體內模型(其表明，在無胸 腺小鼠的PC3細胞異種移植模型中，癌周注射HB-19的處理能夠誘導腫瘤的抑制 甚至是退化)中經過了確認，並且沒有組織毒性。' 與在癌症治療中常規使用的處理例如紫杉醇相比，實驗模型中所用的HB-19 似乎更有效。與它莫西芬相比HB-19這種更強的功效可能來源於HB-19對腫瘤生 長和腫瘤增殖所需的血管形成都具有抑制效應。不管是腫瘤細胞還是激活的內皮 細胞的情況，HB-19靶向並阻斷這兩種類型細胞的增殖。
存在很多具有抑制腫瘤細胞增殖特性的細胞。這些分子通常具有效應，而沒 有細胞靶點。實際上，對於很多化療試劑，腫瘤細胞中存在的分子靶點也在正常 細胞中發現，這就解釋了這種治療的很多副作用。經靶向的生物試劑具有較少的 副作用，因為它們阻斷的目標不存在於正常細胞中或只是很少地存在於正常細胞 中。激活細胞表面存在的核仁素響應這種特性，因此成為癌症治療中理想的治療 靶點。應著重注意，我們不僅靶向癌細胞而且靶向激活的內皮細胞。而且，表面 核仁素似乎不限於一種特定類型的癌症。
雙靶向(腫瘤細胞本身和激活的內皮細胞)的功效應該與Genentech所進行的一 項研究(其表明，在一個隨機試驗中，抗增殖試劑(5-氟尿嘧啶)與抗血管生成試劑(阿 瓦斯丁(Avastin))結合對人結腸直腸癌的情況有很高的功效)的結果相比較。在III 期臨床試驗中，在以前未經處理的轉移的結腸直腸癌個體中，阿瓦斯丁處理作為 化療(依列替康(irinotecan)/5-氟尿嘧啶/亞葉酸(leucovorin))的補充，將生存率顯著延 長了平均5個月(20.3個月，與15.6個月相比)。在這些病人中發現，與只接受化療 的病人相比，腫瘤不生長的時間長度，從6.2個月增長到10.6個月(29)。
這種對腫瘤細胞和內皮細胞的雙效應使HB-19成為癌症治療中可選擇的一種 分子。
實盧辨2.三份眾合激7V"cfl/" 0/遊拔#/#活絲 2.1三價化合物Nucant 01的合成
三價化合物Nucant 01的化學結構在圖2B中給出。這個化合物具有環形六肽 作為載體，所述環形六肽由交替的D構型的丙氨酸殘基(A)和L構型的賴氨酸殘基 (K)組成。3個KVPR單元(v^CH2-NH)共價連接至3個賴氨酸殘基(K)中的每個的s
氨基基團。
化合物Nucant 01的合成包括將KVPR單元共價連接至三元對稱碳環核心分 子。核心分子的合成如S. Foumd等人(30)所描述。在氯三苯甲基型樹脂上使用根 據Fmoc化學的標準固相合成技術組裝經保護的Ki)/PR單元，然後在弱酸性條件下 從樹脂上切割下來。然後，以1.1 KVPRyi個環形分子的化學計量學標準將經保護 的Kv)/PR單元連接至核心分子的每個賴氨酸殘基(K)的s NH2基團。根據BOP/HoBt 激活程序進行連接，持續48小時。在反應末尾，在三氟乙酸中切割保護Ki]/PR單 元的基團，在醚中沉澱最終的化合物。通過HPLC純化程序末尾所獲得的Nucaiit 01 分子，並以質譜進行完全的描述。
2.2 Nucant 01在體外對腫瘤細胞增殖的抑制活性
將Nucant 01對經HARP刺激的NIH-3T3細胞增殖的效應與五價化合物HB-19進行了比較。在所示濃度(O.l， 0.2， 0.4， 1， 2和4^M)的HB19或Nucant01存在 的情況下，不刺激或以4 nM HARP刺激靜止的NIH-3T3細胞。溫育24小時後， 通過測定氚化胸苷的引入來確定NIH-3T3細胞的增殖，如前所述。
與HB19和Nucant 01不存在的情況下經HARP刺激的對照(100%細胞增殖) 相比較發現，化合物Nucant Ol(對於KPR單元只是三價的)在2 的濃度下也引 起對經HARP刺激的NIH-3T3細胞增殖的50%的抑制。因此這個結果證明，具有 至少3個接枝到環肽上的通式(I)的假肽單元的合成多價化合物可能和五價化合物 HB-19(其載體是直鏈肽)以同樣的方式來抑制由HARP引發的腫瘤細胞的增殖。
