靜脈注射人免疫球蛋白的雙重病毒滅活/去除方法

2023-06-02 08:42:01

專利名稱：靜脈注射人免疫球蛋白的雙重病毒滅活/去除方法
技術領域：
本發明涉及人血漿蛋白的製備方法，特別是採用雙重病毒滅活/去除方法製備靜脈注射人免疫球蛋白的製備方法。
背景技術：
免疫球蛋白的生產已經有半個多世紀的歷史，60年代-80年代初，人們普遍認為經低溫乙醇分離製備的免疫球蛋白不傳播病毒性疾病。80年代初期隨著靜注免疫球蛋白(IVIG)的問世，臨床上對於原發性或繼發性免疫缺陷以及一些自身免疫性疾病的治療取得了顯著效果，IVIG被公認是一種安全有效的製品。然而隨著Lane[1]在1983年對輸注IVIG後發生非甲非B肝炎傳播的首次報導後，IVIG的病毒安全性引起了人們的關注。自Lane的報導後，涉及多個國家多個製造廠家的數批IVIG輸注後上千例的非甲非B肝炎傳播相繼報導[2-7]。上述現象發生的原因尚不完全清楚，但根據多方報導經IVIG傳播病毒性疾病可能與IVIG生產工藝中是否加入特定的病毒滅活/去除方法及其方法的選擇有著重要的關係，為此WHO和各國相關權威機構均要求在人免疫球蛋白的生產中必須加入適宜的病毒滅活/去除手段以保證該產品在病毒傳播方面的安全性。
血漿蛋白製品生產中常用的病毒滅活方法有加熱滅活(如白蛋白的巴氏消毒)和SD滅活方法，由於免疫球蛋白在生物學結構和功能上的特點，上述兩種病毒滅活方法易於導致其IgG的聚合和生物活性的損失，因此難以在免疫球蛋白規模化生產中採用，國外同行報導採用加入麥芽糖進行低pH孵放處理用於靜注免疫球蛋白病毒滅活取得了很好的效果[8]，低pH孵放處理對脂包膜病毒有較好的滅活作用，而對非脂包膜病毒(如A肝病毒和人類細小病毒B19)滅活效果較差。

