一種檢測豬基因組拷貝數變異的pcr試劑盒及檢測方法
2023-06-02 08:49:11 3
一種檢測豬基因組拷貝數變異的pcr試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了生物檢測領域內的一種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒，所述試劑盒包括2×SYBRGreenqPCRMix試劑、如SEQIDNO.1所示的目標序列正向引物、如SEQIDNO.2所示的目標序列反向引物、如SEQIDNO.3所示的參考序列正向引物、如SEQIDNO.4所示的參考序列反向引物、如SEQIDNO.5所示的參考序列、去離子水、無拷貝數變異的對照樣本，本發明提供的對CNVs的檢測不受豬年齡、性別等限制，檢測方法簡單易操作、準確，可用於豬基因組CNVs的檢測。
【專利說明】—種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒及檢測方法
【技術領域】[0001]本發明涉及一種PCR試劑盒，特別涉及一種檢測豬基因組拷貝數變異檢測方法。
【背景技術】[0002]自20世紀80年代以來，由於生物技術的發展，特別是人類基因組計劃的起動(1991)，基因組DNA序列的遺傳變異即分子多態性，被大量開發出來。除了限制性片段長度多態性(RFLP)、單核苷酸多態性(SNPs)、微衛星(Microsatellite)等這些常規的遺傳標記外，新近在人類基因組中又發現了另外一類豐富的多態性來源一拷貝數變異(Copy numbervariations, CNVs)。CNVs是指基因組中與參考序列相比>lkb的DNA片段插入、缺失和/或擴增，及其相互組合衍生出的複雜染色體結構變異。相鄰的、部分重疊的CNVs合併在一起成為一個更大的基因組片段成為拷貝數變異區間(Copy Number Variation Region,CNVR)。拷貝數變異具有基因組覆蓋範圍廣(人類基因組上CNVs覆蓋率約13%)、突變率高、分布於基因組特定位置、可遺傳及相對穩定的特點。[0003]目前，實時螢光定量PCR (qPCR)技術是一種常用的CNVs檢測技術。在PCR反應體系中，加入過量SYBR Green螢光染料，SYBR Green螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入DNA鏈中的SYBR分子不發射螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步，進而通過檢測螢光信號的強度來反映基因組DNA的數量。通過對檢測樣本的目的基因(具有拷貝數多態)及參考基因(無拷貝數多態，只有2個拷貝)進行相對定量，比較這兩個檢測值的比值估計檢測樣本候選基因的拷貝數。該方法具有簡單易操作、成本低的優勢，可以檢測目的片段的絕對拷貝數，但不適於大樣本的高通量檢測。[0004]豬作為一種重要的經濟動物和人類醫學研究的模式動物，它的一些重要的經濟性狀如繁殖、生長、肉質、抗病等備受研究者們關注。因此，對豬基因組CNVs的檢測，不僅有利於了解CNVs這一遺傳變異對豬基因組的影響，而且為開展CNVs與經濟性狀和疾病表型之間的關聯分析研究提供技術支持。
【發明內容】
[0005]本發明的目標是提供一種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒及檢測方法，對CNVs的檢測不受豬年齡、性別等限制，檢測方法簡單易操作、準確。[0006]本發明的目標是這樣實現的:一種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒及檢測方法， 所述試劑盒包括2XSYBR Green qPCR Mix試劑、如SEQ ID N0.1所示的目標序列正向引物、如SEQ ID N0.2所示的目標序列反向引物、如SEQ ID N0.3所示的參考序列正向引物、如SEQ ID N0.4所示的參考序列反向引物、如SEQ ID N0.5所示的參考序列、去離子水、無拷貝數變異的對照樣本； 作為本發明的進一步限定，目標序列如SEQ ID N0.6所示。[0007]所述檢測方法包括以下步驟:1)提取豬的基因組DNA；
2)以上述豬基因組DNA為模板，利用序列為SEQID N0.1的目標序列正向引物、序列為SEQ ID N0.2的目標序列反向引物以及序列為SEQ ID N0.3的參考序列正向引物、序列為SEQ ID N0.4的參考序列反向引物通過實時螢光定量PCR反應擴增出試驗組目標序列和試驗組參考序列；