所需要的濃度比達到同樣水平的抑制所需的HB-19的濃度(0.2 高10倍， 但是化合物Nucant 01隻具有3個通式(I)的假肽單元而化合物HB-19具有5個。
因此，增加接枝到環肽上的通式(I)的假肽單元的數目(如Nucant 01中所用)至 4或5可能進一步增加該化合物的功效，可能至100倍。
2.3結論
這些結果清晰地表明了通式(I)的假肽單元的多價態形式對本發明中所用化合 物的活性的重要性，可使用眾多的載體，可使用直鏈肽或環肽而不影響該化合物 的功效。
因此可同樣使用其它可接受的載體，只要它們允許至少3個，優選3至8個， 優選4至6個，優選5或6個通式(I)的假肽單元接枝到它們上面。 ^^"萍丄五份眾會激7V"cfl/" 2 ,TV"oh" J遊拔/^^舒絲 3.1五價化合物Nucant 2和Nucant 3的合成
通過固相合成來組裝兩個已知的採用螺旋面結構的肽載體(其上錨定了 KVPR 單元)。這些載體由重複的序列單元組成，連接起來5次對於NUCANT 2為 Aib-Lys-Aib-Gly，對於NUCANT 3為Lys-Aib-Gly。以Boc化學的方式進行組裝。 然後通過DMF中的哌啶處理(3次，5分鐘)切割來除去側鏈上的賴氨酸殘基的保護 性Fmoc基團。賴氨酸的5個s NH2基團作為KyPR單元(i^CH2-N)的支撐點。以 氫氟酸進行最後的切割。經過在醚中沉澱肽、在水性條件下分解和冷凍-乾燥之後， 通過HPLC純化NUCANT 2和NUCANT 3類似物並以質譜分析，然後凍幹。
3.2 Nucant 2和Nucant 3在體外對腫瘤細胞增殖的抑制活性
將Nucant 2和Nucant 3對HARP引發的NIH-3T3細胞增殖的效應與五價化合 物HB-19進行了比較。在所示濃度(0.1 ， 0.25和0.5 [aM)的HB19、Nucant 2或Nucant 3存在的情況下，不刺激或以4 nM HARP刺激靜止的NIH-3T3細胞。溫育24小 時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定NIH-3T3細胞的增殖，如前所述。
在本實驗中，HB19抑制的IC50為0.1 pM。 Nucant 2和Nucant 3以劑量依賴 性方式抑制細胞增殖，其IC50為1.5 nM。
因此五價化合物Nucant 2和Nucant 3能夠以劑量依賴性方式抑制細胞增殖， 其IC50(引起細胞增殖抑制50%的濃度)與化合物HB19非常類似。也將Nucant 3對5% FCS處理的NIH-3T3細胞增殖的效應與五價化合物HB-19 進行了比較。在不同濃度(介於0.125至2pM)的NUCANT3， 6或7存在或不存在 的情況下，以5。/。FCS刺激靜止的NIH-3T3細胞(通過血清剝奪來使其靜止)。溫育 24小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞的增殖，如前所述。
結果表示於圖14中，以相對於經5。/。FCS剌激的對照細胞的百分率表示。結 果表明NUCANT 3對細胞增殖具有抑制效應。對圖表的分析表明NUCANT 3具有 和HB-19分子相似但比其稍低的IDso值(抑制50%的劑量)，因此其效應比HB-19 稍低。沒有觀察到NUCANT 3對未經刺激的細胞的效應，表明這些分子無任何毒 性。
3.3結論
這些結果亦表明通式(I)的假肽單元的多價態形式對本發明中所用化合物活性 的重要性，所用載體完全可以是含有或不含有結構元件((3摺疊，卩片層)的直鏈肽， 具有螺旋面結構的直鏈肽甚至是環形化合物，而不影響該結構的功效。
