用於改善瘤胃發酵的檸檬類黃酮混合物的製作方法

2023-06-02 06:59:26 2

專利名稱：用於改善瘤胃發酵的檸檬類黃酮混合物的製作方法
用於改善瘤胃發酵的檸檬類黃酮混合物描述本發明涉及檸檬類黃酮混合物用於改善瘤胃發酵的用途。MMVFA揮發性脂肪酸ACt擴增循環的增加Δ Δ Ct相對於PCR中的對照樣品的擴增循環的增加DGGE變性梯度凝膠電泳Μ. elsdenii 埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)ns不顯著PCR聚合酶鏈反應S. bovis牛鏈球菌(Streptococcus bovis)哺乳動物不具有用於消化結構性碳水化合物，即纖維素的合適的消化酶。因此，並 且為了獲取這樣重要的營養素來源，草食動物已經構築了容納能夠消化或發酵這樣的營養 素的共生菌群的發酵隔室。這些隔室位於宿主中的酶消化之前(反芻動物)或之後(胃後 發酵物質，即，馬科動物、兔子)。瘤胃的微生物僅僅部分地使用這些碳水化合物並釋放揮發 性脂肪酸(醋酸、丙酸和丁酸)，作為發酵產物，這些是反芻動物最重要的能量來源。在瘤胃 中增殖的微生物是能夠適應區室條件和利用所攝入食物的那些。將不同的食物級分，碳水 化合物和蛋白質發酵，並且通過瘤胃中產生的過剩的生物質(這又是十二指腸中最終吸收 的蛋白質的主要來源)補充VFA產生。纖維素髮酵細菌(分解纖維素的)在6. 4-7的pH下最佳地生長，並且產生的醋酸 多於澱粉和糖發酵物質(分解澱粉的)。最佳PH為約5. 5，並且當這些水平下降時，存在乳 酸相對產生的增加。隨著反芻動物生產系統的加強，基於飼料的飼養已經被給予用穀物配製的濃縮定 量食物配給替代，這提高了生長速率和降低了操作成本。然而，濃縮定量配給食物或由快速 發酵可溶性碳水化合物(澱粉)替代結構性碳水化合物(纖維素)導致出現了一些消化功 能障礙，如酸中毒和timpanism。瘤胃酸中毒可以被定義為通過消化大量富含可發酵碳水化合物的食物產生的消 化改變，並且這是肥育的小牛中最常見的功能障礙之一。其可以通過使細菌群從革蘭氏陰 性變為革蘭氏陽性、有利於如牛鏈球菌或埃氏巨型球菌這些物種的發育和改變VFA的比例 而導致死亡和發作。醋酸和丙酸的比例降低，而丁酸和乳酸增加。乳酸的增加影響了瘤胃 運動性，由於不能消除所產生的氣體產生了腹中積氣。急性症狀是厭食、黃綠色水樣糞便、 瘤胃張力缺乏、跛行、腹部縮回和脫水。亞急性形式包括頻繁腹中積氣、異常毛髮和出現在 屠宰後發現的肝膿腫。timpanism和腹中積氣被定義為由發酵過量產生和累積氣體(二氧化碳和甲烷) 所引起的消化性改變，引起蜂窩胃-瘤胃的異常膨脹。通常，加入抗生素物質(離子載體，如莫能菌素)使上述瘤胃功能障礙以潛在狀態存在。然而，這類作為生長增強劑的物質逐漸取消導致了這些病症的出現，引起高死亡率或 發病率，這對於利潤具有負面影響。這種對農場生產力的影響非常重要，因此需要這些抗生 素物質的可替換物。專利US4443471涉及M-139603的不同化學衍生物和M-139603反芻動物生長增強 劑，及其在降低由瘤胃發酵產生的甲烷量中的用途。專利US5196432涉及α _2腎上腺素受體拮抗劑在治療受乳酸酸中毒影響的反芻 動物中的用途。專利US5709894描述了用於反芻動物的食品添加劑，其含有穀氨酸和玉米發酵產 物，以提高瘤胃的發酵。專利申請US2003165487描述了基於米麴黴(Aspergillusoryzae)澱粉酶的方法 和組合物，以提高瘤胃的發酵效率和防止瘤胃乳酸濃度的有害增加，促進有益的瘤胃微生 物的生長。專利申請US2004009209涵蓋了保持反芻動物的瘤胃健康的方法，由低溼度糖蜜 和緩衝劑的混合物組成。PCT申請W09119489描述了通過將琥珀酸和其他羧酸鹽給予餵養高能量配給的反 芻動物來調控瘤胃PH水平的方法。PCT申請W09325616涉及包膠於源自可溶性異源蛋白和還原糖的美拉德反應的基 質中的澱粉產品，以改善反芻動物瘤胃中的微生物發酵效率。PCT申請W02004009104涉及埃氏巨型球菌(M. elsdenii)的新菌株及其用途，包括 反芻動物的乳酸酸中毒的預防和治療。PCT申請W02005000035涉及改善瘤胃發酵的方法，特別是降低甲烷產生，其包括