3)以對照樣本為模板，利用序列為SEQID N0.1的目標序列正向引物、序列為SEQ IDN0.2的目標序列反向引物以及序列為SEQ ID N0.3的參考序列正向引物、序列為SEQ IDN0.4的參考序列反向引物通過實時螢光定量PCR反應擴增出對照組目標序列和對照組參考序列；
3)根據上述實時螢光定量PCR螢光值，以參考序列為標準，推斷目標序列的拷貝數。
[0008]作為本發明的進一步限定，所述步驟2)中實時螢光定量PCR反應使用的擴增體系以20 μ I計為:
50ng/ μ I 模板 DNAI μ I,
2X SYBR Green qPCR Mix 10 μ I, lOpmol/μΙ 引物 FI μ I,
lOpmol/μΙ 引物 RI μ I,
去離子水7 μ I。
[0009]作為本發明的進一步限定，所述步驟2)中實時螢光定量PCR反應條件為:
a)預變性:
95 0C 5分鐘；
b)擴增反應:
變性:95°C 10秒，
退火:60°C 10秒，
延伸:72°C 10秒，
45個循環；
72 0C 10 分鐘；
c)繪製溶解曲線:
950C 5 秒，
65 0C I分鐘，
97 0C 10 秒。
[0010]與現有技術相比，本發明的有益效果在於:本發明提供的對CNVs的檢測不受豬年齡、性別等限制；並且檢測方法簡單易操作、準確。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為qPCR時繪製的擴增曲線。
[0012]圖2為qPCR時繪製的標準曲線。
[0013]圖3為qPCR時引物的溶解曲線。【具體實施方式】[0014]用以下實例對本發明做進一步解釋，但不限定本發明的範圍，若無特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0015]實施例1為本發明的檢測方法，步驟如下:
1.1豬耳組織基因組DNA提取
本試驗採用QIAGEN血液與組織DNA提取試劑盒，從豬耳組織中提取基因組DNA，具體方法如下:
1)取小於25mg的耳組織置於2ml的離心管中，用手術剪刀充分剪碎；
2)加入180μ I BufferATL及20μ I蛋白酶K，漩渦混勻，56°C消化2-4小時(每隔0.5小時混勻一次)至組織塊消化完全；
3)加入200 μ I BufferAL，漩渦混勻，56°C消化 IOmin ；
4)加入200μ I無水乙醇,鏇渦混勻；
5)將消化液倒入吸附柱中，置於2ml離心管，8000rpm離心Imin；
6)取出吸附柱並置於新的2ml離心管,加入500μ I BufferAWl, 8000rpm離心Imin ；
7)取出吸附柱並置於新的2ml離心管,加入500μ I BufferAW2,14000rpm離心3min ;
8)將吸附柱轉移到新的2ml離心管中，加入100μ I BufferAE，室溫放置5_10min，8000rpm 離心 Imin ；
9)基因組DNA存在於離心管中溶液中，4°C保存備用或_20°C長期保存。
`[0016]1.2目標序列及參考序列的擴增
本發明中的參考序列為已知的不存在拷貝數變異的序列，即胰高血糖素基因(Glucagon, GCG)中的一段147bp的序列，如SEQ ID N0.5所示。正反向擴增通用引物分別為:如 SEQ ID N0.3 所示的 F5』 -GAATCAACACCATCGGTCAAAT-3』 和如 SEQ ID N0.4 所示的R5』-CTCCACCCATAGAATGCCCAGT-3』 。
[0017]目標序列為一段164bp的序列，如SEQ ID N0.6所示，正反向目標引物為:如 SEQ ID N0.1 所示的 F5』 -TTGGGAAATGTTCAACTGTGTA -3』 和如 SEQ ID N0.2 所示的R5，-TCAATGGAATGAGGTAGGGTCT -3，。
[0018]目標序列和參考序列的實時螢光定量PCR反應體系一樣，均以20 μ I計為:
50ng/ μ I 模板 DNA I μ I,
2XSYBRGreenqPCRMix 10 μ I,
lOpmol/μΙ 引物 F I μ I,
lOpmol/μΙ 引物 R I μ I,
去離子水7 μ I。
[0019]PCR反應條件為:
(1)預變性:
95 °C 5分鐘；
(2)擴增反應:
變性:95°C 10秒，
退火:60°C 10秒，
延伸:72°C 10秒，
45個循環；72 °C 10 分鐘；
(3)繪製溶解曲線:
95 0C 5 秒，
65 0C I分鐘，
97 0C 10 秒。