因此可互換地使用各種可接受的載體，只要它們允許至少3個，優選3至8 個，優選4至6個，優選5或6個通式(I)的假肽單元接枝到它們上面。
,^"錄4 7V份眾合激7V"o/W 6 ,7V"omZ 7遊拔,^T活絲
4.1六價化合物Nucant 6和Nucant 7的合成
使用和五價化合物Nucant 2和Nucant 3相同的合成過程獲得這些六價化合物。 4.2 Nucaiit 6和Nucant 7在體外對腫瘤細胞增殖的抑制活性 將Nucant 6和Nucant 7對5% FCS處理的NIH-3T3細胞增殖的效應與五價化 合物HB-19進行了比較。在不同濃度(介於0.125至2 pM)的NUCANT 3， 6或7 存在的情況下，以5% FCS刺激靜止的NIH-3T3細胞(通過血清剝奪來使其靜止)。 溫育24小時後，通過測定氚化胸苷的引入來確定細胞的增殖，如前所述。
結果表示於圖14中，以相對於經5。/。FCS刺激的對照細胞的百分率表示。結 果表明NUCANT 6和7對細胞增殖具有抑制效應。NUCANT 6和7具有和HB-19 分子相似但比其稍低的ID5o值(抑制50%的劑量)，因此其效應比HB-19稍低。沒 有觀察到NUCANT 6或7對未經刺激的細胞的效應，表明這些分子無任何毒性。 4.3結論
這些結果進一歩證明通式(I)的假肽單元的多價態形式對本發明中所用化合物 的活性的重要性，所用載體完全可以是含有或不含有結構元件(P摺疊，P片層)的 直鏈肽，具有螺旋面結構的直鏈肽甚至是環形化合物，而不影響該結構的功效。
特別地，具有6個假肽單元的形式似乎在獲得所需要的抗增殖和抗血管生成 方面更加有效。
TV"函,6顛"謹f 7更微表, 鄉鄉 5.1 Nucant 6和Nucant 7是比HB-19更強的抑制劑並且抑制表面核仁素的活 性使用我們以前描述的技術(13)在HelaP4細胞中測定了表面核仁素的活性。 結果表示於圖15中，其表明Nucant 3對表面核仁素活性的抑制與HB-19相 當。另一方面，Nucant 6和Nucant 7具有比HB-19更大的抗表面核仁素活性。HB-19 和Nucant 3的IDso值(抑制50%的劑量)為介於0.1-0.2 ^M，而Nucant 6和Nucant 7 的IDso值低於0.1 pM。此外，Nucant 6和Nucant 7在0.8|iM下引起對表面核仁素 活性超過95%的抑制。
5.2 HB-19, Nucant 3， 6和7引起人乳癌細胞MDA-MB231中表面核仁素的
抑制
表面核仁素在增殖和腫瘤血管生成中扮演重要角色。HB-19以及相關的分子 Nucant 3， Nucant 6和Nucant 7特異性結合至表面核仁素，因此阻斷腫瘤生長和血 管生成。在這些假肽結合至表面核仁素之後，複合體[假肽-核仁素]通過主動過程 被迅速內在化。這些結果顯示於圖16A中，其表明，與未經處理的細胞相比，以 HB-19(線1)、 Nucant 3(線2)、 Nucant 6(線3)或Nucant 7(線4)處理細胞導致表面核 仁素存在的減少。在處理24小時後而且在處理48小時後觀察到這個減少，在處 理48小時後核仁素已檢測不到。
有趣的是，和以HB-19及Nucant 3(線1和2)處理的細胞相比，以假肽Nucant 6及Nucant 7(線3和4)處理24小時的細胞中表面核仁素的減少要大得多。在處理 48小時後有同樣的觀測結果。應該著重注意，表面核仁素的減少不是表面核仁素 細胞內數量減少的結果。事實上，在未經處理和經HB-19或各種類型的Nucant處 理的細胞的提取物中發現了同樣數量的核仁素(圖16B)。類似地，發現從未經處 理和經HB-19或各種類型的Nucant處理的細胞中提取的蛋白，其電泳圖譜沒有差 異。這個結果表明蛋白合成不受HB-19或不同類型Nucant研究的影響。此外， 有趣的是，HB-19和所研究的各種類型的Nucant沒有細胞毒性效應(其可能解釋所 觀測到的表面核仁素的減少)。