發明內容
本發明的目的是採用低pH孵放滅活和納米過濾去除雙重方法來彌補單獨使用低pH孵放病毒滅活方法的不足。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於以低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(FII)經低pH孵放處理滅活病毒後，採用納米膜過濾進一步去除病毒。
所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟a、以低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(FII)為原料，用重量比為2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的鹽酸調整pH至3.5-4.5；b、經30-100KD的超濾膜濃縮、透析至殘餘乙醇含量≤0.03％，調整蛋白濃度至重量百分比為4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比為9-11％的麥芽糖作保護劑，除菌過濾後置20-25℃孵放21天；c、低pH孵放處理後的免疫球蛋白半成品先經納米膜過濾，再經0.2μm除菌過濾膜過濾，得免疫球蛋白成品。
所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於所述的納米膜範圍為15-35nm。
本發明的有益效果是將低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(FII)經低pH孵放處理後進行納米膜過濾，在有效去除病毒的同時不損失IgG的生物活性，使靜注免疫球蛋白在臨床的使用更加安全。
下面通過本發明的具體實施方式
對本發明進一步說明。
具體實施例方式
實施例1第一步低pH孵放處理取FII沉澱20千克，用0℃注射用水160升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾後，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘餘乙醇含量≤0.03％，加入9％麥芽糖，調整蛋白濃度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌過濾分裝至10升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格後在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用35nmBMM膜(日本旭化成)串聯0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最後分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物製品規程》中靜脈注射人免疫球蛋白製造和檢定規程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
實施例2
第一步低pH孵放處理取FII沉澱25千克，用0℃注射用水200升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾後，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘餘乙醇含量≤0.03％，加入10％麥芽糖，調整蛋白濃度至5.0％，pH至4.2，0.2μm膜除菌過濾分裝至11升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格後在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用25nmBMM膜(日本旭化成)串聯0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最後分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物製品規程》中靜脈注射人免疫球蛋白製造和檢定規程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
實施例3第一步低pH孵放處理取FII沉澱22千克，用0℃注射用水176升溶解，1mol/L鹽酸調整pH至4.0，用板框濾器過濾後，用注射用水、100kD超濾膜濃縮、透析至殘餘乙醇含量≤0.03％，加入10％麥芽糖，調整蛋白濃度至4.5％，pH至4.2，0.2μ膜除菌過濾分裝至10升玻璃瓶內，放置24℃孵放21天，得免疫球蛋白半成品。
第二步納米過濾經低pH孵放處理的免疫球蛋白半成品檢定合格後在20-30℃的溫度和壓力30-100Kpa條件下用15nmBMM膜(日本旭化成)串聯0.2μm除菌過濾膜進行過濾，最後分裝至小瓶(1.25g/瓶或2.5g/瓶)，按照《中國生物製品規程》中靜脈注射人免疫球蛋白製造和檢定規程要求進行全面質量檢測，結果見表3。
表1三批試製產品全檢結果(按照中國生物製品規程要求)檢測項目實施例1 實施例2 實施例3物理外觀合格 合格 合格熱穩定實驗 合格 合格 合格PH 4.25 4.20 4.24IgG含量g/L 47.2047.49 48.96純度％ 99.0599.55 99.65麥芽糖含量％97.3494.30 96.42分子大小分布％ 99.1299.20 99.27白喉抗體效價8.47 8.42 8.17
IU/mlB肝表面抗體效價139.63 161.31158.70IU/IgG.gHCV抗體 陰性 陰性 陰性HIV/1+2抗體 陰性 陰性 陰性PKA IU/ml ＜0.58 ＜0.58＜0.58ACA CH50％ 23.58 0 6.09抗A，抗B＜1∶32，＜1∶8＜1∶2，＜1∶8＜1∶4，＜1∶8免疫雙擴合格 合格 合格免疫電泳合格 合格 合格無菌實驗合格 合格 合格熱源質實驗 合格 合格 合格小鼠安全實驗合格 合格 合格豚鼠安全實驗合格 合格 合格本發明製成的免疫球蛋白成品可分裝至50ml裝量的符合《中國生物製品主要原輔材料質控標準》的玻璃瓶，每瓶1.25g或2.5g。
病毒滅活/去除效果觀察1.低pH孵放處理表2低pH孵放處理對病毒的滅活效果觀察滅活時VSV Sindbis V HIV/1間(天) (7.5-8.0logTCID50)(7.98logTCID50/ml)(5.0logTCID50/ml)對照組試驗組 對照組 試驗組對照組 試驗組0 6.13 4.006.505.00 4.3 4.31 5.88 3.006.282.14 ND ND3 4.94 ≤-0.50*6.131.96 3.8 1.85 4.32 ≤-0.50 6.121.82 ND ND7 4.33 ≤-0.50 5.951.59 2.5 ＜1*102.82 ≤-0.50 5.631.37 1.9 ＜1141.50 ≤-0.50 5.421.01 ＜1*＜121≤-0.50 ≤-0.50 5.190.00 ＜1 ＜1
*為檢測限量，ND未檢測採用HIV/1、SindbisV、VSV三種病毒為指示病毒，以pH7.0為試驗對照組，模擬低pH孵放處理過程，檢測殘留病毒以驗證該方法病毒滅活的效果，結果見表1(檢測結果由中國生物製品檢定所和中國人民解放軍軍事醫學科學院P3實驗室提供)2.納米膜過濾由日本紅十字會提供HCV陽性血漿，經35nm BMM(日本旭化成)膜過濾，採用PCR方法檢測過濾前後血漿中殘留病毒，觀察過濾過程對病毒的去除作用。結果見表2(該實驗結果由北京生物製品研究所，日本旭化成公司和成都蓉生藥業有限責任公司共同提供)表3BMM膜對HCV陽性血漿中HCV病毒的去除能力血漿樣品 樣品稀釋 殘留病 去除原倍 10-110-210-310-410-510-610-7毒 能力原液*+ + - - 105一次過濾 + - - - 100兩次過濾 - - - ＞1005原液#+ + - - 105一次過濾 + + - - 101兩次過濾 - - - ＞1004*採用北京生物製品研究所PCR試劑盒檢測結果，#採用日本紅十字會提供的PCR試劑盒檢測結果。
綜合上述實驗結果得出結論a、低pH孵放處理能有效滅活VSV、Sindbis和HIV/1病毒。
b、納米過濾技術能有效去除HCV陽性血漿中至少4log的HCV病毒。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
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1.一種人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於以低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(FII)經低pH孵放處理滅活病毒後，採用納米膜過濾進一步去除病毒。
2.根據權利要求1所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟a、以低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(FII)為原料，用重量比為2-10倍的0-5℃注射用水溶解，0.5-1.0mol/L的鹽酸調整pH至3.5-4.5；b、經30-100KD的超濾膜濃縮、透析至殘餘乙醇含量≤0.03％，調整蛋白濃度至重量百分比為4.5％-5.0％，pH至3.5-4.5，加入重量百分比為9-11％的麥芽糖作保護劑，除菌過濾後置20-25℃孵放21天；c、低pH孵放處理後的免疫球蛋白半成品先經納米膜過濾，再經0.2μm除菌過濾膜過濾，得免疫球蛋白成品。
3.根據權利要求1或2所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於所述的納米膜範圍為15-35nm。
4.根據權利要求3所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於所述的納米膜為35nm。
5.根據權利要求2所述的人血漿免疫球蛋白的製備方法，其特徵在於步驟c中的免疫球蛋白半成品過濾所需的溫度為15-30℃，壓力為30-100Kpa。
全文摘要
本發明涉及人血漿蛋白的製備方法，特別是採用雙重病毒滅活/去除方法製備靜脈注射人免疫球蛋白的製備方法。本發明的人血漿免疫球蛋白的製備方法，以低溫乙醇法分離得到的組分II沉澱(F
文檔編號C07K1/34GK1457884SQ0313517
公開日2003年11月26日 申請日期2003年6月10日 優先權日2003年6月10日
發明者王玉, 廖紅茹, 魯濤, 呂家成, 郭中平 申請人:成都蓉生藥業有限責任公司