水稻莖杆伸長基因及其編碼蛋白和用途的製作方法

2023-06-02 08:49:21

專利名稱：水稻莖杆伸長基因及其編碼蛋白和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物學領域，具體地說，本發明涉及新的水稻(Oryza sativa)莖杆伸長基因，及其編碼蛋白和啟動子。本發明還公開了編碼這種莖杆伸長基因的的用途，尤其是在植物生長改良和雜交育種中用於改變植物的莖杆伸長性和抗衰老性。
背景技術：
植物的快速生長對於作物、林業生產和抵抗不良氣候條件包括乾旱缺水、洪澇、低溫等有著十分重要的作用，同時也是研究植物細胞分化、激素調控、分子生理的良好模式。
然而，目前尚沒有公開過與植物快速生長有關基因。因此，為了有效地、針對性地改變植物品種的快速生長性，本領域迫切需要開發與快速生長性有關的蛋白及其編碼基因。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的莖幹伸長蛋白(即水稻莖幹伸長蛋白)及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在改變植物快速生長性(如花期延長或果實成熟延緩)方面的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的水稻莖幹伸長蛋白，該多肽源自水稻，它包含具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO3胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物莖杆伸長功能的由(a)衍生的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述水稻莖幹伸長蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a) 具有SEQ ID NO1中1-5900位的序列；(b) SEQ ID NO1缺失了第2927-3169位或3153-3157位所形成的序列；；(c) 具有SEQ ID NO2中1-2172位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了製備水稻莖幹伸長蛋白的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出水稻莖幹伸長蛋白。
在本發明的第五方面，提供了與上述的水稻莖幹伸長蛋白特異性結合的抗體。還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-2226個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了抗本發明蛋白的抗體以及一種檢測樣品中是否存在水稻莖幹伸長蛋白的方法，它包括將樣品與水稻莖幹伸長蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在水稻莖幹伸長蛋白。
在本發明的第七方面，提供了一種改變植物快速生長性和或抗衰老性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列，所述的水稻莖幹伸長蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO3胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物莖杆伸長功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；
(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了Eui及其突變體(eui)控制植物莖杆的生長和發育。
圖2顯示了eui可消除水稻不育系的包頸。
圖3顯示了Eui基因控制節間分生組織的細胞分裂。
圖4顯示了eui基因可產生或積累更多的赤黴素(簡寫為GA或GA3)。
圖5顯示了在不同GA3濃度處理下幼苗高度，上方曲線是帶突變基因eui植株的高度，下方曲線是野生型Eui基因植株的高度。
圖6顯示了在不同GA3濃度處理下抽穗期植株高度，上方曲線是帶突變基因eui植株的高度，下方曲線是野生型Eui基因植株的高度。圖5和6表明Eui控制了植株對GA3的敏感性。
圖7顯示了eui植株有抗衰老功能。
圖8顯示了Eui轉基因eui突變植物回復正常伸長。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次從水稻(Oryza sativa.L)中獲得了一個第一節間快速發育和高度伸長的突變體eui(Elongated upper mostinternode)，該突變體表現為單基因隱性遺傳，在抽穗期第一節間能快速伸長，並對GA3高度敏感，在逆境情況下的伸長更為迅速，該基因前期已被初步定位於水稻第五染色體的長臂端。並被認為是水稻雜交育種的第四因子。本發明人利用圖位克隆的方法精細定位和克隆了該功能基因，結果表明Eui編碼一個調節植物激素和細胞生長的關鍵酶蛋白。將該eui基因導入秈稻，可改良各類雜交稻不育系包頸性狀。這表明，本發明基因可應用於植物的快速生長、抗衰老、新型植物類型的轉基因創造和雜交稻品種的分子育種。
在本發明中，術語「水稻莖杆伸長蛋白」、「水稻莖幹伸長多肽」、「Eui蛋白」、「Eui多肽」等可互換使用，都指具有水稻莖幹伸長蛋白胺基酸序列(SEQID NO3)的蛋白或多肽。
在本發明中，術語「突變型水稻莖杆伸長蛋白」、「水稻長節間蛋白」、「突變型水稻莖幹伸長多肽」、「eui蛋白」、「eui多肽」等可互換使用，都指具有突變型水稻莖幹伸長蛋白胺基酸序列。eui蛋白不具有Eui蛋白相應活性或者活性喪失。在本發明中，「本發明蛋白或多肽」包括「Eui蛋白」和「eui蛋白」；「本發明基因」指編碼「Eui蛋白」和「eui蛋白」的多核苷酸。
在未特別指出時，術語「莖幹伸長蛋白」包括突變型和野生型莖幹伸長蛋白。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，「分離的水稻莖幹伸長蛋白或多肽」是指水稻莖幹伸長蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化水稻莖幹伸長蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括水稻莖幹伸長蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然水稻莖幹伸長蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。