5.3結論
這一套結果表明
a) 核仁素在腫瘤細胞表面大量表達，例如在人乳癌細胞(MDA-MB231)中。
b) 以HB-19 、 Nucant 3 、 Nucant 6和Nucant 7處理引發細胞表面存在的核仁素 "庫"顯著的減少。
c) 假肽Nucant 6和Nucant 7對於產生細胞表面存在的核仁素"庫"的減少以 及抑制表面核仁素活性方面更加有效。
//7iV顏"7,i散成遊資座
方法
在體外血管生成模型(雞胚絨毛尿囊膜，CAM)中測試了 HB-19和Nucant 7對
血管生成的效應。
將含有或不含有(對照)HB-19(10 0.6嗎)或Nucant 7(10 ^M; 0.8 pg)的20 )il
32水沉澱至CAM表面。溫育48小時後進行血管的觀測。 結果
結果顯示於圖17中，其表明溫育48小時後HB-19和Nucant 7清晰地引起 血管生成的抑制。圖像分析研究(不僅考慮毛細血管長度，而且考慮分支的數目) 顯示了在區域中相對於對照來說50%的抑制。
,嚴萍7.船激朋"顛腦"/ 7艦炎i^舒絲
7.1 HB-19對經LPS刺激的人初級PBMC產生TNF-a的抑制 方法
使用人全血EDTA-鉀通過Ficoll密度梯度離心分離PBMC並重懸於含有1% 人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(O)或存在(l和5 nM)的情況 下，以100ng/ml的來自大腸桿菌(&c/2en'c/7/aco/Z)型0111: B4和055: B5的LPS 以及來自腸道沙門氏菌(Sa/,"o脫〃a e^en'ca)血清型Re 595的LPS刺激濃度為106 個細胞/0.5ml的細胞。同樣的PBMC以20 ng/ml: 1 的PMA:伊屋諾黴素 (1onomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酉旨伊屋諾黴素)刺激。在37。C下5% C02 的溫育箱中溫育PBMC培養物。溫育20小時後收集培養物上清，以ELISA測定 TNF-a的水平。
結果
結果(見圖18)表明，新鮮分離的PBMC產生TNF-a，這種TNF-a的組成型產 生不受HB-19的影響。另一方面，HB-19以劑量依賴性方式抑制PBMC針對各種 來自大腸桿菌或腸道沙門氏菌LPS製備物刺激而產生TNF-a。這種效應是特異性 的，因為HB-19對於PBMC針對PMA-伊屋諾黴素刺激而產生TNF-a沒有效應。
在5 pM的HB-19存在下，人PBMC針對各種LPS製備物刺激而產生TNF-a 被抑制達到與未經LPS刺激而觀察到的基本水平類似的程度。
7.2 HB-19和Nucant 7對經LPS刺激的鼠腹膜初級巨噬細胞產生TNF-a和 IL-6的抑制
方法
為了獲得經刺激的巨噬細胞，在實驗前4天，以1.5ml巰基乙酸鹽溶液(3。/。鹽 溶液)通過腹腔內注射balb/c小鼠(7-8周齡)。以5 ml含有1%胎牛血清的RPMI培 養液洗滌腹膜腔來收集巨噬細胞，然後將細胞以RPMI 1640培養液中106個細胞 /0.5 ml的濃度置於培養板，在37"下5% C02的溫育箱中溫育，2小時後除去非吸 附的細胞。
在4 HB-19或10 |iM Nucant 7不存在(-)或存在(+)的情況下，不刺激或以 濃度為10 ng/ml， 100 ng/ml和1000 ng/ml的來自大腸桿菌(&c/zm'c/^ co/Z)血清型 0111: B4的LPS刺激巨噬細胞。在37。C下5% C02的溫育箱中溫育細胞培養物 20小時。以ELISA測定TNF-a和IL-6蛋白的水平。