[0020]根據NCBI資料庫收錄的BD114基因(NC_010449.4)序列設計引物，包括如SEQ IDN0.7正向引物和如SEQ ID N0.8反向引物，通過進行qPCR擴增，繪製標準曲線檢測引物的擴增效率、擴增曲線和溶解峰來確定引物是否適用於qPCR分析，目標序列和參考序列的引物擴增效率在2.0 (1.9-2.1)左右，3個倍比稀釋而成的濃度梯度模板進行qPCR時，其擴增曲線有好的梯度，即DNA每稀釋2倍，Ct值增加I左右(如圖1所示)；繪製的標準曲線3個點在一條直線上(如圖2所示)；繪製的溶解曲線，各樣品曲線吻合在一起，且曲線走勢平滑，峰高且尖，無引物二聚體或非特異擴增引起的雜峰(如圖3所示)。本試劑盒所包含的引物符合上述要求，擴增效果穩定、特異性強，通過實時螢光定量PCR反應可準確反應基因組中目標序列的拷貝數變異情況。
[0021]1.3拷貝數變異的推斷
每個樣品分別用目標序列和參考序列的引物進行擴增，並且每對引物3個重複。根據2'AAct方法進行拷貝數的分析。2—嶽計算公式為:2'AAct=(Ct目標序列~Ct參考序列)纖_(Ct
試驗組即為待檢測有無CNVs的樣本，對照組即為已知無拷貝數變異的對照樣本。τ麻表示的是試驗組目標序列的拷貝數相對於對照組的倍數。
[0022]當目標序列為正常(拷貝數為2)序列時，根據2_ΛΛα計算出歸一化比值為I左右。目標序列存在單拷貝缺失時(拷貝數為l)，ct值增加1，經計算歸一化比值為0.5左右。目標序列為雙拷貝缺失時(拷貝數為O),即沒有目標序列,經2_ΛΛα計算歸一化比值為O左右，當目標序列為單拷貝增加時(拷貝數為3)，Ct值降低0.5左右，經計算歸一化比值在1.5左右；雙拷貝增加時(拷貝數為4)，其Ct值降低1，歸一化比值為2左右，其他情況的拷貝數依次類推。
[0023]實施例2
本試劑盒在不同豬基因組DNA樣品CNVs檢測中的應用
按照實施例1的方法，對採自中國不同地區的8頭豬進行CNVs檢測，結果如下:
表1中C3個體是已知的正常2倍體，為對照樣品 表1
【權利要求】
1.一種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒，其特徵在於，包括2XSYBR Green qPCRMix試劑、如SEQ ID N0.1所示的目標序列正向引物、如SEQ ID N0.2所示的目標序列反向引物、如SEQ ID N0.3所示的參考序列正向引物、如SEQ ID N0.4所示的參考序列反向引物、如SEQ ID N0.5所示的參考序列、去離子水、無拷貝數變異的對照樣本。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬基因組拷貝數變異的PCR試劑盒，其特徵在於，目標序列如SEQ ID N0.6所示。
3.一種使用權利要求1或2所述的PCR試劑盒檢測豬基因組拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)提取豬的基因組DNA；
2)以上述豬基因組DNA為模板，利用序列為SEQID N0.1的目標序列正向引物、序列為SEQ ID N0.2的目標序列反向引物以及序列為SEQ ID N0.3的參考序列正向引物、序列為SEQ ID N0.4的參考序列反向引物通過實時螢光定量PCR反應擴增出試驗組目標序列和試驗組參考序列； 3)以對照樣本為模板，利用序列為SEQID N0.1的目標序列正向引物、序列為SEQ IDN0.2的目標序列反向引物以及序列為SEQ ID N0.3的參考序列正向引物、序列為SEQ IDN0.4的參考序列反向引物通過實時螢光定量PCR反應擴增出對照組目標序列和對照組參考序列； 3)根據上述實時螢光定量PCR螢光值，以參考序列為標準，推斷目標序列的拷貝數。
4.根據權利要求3所述的一種檢測豬基因組拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於，所述步驟2)中實時螢光定量PCR反應使用的擴增體系以20 μ I計為: 50ng/ μ I 模板 DNAI μ I, 2X SYBR Green qPCR Mix 10 μ I, lOpmol/μΙ 引物 FI μ I, lOpmol/μΙ 引物 RI μ I, 去離子水7 μ I。
5.根據權利要求3所述的一種檢測豬基因組拷貝數變異的檢測方法，其特徵在於，所述步驟2)中實時螢光定量PCR反應條件為: a)預變性: .950C 5分鐘； b)擴增反應: 變性:95°C 10秒， 退火:60°C 10秒， 延伸:72°C 10秒， .45個循環；
.720C 10 分鐘； c)繪製溶解曲線:
.950C 5 秒， .650C I分鐘，
.970C 10 秒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614472SQ201310608226
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】劉劍鋒, 程洪青, 王海飛 申請人:揚州創日畜牧科技有限公司