在本發明中，術語「水稻莖幹伸長蛋白」指具有水稻莖幹伸長蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與水稻莖幹伸長蛋白相同功能的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括水稻莖幹伸長蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與水稻莖幹伸長蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗水稻莖幹伸長蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含水稻莖幹伸長蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了水稻莖幹伸長蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有水稻莖幹伸長蛋白序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供水稻莖幹伸長蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然水稻莖幹伸長蛋白的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「水稻莖幹伸長蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO3的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡併的變異體。如本文所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO3的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO3所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼水稻莖幹伸長蛋白的多聚核苷酸。
本發明的水稻莖幹伸長蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或水稻莖幹伸長蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的水稻莖幹伸長蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼水稻莖幹伸長蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，水稻莖幹伸長蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含水稻莖幹伸長蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對於轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得快速生長性/抗衰老性改變的植物。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的水稻莖幹伸長蛋白或多肽有多方面的用途。例如用於篩選促進或對抗水稻莖幹伸長蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組水稻莖幹伸長蛋白篩選多肽庫可用於尋找有價值的能抑制或刺激水稻莖幹伸長蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對水稻莖幹伸長蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的水稻莖幹伸長蛋白基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達水稻莖幹伸長蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的各類抗體可以利用水稻莖幹伸長蛋白基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與水稻莖幹伸長蛋白基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。抗水稻莖幹伸長蛋白的抗體可用於檢測樣品中的水稻莖幹伸長蛋白。
本發明還涉及定量和定位檢測水稻莖幹伸長蛋白水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的水稻莖幹伸長蛋白水平，可用於解釋水稻莖幹伸長蛋白在快速生長性和抑制伸長方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在水稻莖幹伸長蛋白的方法是利用水稻莖幹伸長蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與水稻莖幹伸長蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在水稻莖幹伸長蛋白。
本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析。用水稻莖幹伸長蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測水稻莖幹伸長蛋白的轉錄產物。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從水稻基因組和cDNA文庫中分離出的，其序列如SEQ ID NO2所示，它包含的多核苷酸序列全長為2172個鹼基，其開放讀框位於1-2172位，編碼全長為723個胺基酸的水稻莖幹伸長蛋白(SEQ ID NO3)。在另一實施例中還分離了莖杆伸長基因的基因組序列，如SEQID NO1所示(包含內含子)。
水稻莖幹伸長蛋白具有明確的控制植物莖幹伸長的功能，是一個能用於構建正義和反義的轉基因農作物、花卉、果蔬等轉基因植物的新基因。
水稻莖幹伸長蛋白為改變植物的快速生長性包括抑制伸長、抗衰老性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。可以導入正義和反義莖幹伸長基因，可改變現有優良農作物品種的快速生長性，獲得莖幹快速伸長或抑制伸長的小麥、水稻等農作物或其他品種如林草、果樹、花木等，解決農林業生產中存在的實際問題。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物學-實驗手冊(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1水稻莖幹伸長蛋白基因的克隆利用發明人構建的包含莖幹伸長蛋白基因Eui及其突變基因eui組成的、本領域內技術人員清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或positioncloning)群體，按分子標記定位Eui/eui於一個小的基因組片段內，比如30kb內。在此基礎上，用常規方法分離包含該片段的基因組DNA克隆。經酶切和進一步的雜交鑑定確定其中一個含完整水稻的莖幹伸長蛋白Eui基因。
經全核苷酸序列分析結果表明水稻莖幹伸長基因全長為5900bp(SEQ ID NO1，包含調控區和內含子)。經軟體分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO2所示，位，編碼全長為723個胺基酸的水稻莖幹伸長蛋白，其序列如SEQ ID NO3所示。