結果對於HB-19所獲得的結果顯示於圖19。在4 的HB-19存在下，鼠腹膜巨 噬細胞針對LPS刺激而產生的TNF-a和IL-6被顯著性抑制。如果考慮到未經LPS 刺激所觀測到的基本水平，對TNF-a的淨抑制程度為72-75%,對IL-6為68-71%。
對於Nucant 7所獲得的結果顯示於圖20。在10 的Nucant 7存在下，鼠腹 膜巨噬細胞針對LPS刺激而產生的TNF-a和IL-6幾乎被完全抑制，因為在經 Nucant 7處理的培養物觀測到的針對LPS刺激所產生的細胞因子水平與沒有LPS 中所觀測到的相類似。
如果考慮到未經LPS刺激所觀測到的基本水平，10 的Nucant 7對經10， 100和1000 ng/ml LPS剌激的培養物的抑制程度超過95%。 LPS濃度為100倍大的 情況下抑制程度沒有變化，這一事實意味著Nucant 7的抑制機理主要是由於結合 至表面核仁素。實際上，如果Nucant 7抑制的機理是與LPS相互作用，則100 ng/ml LPS的情況會比10 ng/ml LPS的情況抑制效應低。
7.3 HB-19對經LPS刺激的HUVEC細胞產生IL-8和表達ICAM-1的抑制 方法
HUVEC細胞以10000個細胞/cn^在96孔板中以含有2%胎牛血清的EBM-2 培養液進行培養。在5 nM HB-19不存在或存在的情況下，以100 ng/ml的來自大 腸桿菌(五sc/2er/cfea co/Z)血清型055: B5的LPS刺激細胞。在37。C下5% C02的溫 育箱中溫育細胞培養物20小時。以ELISA測定IL-8和ICAM-1的水平。在5 HB-19不存在或存在的情況下HUVEC細胞用作對照作為基礎水平。
結果
如果考慮到未經LPS刺激所觀測到的基本水平，5 HB-19對IL-8和ICAM-1 產生的抑制程度為大約50%。因此這些結果證明了 HB-19和相關的Nucant類型的 化合物作為IL-8和ICAM-1產生抑制劑的潛在的功效(見圖21)。
7.4 HB19對經滅活的金黃色釀膿葡萄球菌(5fa/^t;fococc7^ a^g附)刺激的人 初級PBMC產生TNF-ct的抑制
金黃色釀膿葡萄球菌感染被證明是引起心內膜炎的主要因素之一(24， 25)。 因此本發明人測定了在10 的化合物HB-19、 Nucant 3、 Nucant6或Nucant 7不存在(對照)或存在的情況下，人初級PBMC培養物針對熱滅活的金黃色釀膿 葡萄球菌(HKSA，熱殺死的金黃色釀膿葡萄球菌)而產生的TNF-a和IL-6的水平。 作為陽性對照(Dex.)，也使用地塞米松(Dexamethasone，已知的具有抗炎和免疫抑 制活性的糖皮質激素)處理PBMC。 方法
使用人全血EDTA-鉀通過Ficoll密度梯度離心分離PBMC並重懸於含有1% 人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640培養液。在HB-19 ， Nucant 3 ， Nucant 6或Nucant 7(10 iiM)或地塞米松(Dexamethasone)(l嗎/ml)不存在(對照)或存在的情況下，以 18個HKSA/ml的顆粒(InvivoGen, San Diego, USA)刺激濃度為16個細胞/0.5ml
34的細胞。在37"下5% C02的溫育箱中溫育PBMC培養物。溫育20小時後收集培 養物上清，以ELISA測定TNF-a和IL-6蛋白的水平。 結果
結果顯示於圖22，其表明所有測試的假肽(HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和 Nucant 7)都可能獲得對經熱殺死的金黃色釀膿葡萄球菌刺激而產生TNF-ot和IL-6 的顯著性抑制。假肽與標準抗炎治療例如地塞米松同樣有效。
