一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌的製作方法

2023-06-02 08:52:21

一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌pseudozymaaphidisCNm2012，保藏號為CCTCCNO：M2013563。該菌株分離自桑樹葉面，是一種類酵母真菌，在土豆平板培養基上該菌的菌落顏色呈粉紅色，中間部分平滑類似於酵母的菌落，但邊緣長有菌絲；在薩氏液體培養基中培養7天，其菌體梭狀，大小不一，胞內含有許多油滴狀物質，隨著生長長出菌絲；菌株的生長適溫為20-30℃，pH6.5-7.5；菌株的18SrDNA序列1416bp，NCBI序列號為KF443200，28SrDNA序列627bp，序列號為KF443201，ITSrDNA序列784bp，序列號為KF443199。該菌可通過捕食桑白粉菌分生孢子對桑白粉病進行生物防治，並且對桑樹以及家蠶沒有致病性。
【專利說明】—株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物病害生物防治領域，具體涉及一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012。
【背景技術】
[0002]桑樹是一種重要的經濟作物，除了其葉可以用作飼養家蠶外，其果實可食用，以及用於提取花青素，其根、莖也可入藥。桑白粉病是由子囊菌亞門核菌綱白粉菌目白粉菌科球針殼屬真菌引起的一種桑樹病害，受害桑葉因營養價值差，品質低劣，因而食用它的蠶體質變弱，容易誘發蠶病，導致蠶的繭量和繭層量少。桑白粉病的爆發對整個蠶桑行業造成巨大的經濟損失，因此如何防治桑白粉病成了蠶桑產業關注的焦點。長期以來為了防治桑白粉病，大量使用化學藥劑，不僅導致藥物殘留，還導致了耐藥病原菌株的產生。因此尋找新的防治白粉病的方法具有十分重要的意義。生物防治方法是近年來研究的熱點，生物防治主要是利用拮抗，競爭，或捕食(寄生或腐生)作用防治病原菌，但目前利用微生物製劑來防治桑樹病害國內外尚未見相關研究報導。