經序列分析，水稻莖幹伸長蛋白，如SEQ ID NO3所示，可能為一個激素代謝過程的P450單加氧酶蛋白(P450 monooxganase)。
進一步實驗表明，該蛋白要麼降解激素GA或Auxin或brassinosteroids，要麼抑制合成GA或Auxin或brassinosteroids。而突變基因eui不能形成有上述功能的蛋白，而使植株體內積累高含量的激素，並增加外源GA的功能(敏感性)(圖4-6)，促使植物細胞快速分裂、伸長(圖3)，使植物莖幹尤其是上部節間快速高度伸長，株高增加，並使eui的不育系因快速高度伸長，不再包頸(見圖1，2)。由於eui植株含有高量的激素，因此植株的生命力加強，抗衰老(圖7)。
為驗證克隆的Eui基因的功能，本發明人把水稻莖幹伸長基因Eui(含本身的啟動子)按上述的本領域內技術人員熟悉的水稻轉基因方法，轉到含突變基因eui的植株中，驗證了Eui可以互補eui的功能，轉基因植株恢復正常生長(圖8)。
實施例2RT-PCR法獲得水稻莖幹伸長蛋白的編碼序列為了驗證序列的正確性，根據SEQ ID NO1的序列，設計和合成了如下引物正向引物5』-3』ACGGAGGCCCATGAGCAAATTTCAA(SEQ ID NO4)反向引物5』-3』ACGTATCAGAGCCAGTCACAGCTTGG(SEQ ID NO5)。
相應地，為獲得莖幹伸長蛋白基因的cDNA探針，設計和合成了如下引物正向引物5′-3′ACCAGCGTCATCTTCAGCA(SEQ ID NO6)反向引物5′-3′AACGTCTCCCGCACCAC(SEQ ID NO7)RT-PCR擴增500bp的cDNA探針。
以用常規方法抽提的水稻Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨後94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，回收，連接到T-Easy載體上採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果結果驗證了水稻莖幹伸長蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO2)的正確性。
實施例3水稻莖幹伸長蛋白的結構分析根據cDNA(SEQ ID NO2)的核苷酸的序列，獲得編碼的莖幹伸長蛋白的序列(SEQ ID NO3)。經蛋白資料庫聯網查詢，莖幹伸長蛋白含有高度保守的細胞色素P450結構域。故此斷定莖幹伸長蛋白為一個P450單加氧酶。
實施例4水稻莖幹伸長蛋白的點突變經幾個Eui突變基因eui的序列比較，莖幹伸長蛋白的缺失、移碼和P450保守區的點突變均可以消除野生莖幹伸長蛋白的功能。本實施例表示在編碼區的2個缺失(即缺失SEQ ID NO1中2927-3169位和3153-3157位)分別引起水稻莖幹伸長蛋白功能喪失。
實施例5野生型和突變型水稻莖幹伸長蛋白的功能實驗為驗證野生型莖幹伸長蛋白的功能，把野生型水稻莖幹伸長基因Eui用其本身的啟動子，按本領域內技術人員熟悉的水稻轉基因方法，轉到含突變基因eui的植株中，驗證了野生型莖幹伸長蛋白可以互補突變型水稻莖幹伸長蛋白的功能，轉基因植株恢復正常生長，突變型水稻莖幹伸長蛋白不能產生本發明中所說的功能(圖8)。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國科學院上海植物生理研究所120水稻莖杆伸長基因及其編碼蛋白和用途1300273441607170PatentIn version 3.121012115900212DNA213水稻(Oryza sativa)4001taatcaagta tgtgagttat tcaatccttg gcaatttcca atacaaatac agacacacta60tgtatggaac ttttttatat atagtctatt aaacaatata tctttgagcc gtctgaaacc 120aaattatatg atattttttt agttaatcat accaagatca ttaattgagt aggaatataa 180gacttcaagg gggaatcaac aatattaatt gtttctgaga acaattattc aaagcaattc 240ataataaaag catatttatt ttaggagtgg gtacacacac tatctagctt gtaccatata 300taagtcaatg accacgatat atggctagcc acctccctcc atcatgaaat aaattaacct 360catacgaatt tagatataga atatgtccag atttattgat taaatcctag attgatttat 420tttaggacga agagattacc tgcctgcctg cactaaccat ctgcgacgcc gacgtgtcat 480ccatcggtcg acaaaacgta cgcaggccaa cacatgcata cgtacacaca attgcccatt 540tgcaccccgc tccccatgtc cacgtcagac ggcgacacgt acacattaac acatgtacac 600gtcgttttca cgtacgagct aagcaaatcc aacgtacaga aaatagttaa tttacccggt 660tgccaactgg gacacgtacg ccggccacgt cacaggtcta cgtggcgcgg tgtgggccgg 720gctaggaggg ttaaaagccc acgcttgtgt gctttggtca actcgtgcac ttattactct 780gaagagttat tagccggttc gatgtgtcgc gattactgtt gtaattaagt ctgtctctgt 840ggcgatatgt acgttgacga tgattaaggt ggtgtttgga tctagagact taactttagt 900ctctgtattt agacactaat ttaaagtatt aaatatagac taattacaaa actaattaca 960taaataaaaa cttatttgcg agataatttt ttttaagcct aattaatcca taattagaaa 1020atatttaatg tagcatcaca taggataatc atgggttaat taggctcaat agaatcgtct 1080