因此通式(I)的假肽例如HB-19、 Nucant 3、 Nucant 6和Nucant 7也可用於治療 心臟發炎，特別是用於治療由感染起源的心內膜炎。
7.5繼
因此本發明人獲得的結果表明，化合物HB-19和Nucant 7能夠抑制各種類型 的細胞針對LPS刺激而產生促炎性細胞因子例如TNF-a和IL-6，以及同時抑制各 種類型的細胞針對LPS刺激而產生趨化因子IL-8和黏附分子ICAM-1 。
此外，這些化合物也弓I起針對金黃色釀膿葡萄球菌(引起由感染起源的各種形 式的心內膜炎的一種試劑)剌激而產生促炎性細胞因子例如TNF-a和IL-6的顯著性 抑制。
因此，本發明所描述的這些化合物以及相關的通式(I)的化合物能夠抑制促炎 性細胞因子和發炎位置白細胞補充所涉及分子的產生。因此這些化合物可用於抗 炎症用途，特別是用於治療一般描述中提及的各種疾病。
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權利要求
1、一種多價合成化合物在製備用於治療涉及細胞增殖和/或血管生成下調的疾病的藥物中的用途，該化合物包含或者由一個載體組成，在所述載體上至少三個假肽單元被接枝，該化合物通式(I)為其中每個X獨立代表任何胺基酸；Y1和Y2獨立選自具有鹼性側鏈的胺基酸；Z選自-脯氨酸，可能在γ、β或δ被羥基、胺、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C5-C12芳基、C5-C14芳烷基、C5-C12雜芳基基團取代，這些基團本身可能被1至6個選自滷素原子、NO2、OH、C1-C4烷基、NH2、CN、三滷甲基、C1-C4烷氧基、C1-C4二烷基氨基、胍基基團、硫醇基團的取代基取代；-天然的或非天然的N-烷基胺基酸；-二烷基胺基酸；-環二烷基胺基酸；或-哌可酸或其衍生物；n和i獨立地為0或1；m是0至3的整數；k是大於或等於3的整數；和ψ代表經修飾的肽鍵，其相對於標準肽鍵來說，對至少一種蛋白酶具有更顯著抗性。
2、 根據權利要求1所述的用途，其特徵為所述載體選自直鏈肽或環肽、直鏈 擬肽或環形擬肽、摺疊體、直鏈多聚物或球形樹狀聚體、糖或納米顆粒。
3、 根據權利要求2所述的用途，其特徵為所述載體選自直鏈肽或環肽。
4、 根據權利要求3所述的用途，其特徵為所述載體選自由交替的D構型的丙 氨酸殘基(A)和L構型的賴氨酸殘基(K)組成的環形六肽，或者具有SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:19序列的直鏈肽。
5、 根據權利要求1-4任一項所述的用途，其特徵為所述假肽單元直接接枝到所述載體上。
6、 根據權利要求1-4任一項所述的用途，其特徵為所述假肽單元通過間隔物 的方式接枝到所述載體上。
7、 根據權利要求l-6任一項所述的用途，其特徵為k介於3和8之間。
8、 根據權利要求7所述的用途，其特徵為k介於5和6之間。
9、 根據權利要求l-8任一項所述的用途，其特徵為i等於l， Z是脯氨酸(P)。
10、 根據權利要求l-9任一項所述的用途，其特徵為Yi和Y2獨立地選自精氨 酸(R)和賴氨酸(K)。
11、 根據權利要求10所述的用途，其特徵為Y,是賴氨酸(K)， Y2是精氨酸(R)。
12、 根據權利要求l-ll任一項所述的用途，其特徵為n和m等於0。
13、 根據權利要求1-10任一項所述的用途，其特徵為V代表還原的鍵 (-CH2NH-)、逆反鍵(-NHCO-)、亞甲氧基鍵(-CH2-0-)、硫亞甲基(-CH2-S-)、碳 鍵(-CH2-CH2-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、羥乙烯基鍵(-CHOH-CH2-)、 (-N-N-) 鍵、E-烯烴鍵或(-CH《H-)鍵。