【發明內容】

[0003]為了減少化學農藥的使用對環境的汙染及生物安全的影響，本發明提供一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,通過捕食桑白粉菌分生孢子的作用形式來防治桑樹白粉病。
[0004]本發明所述的菌株從桑樹葉片表面分離，該菌株已於2013年11月10日保藏在湖北省武漢市武漢大學(郵編:430072，電話:027-68754052)中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，菌株保藏號為 CCTCC NO:M 2013563。
[0005]菌株接種於土豆固體培養基中，28°C培養4天，培養基上出現中間平滑似酵母，邊緣長出菌絲的粉紅色菌落，顯微觀察，菌體梭狀，大小不一，菌體中央有油滴狀物質，隨著生長長出長短不一的菌絲。菌株18SrDNA序列1416bp,序列號為KF443200 ;28SrDNA序列627bp，序列號為KF443201 ;ITSrDNA序列784bp，序列號為KF443199。根據形態學和分子生物學特徵，菌株被鑑定為pseudozyma aphidis ,菌株號CNm2012。
[0006]本發明所述的P1SewiZozjffla aphidis CNm2012的分離、純化和保種方法是,將發現對桑白粉菌分生孢子有捕食作用的菌株塗布到含有青鏈黴素的土豆培養基上培養，挑取培養物在純化培養基上純化培養，培養條件:20-30°C，PH 6.5-7.5，然後純化菌株轉接到斜面進行保種。
[0007]本發明以捕食作用的方式來防治桑白粉病,試驗表明菌株/zsewi/oiywa aphidisCNm2012對桑樹及家蠶沒有致病性。
[0008]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖 1、pseudozyim aphidis CNm2012 菌體的形態特徵
28°C,在180r/min的轉速下於薩氏液體培養基中搖床培養7天飽pseudozyma aphidisCNm2012菌體的顯微結構圖，刻度標尺為20 μ m。
[0009]圖l、psoudozym3 aphidis CNm2012菌株基於ITS rDNA的系統進化分析樹 'Upseudozyma屬的14個種的ITS rDNA序列進行比對,依據臨近法構建系統發育進
化樹，括弧內為菌株ITS rDNA序列的序列號。
[0010]摩[IPseudozyma aphidis CNm2012菌株對桑白粉菌分生孢子的捕食作用
利用倒置顯微鏡對CNm2012菌株與桑白粉菌孢子混合液進行每小時跟蹤拍攝所得的顯微圖，刻度標尺為20 μ m。
[0011]圖4、以桑白粉菌為營養的aphidis CNm2012菌株的生長曲線圖
用CNm2012菌株與不同濃度的桑白粉菌分生孢子共同培養，每隔12小時取樣檢驗其0D600的吸光值(每組皆以各自濃度的桑白粉菌分生孢子懸液作為空白對照)。
[0012]圖5、田間試驗防治效果顯微鏡觀察 在桑葉感染桑白粉菌早期以CNm2012菌株處理過的桑葉和對照桑葉在一周之後的表面顯微形態，A是CNm2012菌株處理過的桑葉表面，B是對照桑葉表面，刻度標尺為100 μ m。
[0013]本發明的優點:本發明菌株/zsewi/ozjffla o^CNm2012的田間使用與化學農藥相比不汙染環境或產生藥害，也不會導致耐藥病原菌株的產生；菌株對生長條件的要求不苛刻，生長迅速，容易製備和生產菌劑；菌株可以顯著抑制桑白粉菌病斑個數的增加，顯著減少分生孢子的產生、擴散與感染傳播，釋放到環境可發揮持續的防治作用。
【具體實施方式】
[0014]實施例1 pseudozyma aphidis CNm2012 的分離和鑑定
1.菌株的分離與純化
(I)分離。培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，青鏈黴素3g，單蒸水1L。將在觀察白粉菌分生孢子發芽過程中，發現的對其有捕食作用的菌株塗布到培養基上28°C恆溫培養。
[0015](2)純化。薩氏培養基:葡萄糖40g,酵母膏IOg,蛋白腖IOg,瓊脂粉36g,單蒸水1000ml, PH 6.5-7.5。挑取培養物在該培養基上劃線接種菌株，28°C恆溫培養。
[0016](3)保種。土豆培養基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，單蒸水1L。將純化的菌株在該培養基上斜面保存。
[0017]2.菌株的形態學和分子生物學特徵 (I)形態學特徵
Pseudozyma aphidis CNm2012的菌落常常是二態的:中間部分呈粉紅色的漿糊狀或者奶油狀，而邊緣則有呈放射狀生長的菌絲。它的生長初期像酵母:兩端芽殖，常常合軸繁殖。菌絲透明有隔，在隔附近梗狀旁枝的出現使得芽分生孢子由紡錘形和橢圓形變成圓柱狀，常常會出現短的氣生菌絲鏈，有的氣生菌絲會有分支，有的則沒有，氣生菌絲鏈都是由紡錘形的枝分生孢子組成。氣生菌絲的出現常常使得其菌落出現絨毛，或者看起來像披上了一層白霜。隨著菌株的老齡化，菌落看起來具有馬蹄紋形狀。
[0018](2)分子生物學特徵
純化菌株接種在薩氏液體培養基(葡萄糖4g,酵母膏Ig,蛋白腖lg，單蒸水100ml,PH6.5-7.5) Φ, 20-30°C, 150-200r/min,振蕩培養 10-20 天。接下來 5000 轉離心 5 分鐘，丟棄上清液，然後再用無菌水衝洗三次，衝洗方法是重懸、離心、棄液。然後於烘箱中40°C烘10-15小時，再用液氮將其研碎，提取菌體基因組。
[0019]ITS引物對為
ITSl (5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')
ITS4 (5; -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，
26S引物對為
NL-1(5』-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA-3』) NL-4(5』-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3』)，
18S引物對為
NSl (5』 - GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3』)
NS6 (5』 — GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 3』)
用PCR的方法進行擴增，獲得ITS rDNA序列784bp、18S rDNA序列1416bp，28S rDNA序列627bp。在NCBI中應用BLAST軟體對這三個序列進行比對，並基於ITSrDNA構建進化樹，依據鄰近法構建的系統發育樹顯示該菌株與聚為一枝(圖2)。
[0020]依據菌株的形態學和分子生物學特徵，菌株CNm2012被鑑定為pseudozymaaphidisο
[0021]實施例2菌株P1SewiZozjffla aphidis CNm2012對桑白粉菌分生孢子捕食作用的顯微觀察
稱取馬鈴薯100g，葡萄糖10g，瓊脂9g，單蒸水500ml，PH6.5-7.5，將配置好的培養基置入高壓鍋中120°C滅菌30分鐘。將菌株CNm2012在該PDA板上進行活化。然後用500ml的三角瓶對菌株進行發酵，發酵所用的培養基是薩氏培養基，其配方是:葡萄糖4g，酵母膏lg，蛋白腖lg，單蒸水100ml,PH6.5-7.5。發酵條件是:溫度20_30°C，180r/min，發酵4天。將發酵好的菌液1000轉離心5分鐘去除上清液，再用無菌水衝洗三次，衝洗方法是重懸、離心、棄液。將上述步驟所得到的菌體與白粉菌分生孢子混合，重懸於無菌水中，對其進行跟蹤觀察(圖3)。
[0022]根據對該菌株與桑白粉菌分生孢子混合在一起的跟蹤觀察發現，白粉菌分生孢子的出現吸引了菌株aphidis CNm2012,該菌株圍繞著白粉菌分生孢子生長,並且利用其進行繁殖。
[0023]實施例3基於桑白粉菌為營養的aphidis CNm2012菌株的生長曲線測定
將CNm2012菌株分別與不同濃度的桑白粉菌分生孢子混合成100ml的懸液，懸液中包含有濃度為 105cfu/ml 的 CNm2012 菌株，濃度分別為 6 X IO2 cfu/ml、6X 103cfu/ml、6X IO4cfu/ml的桑白粉菌分生孢子。將混合液置於28°C，180r/min的搖床中培養，每隔12小時取樣檢驗其0D600的吸光值(每組皆以各自濃度的桑白粉菌分生孢子懸液作為空白對照)。試驗設置105cfu/ml濃度的CNm2012水溶液為陰性對照。結果顯示:CNm2012菌株的吸光光度值隨著桑白粉菌分生孢子濃度的增加而增加(表1),表明aphidis CNm2012菌株確實將桑白粉菌作為了營養進行了捕食(圖4)。
[0024]表1.CNm2012菌株以桑白粉菌為營養生長的0D600值
【權利要求】
1. 一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,其保藏號為 CCTCC NO: M 2013563。
【文檔編號】C12N1/14GK103642699SQ201310608814
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】邱欣, 汪靜傑, 張琳, 馮麗春, 段正巧, 劉豔萍, 陳倩茜, 萬永繼 申請人:西南大學