cgcgaattag tctaagatta tggatagttt ttattaatag tctacgttta atatatataa 1140ttagtgtcca aacatccgat aagatagaga cttaaaagtt ttaggtggtg tttagatcta 1200gggacttaac tttagtccct atatttagac actaatttag agtattaaat atagactact 1260tacaaaacta attacataaa taaaagctaa ttcgcgagat aattttttta agcctaatta 1320atatataatt agagaatgtt tactgtagca tcacatatgc taatcatgga ttaattaggc 1380tcaatagatt cgtctcgcga attagttcaa gattatggat gggttttatt aataatctac 1440gtttaatatt tataattagt gtccaaacat ccgatatgat agggacttaa aagttttaat 1500ctcatctaaa tatggtttta gtctcatcta aacagggtct aatagcagaa agttacgtga 1560gattcgtata ctcgtacgta cgtatttgca tcggaatttt caaaatccta gactctttct 1620agtactggtg gtacagtttg gcaaatctgg ttttttggat ggtttcagca tgtttaattt 1680gcagtgtgga attgttgaga tgctagagat tttttgcaga acttatgtga aatttaatta 1740ggcgtttcaa ctgtggctaa acgtgaagat atagcgcgct agagacgtgt gtgttggcag 1800tgttgctttg caatttgcat aggctcgtgg tgtttggttc agaaatttat ttaaggatcc 1860ggttgttttt tttttcattt tccttggtca atgttgtaaa gaatccgtag aatcttggca 1920agaagattct cccaaacctc caggaaagag gagaagattc tccggaatca gtggaagtag 1980tgcagtagct attgactggg atttttgtaa gcccggtcaa taggttcccc tgtacccttg 2040gagagaccct gcaagtgcac acagatcacg tatatatcca catgcctata tgtgcataga 2100tcacataggc acgcatcaaa agctttttaa tcctagctag cttactttaa tctttgatta 2160ttttcaatag aaatttaatg acgtttaact tgattcatca ttcggcgacg tctcttgaac 2220atgttaaagg ctgggccgag gcccaccaaa aacggaggcc catgagcaaa tttcaaattc 2280tgactcgcgc gcggtggcgg caaaattttg caggcgagac gtacctgtac tggctgcggc 2340ggcggccggc gctgtacgtg acggacccgg agctcatcgg cgagatcggg cggtgcgtgt 2400cgctcgacat gggcaagccc aagtacctcc agaaaggcca ggagccactc ttcggcggcg 2460gcgtcctcaa ggccaacggc gcgtgctggg cgcgccagcg caaggtcatc gcgccggagt 2520tctacatggc ccgtgtcagg gccatggtcc agctcatggt cgacgccgcg cagccgctga 2580tcgcctcctg ggaatccagg atcgacgccg ctggaggcgc ggcggcggcg gaggtcgtcg 2640
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agcaaaacga tcagaagtac tgaattagtt caattttttg atagacctgg tatggtcttt 4320taaattcaac ttttgaaagt acagtgaaat acaaatctag tgatgccata ttgtgggctt 4380gtgtagtata aattgtgaat caagcctacg gaattttttg ctgaaataca gtacgtgcct 4440gtcttataag aaaaacctga accgagaagc cattagcgtt gtcacatacg acgccacgct 4500cggtgactcg gtgagccagc gtgtgcacca tcagctcgcc agcagcgcgc gccaagaaag 4560accagcagcc atgtcggggt ccggcgacgc cgcgccggcg cggcacaacg cgggtcacgg 4620tcggcgacga cggcgcgtcc tcgtctgggc cagcttcgcc gcgctggtcc tgctgctcgt 4680cgccgcggcg gccgccatcg ccgcgctcgc cgtgctccgg ccgcgggacc cgaccacgga 4740gctcctgtcc gtgaacgcca cgggcgccac cccgcgcgtc gccgcgctgc cggccgtctc 4800cgtccagctc aacgtcacct tcctcctcgt cgtccgcgtg cgcaacccga accgggcgga 4860gttccgccac ggcgccgcca cgacggcgct cctgtaccgc ggcgccgagg tgggcgccgc 4920cggcgtgccc gcggggacgg tgccgagccg cggcgcggcg acgctgaggc tgaacatgac 4980ggtgcgggcg gacagggtgg tggcggcggc cggggtgggc ggcctcctcg cggacgtgct 5040cgccggcgag atggagttcg aggcgaggac ggaggtgcgc gggcgggtga agctgctcgg 5100gctcgtccgg cggagcgccg tggcgaggtc gctgtgccgc gtcgtgatcg gcgtcgccga 5160cgtgaaggtc cggcgccagg agtgccacaa cgagtccaag ctgtgactgg ctctgatacg 5220tattatacgt atgtacgctg tctttgtatt tgtacatgta tacgtgtgct gaagacagtc 5280gatttgtacg tactctgata tatgtgcacg aatttgtcgt ggcaataaat gtttaggcta 5340ttcataagct gtttctttgg tagactgtat atgtatattg ttaaaagtta ctgcagcctc 5400attgtcattg ttgtgtttcc aaaattttgg agaaatcaac aatatggtta ttcaatttac 5460atttgcaacc cctaaatata ttattcaagt agataaagtg gtcgcactgt gtgtttttct 5520tccatttttt caaagagata attaaacttg gtctgtggtg cacattgcag aaagctactg 5580tgaaacggat ggactattga actactctcg ttgtcattgg ttggcctaat gttagattac 5640atttttctac ctgaatatat gttttgagta attcatgtgt gttttatttc ccgtggcatt 5700acatatatgc tgtaacattc cgagttgtat ttttcttttt ttatttttat aatattccta 5760cgtttcaaag gagagtctgt gaaacaaaaa ggtagattag aacaacatat agctctcaaa 5820