14、 根據權利要求1所述的用途，其特徵為該化合物選自具有如圖2A(SEQID NO: 5)、圖2B、圖2C(SEQIDNO: 20)、圖2D(SEQIDNO: 21)、圖2E(SEQ ID NO: 16)或圖2F(SEQIDNO: 17)所示的結構的化合物。
15、 根據權利要求1-14任一項所述的用途，其特徵為所述涉及細胞增殖和/ 或血管生成下調的疾病是癌症。
16、 同時抑制細胞增殖和血管生成的分子篩選方法，包括(C)將表達表面核仁素的細胞投置於測試分子；和(d)確定所述測試分子與核仁素的RGG結構域的結合能力。
17、 如權利要求1至14所定義的化合物，但不包括下述載體為非環肽的化合 物該非環肽包括選自KPG， KGP， KGC或KX!KX4KXA的胺基酸序列，其中， Xi是可選的，選自賴氨酸(K)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)、穀氨酸(E)或異亮氨酸(I)，X4是可選的，選自纈氨酸(V)、丙氨酸(A)、穀氨酸(E)或異亮氨酸(I)。
18、 根據權利要求17所述的化合物，其特徵為所述載體選自直鏈肽、環肽、 直鏈或環形擬肽、摺疊體、直鏈多聚物或球形樹狀聚體、糖或納米顆粒，所述直 鏈肽包含選自Aib-K-Aib-G(SEQ ID NO: 6)或K-Aib-G(SEQ ID NO: 7)的胺基酸序列。
19、 根據權利要求18所述的化合物，其特徵為所述載體為直鏈肽，所述直鏈 肽由選自SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19的胺基酸序列組成。
20、 根據權利要求19所述的化合物，其特徵為該化合物具有如圖2B、圖 2C(SEQIDNO: 20)、圖2D(SEQIDNO: 21)或圖2E(SEQ ID NO: 16)所示的結構。
21、 如權利要求1至14所定義的化合物，其結構如圖2F (SEQ ID NO:17)所述。
22、 作為藥物用途的如權利要求17至21任一項所述的化合物。
23、 包含權利要求17至21任一項所述的化合物的藥物組合物。
24、 權利要求1至14任一項所述的化合物在製備用於治療炎性疾病藥物中的用途。
25、 根據權利要求24所述的用途，其特徵為所述炎性疾病選自自身免疫病、 敗血病、感染性休克、心臟發炎疾病、移植排斥反應、外傷、關節的炎性疾病、 胃腸系統炎性疾病、皮膚的炎性疾病、呼吸系統的炎性疾病或過敏症。
26、 根據權利要求25所述的用途，其特徵為所述炎性疾病是自身免疫病。
27、 根據權利要求26所述的用途，其特徵為所述自身免疫病是狼瘡或類風溼 性多關節炎。
28、 根據權利要求25所述的用途，其特徵為所述炎性疾病是感染性休克。
29、 根據權利要求25所述的用途，其特徵為所述炎性疾病是心內膜炎。
全文摘要
本發明涉及一種多價合成化合物在製備用於治療涉及細胞增殖和/或血管生成下調的疾病，優選作為表面核仁素配體，或者治療炎性疾病的藥物中的用途，該化合物包含一個載體，在所述載體上至少三個假肽單元被接枝，該化合物符合通式(I)，其中每個X獨立代表任何胺基酸；Y1和Y2獨立選自具有鹼性側鏈的胺基酸；Z選自脯氨酸，可選地在≠、-或..被取代；天然的或非天然的N-烷基胺基酸；二烷基胺基酸；環二烷基胺基酸；哌可酸或其衍生物；n和i獨立地為0或1；m是0至3的整數；k是大於或等於3的整數；ψ代表經修飾的肽鍵，其相對於標準肽鍵來說，對至少一種蛋白酶具有更顯著抗性。
文檔編號C07K14/16GK101454341SQ200780019270
公開日2009年6月10日 申請日期2007年4月22日 優先權日2006年4月27日
發明者A·荷瓦耐森, G·吉夏爾, J·P·白裡安, J·庫爾蒂, Y·哈馬 申請人:國家科學研究中心