ctagtgagaa atttttgctc ttaatgcaac agaggcacaa caaggagaaa atattcaaca 5880aacacgtcta ggttgctcct 590021022112172212DNA213水稻(Oryza sativa)220
221CDS222(1)..(2172)223
4002atg agc aaa ttt caa att ctg act cgc gcg cgg tgg cgg caa aat ttt 48Met Ser Lys Phe Gln Ile Leu Thr Arg Ala Arg Trp Arg Gln Asn Phe1 5 10 15gca ggc gag acg tac ctg tac tgg ctg cgg cgg cgg ccg gcg ctg tac 96Ala Gly Glu Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Arg Arg Arg Pro Ala Leu Tyr20 25 30gtg acg gac ccg gag ctc atc ggc gag atc ggg cgg tgc gtg tcg ctc 144Val Thr Asp Pro Glu Leu Ile Gly Glu Ile Gly Arg Cys Val Ser Leu35 40 45gac atg ggc aag ccc aag tac ctc cag aaa ggc cag gag cca ctc ttc 192Asp Met Gly Lys Pro Lys Tyr Leu Gln Lys Gly Gln Glu Pro Leu Phe50 55 60ggc ggc ggc gtc ctc aag gcc aac ggc gcg tgc tgg gcg cgc cag cgc 240Gly Gly Gly Val Leu Lys Ala Asn Gly Ala Cys Trp Ala Arg Gln Arg65 70 75 80aag gtc atc gcg ccg gag ttc tac atg gcc cgt gtc agg gcc atg gtc 288Lys Val Ile Ala Pro Glu Phe Tyr Met Ala Arg Val Arg Ala Met Val85 90 95cag ctc atg gtc gac gcc gcg cag ccg ctg atc gcc tcc tgg gaa tcc 336Gln Leu Met Val Asp Ala Ala Gln Pro Leu Ile Ala Ser Trp Glu Ser100 105110agg atc gac gcc gct gga ggc gcg gcg gcg gcg gag gtc gtc gtc gac 384Arg Ile Asp Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Glu Val Val Val Asp115 120125ggc gac ctc cgg agc ttc tcc ttc gat gtg ata tcg cgg gct tgc ttt 432Gly Asp Leu Arg Ser Phe Ser Phe Asp Val Ile Ser Arg Ala Cys Phe130 135140ggg agt gat tac tcg agg ggg agg gag atc ttc ctc cgc ctc cgt gag 480Gly Ser Asp Tyr Ser Arg Gly Arg Glu Ile Phe Leu Arg Leu Arg Glu
145 150 155 160ctg tcc ggg ctc atg tcg gag acc agc gtc atc ttc agc atc cct tcg 528Leu Ser Gly Leu Met Ser Glu Thr Ser Val Ile Phe Ser Ile Pro Ser165 170 175ctg agg cac ctg ccg acg ggg aag aac cgg agg atc tgg agg ctc acg 576Leu Arg His Leu Pro Thr Gly Lys Asn Arg Arg Ile Trp Arg Leu Thr180 185 190ggg gag atc cgg tcg ctg atc atg gag ctc gtc agg gag cgg agg tgc 624Gly Glu Ile Arg Ser Leu Ile Met Glu Leu Val Arg Glu Arg Arg Cys195 200 205gcg gcg agg gcg gcg agg gag cac ggc ggg aag gcg gcg ccg ccg tcg 672Ala Ala Arg Ala Ala Arg Glu His Gly Gly Lys Ala Ala Pro Pro Ser210 215 220ccg ccg gag cgc gac ttc ctc ggc tcc atc atc gag aac agc ggc ggg 720Pro Pro Glu Arg Asp Phe Leu Gly Ser Ile Ile Glu Asn Ser Gly Gly225 230 235 240cag ccg cgg ccg gac gac ttc gtg gtg gac aac tgc aag aac atc tac 768Gln Pro Arg Pro Asp Asp Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Asn Ile Tyr245 250 255ttc gcc ggg cac gag acg agc gcg gtc acc gcg acg tgg tgc ctc atg 816Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Val Thr Ala Thr Trp Cys Leu Met260 265 270ctg ctc gcc gcg cac ccg gag tgg cag gac cgc gcc cgc gcc gag gtg 864Leu Leu Ala Ala His Pro Glu Trp Gln Asp Arg Ala Arg Ala Glu Val275 280 285ctc gag gtc tgc ggc ggc gac ggc gcc gcc gcc ccc gcc gcg ccg gac 912Leu Glu Val Cys Gly Gly Asp Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Asp290 295 300ttc gac atg gtg tcc cgg atg cgg acg gtg ggg atg gtg gtg cag gaa 960Phe Asp Met Val Ser Arg Met Arg Thr Val Gly Met Val Val Gln Glu305 310 315 320acg ctg cgg ctg ttc ccg ccg tcg tcg ttc gtg gtg cgg gag acg ttc 1008Thr Leu Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Val Arg Glu Thr Phe325 330 335cgg gac atg cag ttg ggt agg ctg ctg gcg ccc aag ggc acc tac ctg 1056Arg Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu Leu Ala Pro Lys Gly Thr Tyr Leu340 345 350ttc gtc ccg gtg tcc acc atg cac cac gac gtc gcc gcc tgg ggc ccg 1104Phe Val Pro Val Ser Thr Met His His Asp Val Ala Ala Trp Gly Pro355 360 365
acg gcg agg ctg ttc gac ccg tcc cgc ttc cgc gac ggc gtg gcg gcg 1152Thr Ala Arg Leu Phe Asp Pro Ser Arg Phe Arg Asp Gly Val Ala Ala370 375 380gcg tgc aag cac ccg cag gcg tcg ttc atg ccg ttc ggc ctc ggc gcc 1200Ala Cys Lys His Pro Gln Ala Ser Phe Met Pro Phe Gly Leu Gly Ala385 390 395 400cgc acc tgc ctc ggc cag aac ctc gcg ctc gtc gag gtc aag acg ctc 1248Arg Thr Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Leu Val Glu Val Lys Thr Leu405 410 415gtc gcc gtc gtc ctc gcc cgg ttc gag ttc acg ctc tcg ccg gag tac 1296Val Ala Val Val Leu Ala Arg Phe Glu Phe Thr Leu Ser Pro Glu Tyr420 425 430agg cac tcg ccg gcg ttc cgg ctc atc atc gag ccg gag ttc ggc ctc 1344Arg His Ser Pro Ala Phe Arg Leu Ile Ile Glu Pro Glu Phe Gly Leu435 440 445cgc ctc cgc atc cgc cgc gcc ggc ggc ctg tgg ttg agt gag cgg ccg 1392Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Trp Leu Ser Glu Arg Pro450 455 460ttt gat tgg gac gcc gac gaa cag aaa aac ctg aac cga gaa gcc att 1440Phe Asp Trp Asp Ala Asp Glu Gln Lys Asn Leu Asn Arg Glu Ala Ile465 470 475 480agc gtt gtc aca tac gac gcc acg ctc ggt gac tcg gtg agc cag cgt 1488Ser Val Val Thr Tyr Asp Ala Thr Leu Gly Asp Ser Val Ser Gln Arg485 490 495gtg cac cat cag ctc gcc agc agc gcg cgc caa gaa aga cca gca gcc 1536Val His His Gln Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Glu Arg Pro Ala Ala500 505 510atg tcg ggg tcc ggc gac gcc gcg ccg gcg cgg cac aac gcg ggt cac 1584Met Ser Gly Ser Gly Asp Ala Ala Pro Ala Arg His Asn Ala Gly His515 520 525ggt cgg cga cga cgg cgc gtc ctc gtc tgg gcc agc ttc gcc gcg ctg 1632Gly Arg Arg Arg Arg Arg Val Leu Val Trp Ala Ser Phe Ala Ala Leu530 535 540gtc ctg ctg ctc gtc gcc gcg gcg gcc gcc atc gcc gcg ctc gcc gtg 1680Val Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu Ala Val545 550 555 560ctc cgg ccg cgg gac ccg acc acg gag ctc ctg tcc gtg aac gcc acg 1728Leu Arg Pro Arg Asp Pro Thr Thr Glu Leu Leu Ser Val Asn Ala Thr565 570 575
ggc gcc acc ccg cgc gtc gcc gcg ctg ccg gcc gtc tcc gtc cag ctc 1776Gly Ala Thr Pro Arg Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ser Val Gln Leu580 585 590aac gtc acc ttc ctc ctc gtc gtc cgc gtg cgc aac ccg aac cgg gcg 1824Asn Val Thr Phe Leu Leu Val Val Arg Val Arg Asn Pro Asn Arg Ala595 600 605gag ttc cgc cac ggc gcc gcc acg acg gcg ctc ctg tac cgc ggc gcc 1872Glu Phe Arg His Gly Ala Ala Thr Thr Ala Leu Leu Tyr Arg Gly Ala610 615 620gag gtg ggc gcc gcc ggc gtg ccc gcg ggg acg gtg ccg agc cgc ggc 1920Glu Val Gly Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Thr Val Pro Ser Arg Gly625 630 635 640gcg gcg acg ctg agg ctg aac atg acg gtg cgg gcg gac agg gtg gtg 1968Ala Ala Thr Leu Arg Leu Asn Met Thr Val Arg Ala Asp Arg Val Val645 650 655gcg gcg gcc ggg gtg ggc ggc ctc ctc gcg gac gtg ctc gcc ggc gag 2016Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Leu Leu Ala Asp Val Leu Ala Gly Glu660 665 670atg gag ttc gag gcg agg acg gag gtg cgc ggg cgg gtg aag ctg ctc 2064Met Glu Phe Glu Ala Arg Thr Glu Val Arg Gly Arg Val Lys Leu Leu675 680 685ggg ctc gtc cgg cgg agc gcc gtg gcg agg tcg ctg tgc cgc gtc gtg 2112Gly Leu Val Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg Ser Leu Cys Arg Val Val690 695 700atc ggc gtc gcc gac gtg aag gtc cgg cgc cag gag tgc cac aac gag 2160Ile Gly Val Ala Asp Val Lys Val Arg Arg Gln Glu Cys His Asn Glu705 710 715 720tcc aag ctg tga 2172Ser Lys Leu210321l723212PRT213水稻(Oryza sativa)4003Met Ser Lys Phe Gln Ile Leu Thr Arg Ala Arg Trp Arg Gln Asn Phe1 5 10 15Ala Gly Glu Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Arg Arg Arg Pro Ala Leu Tyr20 25 30
Val Thr Asp Pro Glu Leu Ile Gly Glu Ile Gly Arg Cys Val Ser Leu35 40 45Asp Met Gly Lys Pro Lys Tyr Leu Gln Lys Gly Gln Glu Pro Leu Phe50 55 60Gly Gly Gly Val Leu Lys Ala Asn Gly Ala Cys Trp Ala Arg Gln Arg65 70 75 80Lys Val Ile Ala Pro Glu Phe Tyr Met Ala Arg Val Arg Ala Met Val85 90 95Gln Leu Met Val Asp Ala Ala Gln Pro Leu Ile Ala Ser Trp Glu Ser100 105 110Arg Ile Asp Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Glu Val Val Val Asp115 120 125Gly Asp Leu Arg Ser Phe Ser Phe Asp Val Ile Ser Arg Ala Cys Phe130 135 140Gly Ser Asp Tyr Ser Arg Gly Arg Glu Ile Phe Leu Arg Leu Arg Glu145 150 155 160Leu Ser Gly Leu Met Ser Glu Thr Ser Val Ile Phe Ser Ile Pro Ser165 170 175Leu Arg His Leu Pro Thr Gly Lys Asn Arg Arg Ile Trp Arg Leu Thr180 185 190Gly Glu Ile Arg Ser Leu Ile Met Glu Leu Val Arg Glu Arg Arg Cys195 200 205Ala Ala Arg Ala Ala Arg Glu His Gly Gly Lys Ala Ala Pro Pro Ser210 215 220Pro Pro Glu Arg Asp Phe Leu Gly Ser Ile Ile Glu Asn Ser Gly Gly225 230 235 240Gln Pro Arg Pro Asp Asp Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Asn Ile Tyr245 250 255Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Val Thr Ala Thr Trp Cys Leu Met260 265 270Leu Leu Ala Ala His Pro Glu Trp Gln Asp Arg Ala Arg Ala Glu Val275 280 285Leu Glu Val Cys Gly Gly Asp Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Asp290 295 300Phe Asp Met Val Ser Arg Met Arg Thr Val Gly Met Val Val Gln Glu305 310 315 320
Thr Leu Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Val Arg Glu Thr Phe325 330 335Arg Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu Leu Ala Pro Lys Gly Thr Tyr Leu340 345 350Phe Val Pro Val Ser Thr Met His His Asp Val Ala Ala Trp Gly Pro355 360 365Thr Ala Arg Leu Phe Asp Pro Ser Arg Phe Arg Asp Gly Val Ala Ala370 375 380Ala Cys Lys His Pro Gln Ala Ser Phe Met Pro Phe Gly Leu Gly Ala385 390 395 400Arg Thr Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Leu Val Glu Val Lys Thr Leu405 410 415Val Ala Val Val Leu Ala Arg Phe Glu Phe Thr Leu Ser Pro Glu Tyr420 425 430Arg His Ser Pro Ala Phe Arg Leu Ile Ile Glu Pro Glu Phe Gly Leu435 440 445Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Trp Leu Ser Glu Arg Pro450 455 460Phe Asp Trp Asp Ala Asp Glu Gln Lys Asn Leu Asn Arg Glu Ala Ile465 470 475 480Ser Val Val Thr Tyr Asp Ala Thr Leu Gly Asp Ser Val Ser Gln Arg485 490 495Val His His Gln Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Glu Arg Pro Ala Ala500 505 510Met Ser Gly Ser Gly Asp Ala Ala Pro Ala Arg His Asn Ala Gly His515 520 525Gly Arg Arg Arg Arg Arg Val Leu Val Trp Ala Ser Phe Ala Ala Leu530 535 540Val Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu Ala Val545 550 555 560Leu Arg Pro Arg Asp Pro Thr Thr Glu Leu Leu Ser Val Asn Ala Thr565 570 575Gly Ala Thr Pro Arg Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ser Val Gln Leu580 585 590Asn Val Thr Phe Leu Leu Val Val Arg Val Arg Asn Pro Asn Arg Ala
595 600 605Glu Phe Arg His Gly Ala Ala Thr Thr Ala Leu Leu Tyr Arg Gly Ala610 615 620Glu Val Gly Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Thr Val Pro Ser Arg Gly625 630 635 640Ala Ala Thr Leu Arg Leu Asn Met Thr Val Arg Ala Asp Arg Val Val645 650 655Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Leu Leu Ala Asp Val Leu Ala Gly Glu660 665 670Met Glu Phe Glu Ala Arg Thr Glu Val Arg Gly Arg Val Lys Leu Leu675 680 685Gly Leu Val Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg Ser Leu Cys Arg Val Val690 695 700Ile Gly Val Ala Asp Val Lys Val Arg Arg Gln Glu Cys His Asn Glu705 710 715 720Ser Lys Leu210421125212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(25)223引物4004acggaggccc atgagcaaat ttcaa 25210521126212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(26)223引物
acgtatcaga gccagtcaca gcttgg26210621119212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(19)223引物4006accagcgtca tcttcagca19210721117212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(17)223引物4007aacgtctccc gcaccac 1權利要求
1.一種分離的水稻莖幹伸長蛋白，其特徵在於，它包含具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO3胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物莖杆伸長功能的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼權利要求1所述的多肽。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO3所示胺基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-5900位的序列；(b)SEQ ID NO1缺失了第2927-3169位或3153-3157位所形成的序列；(c)具有SEQ ID NO2中1-2172位的序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體或基因組中整合有權利要求3所述的多核苷酸。
8.一種水稻莖幹伸長蛋白的製備方法，其特徵在於，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出水稻莖幹伸長蛋白。
9.一種改良植物的方法，其特徵在於，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列，所述的水稻莖幹伸長蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO3胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO3胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進植物莖杆伸長功能的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，並且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入水稻莖幹伸長蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述方法改良了植物的莖杆伸長性和/或抗衰老性。
全文摘要
本發明提供了一種新的植物基因－水稻莖杆伸長基因，及其編碼蛋白和啟動子。本發明還公開了編碼這種莖杆伸長基因的的用途，尤其是在植物生長改良和雜交育種中用於改變植物的莖杆伸長性和抗衰老性。
文檔編號C12N15/63GK1566146SQ03129329
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者何祖華, 李群, 許永漢, 朱永友, 林鴻宣, 周海臣, 毛碧增 申請人:中國科學院上海植物生理研究所