給予獲自新鮮苜蓿的可溶性苜蓿提取物。EP1323354描述了一種基於植物材料的天然飼料添加劑。已知將作物和食品加工工業的副產物飼餵給家畜。例如，柑橘副產物飼料可以用 作反芻動物飼料系統的成分。它們含有各種用於瘤胃微生物的能量物質(Bampidis等， Animal Feed Science andTechnology (動物飼料科學技術)，Elsevier，vol. 128，2006， 175-217)。JP-52 028922描述了其中含有苦味桔皮的藥物。將該藥物飼餵給馬、牛或家禽。本申請的發明人已經發現了檸檬類黃酮(尤其是柚皮苷)、苦味的柑桔提取物和 海泡石的混合物能夠調節得自給予濃縮定量配給的微生物發酵過程、提高微生物發酵過程 的效率和限制某些直接涉及瘤胃酸中毒過程的物種，尤其是牛鏈球菌。因此，本發明涉及包含柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的混合物在改善反芻 動物中瘤胃發酵的用途。在本申請中，「反芻動物」包括牛、綿羊、山羊和駱駝(camelide)物種。該混合物相對於現有技術的狀況呈現出一系列優勢，使其在反芻動物營養領域中 具有高價值。該優勢是混合物中的所有成分是天然來源的產物，並且容易獲得。另一方面， 混合物易於操作並且可以根據本領域專家已知的工業配製方法來製備。該混合物還具有限 制涉及瘤胃酸中毒出現的某些物種(尤其是牛鏈球菌)生長的附加優勢。因此，特別地，本 發明涉及所述混合物用於改善反芻動物發酵的用途，該反芻動物發酵受到瘤胃中天然細菌 叢不平衡的損害。本發明還涉及所述混合物用於防止瘤胃發酵損害的用途，這種瘤胃發酵損傷可能是由於瘤胃中天然細菌叢不平衡所引起的。特別的目的是使用本發明的混合物 來限制引起瘤胃酸中毒的細菌的生長，如乳桿菌屬(Lactobacillusspp)，例如嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus),以及尤其是牛鏈球菌。將混合物以100至300ppm濃度(100至300g/噸)的固體形式加入飼料中時是有 活性的。這是基於體外研究，其中在100至300ppm的劑量範圍下分析了天然混合物的作用。根據一個方面，本發明混合物中的柚皮苷含量為10%至25%重量，優選15%至 25%重量，更優選約20%重量。根據第二個方面，本發明混合物中的苦味柑桔提取物含量為10%至65%重量，優 選20%至60%重量，更優選約40%重量。注意到苦味的柑桔提取物包括柚皮苷，因此本發 明混合物中的柚皮苷總含量將高於以上所示的含量。根據第三個方面，柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的含量為混合物重量的 100%。在第一個實施方案中，本發明涉及包含10%至25%重量柚皮苷、10%至65%重量 苦味柑桔提取物和補足量至100% (混合物的補足)重量海泡石的混合物在改善反芻動物 中瘤胃發酵的用途。在源自以上的實施方案中，混合物包含15%至25%重量柚皮苷、20%至60%重量 的苦味柑桔提取物和補足量至100%的海泡石，更特別地為，20%重量的柚皮苷、40%重量 的苦味柑桔提取物和40%重量的海泡石。以上所示的比例(％重量)是相對於混合物的總重。在另一個實施方案中，使用以上混合物調節由給予濃縮食品定量產生的微生物發 酵過程。在另一個實施方案中，使用以上混合物限制引起瘤胃酸中毒的細菌(尤其是牛鏈 球菌)的生長。因此，本發明還涉及以上的混合物用於防止或治療瘤胃酸中毒的用途，包括 在此所述的急性和亞急性形式。在另一個實施方案中，使用以上混合物優化反芻動物(尤其是牛)集約肥育中的 生產力。在另一個實施方案中，以上混合物的使用包括將其以重量計的10至2000ppm濃度 的固體形式加入飼料中，尤其是50至lOOOppm，更優選100至300ppm。類黃酮是一類水溶性的植物色素，對其的醫學關注正在增長中。柚皮苷是一種獲 自柑桔類水果(葡萄柚(Citrus paradisi)和苦橙(Citrus aurantium)皮並在很大程度 上引起其苦味的類黃酮，特別是一種糖基化的黃烷酮。在果漿以及植物的葉、花和種子中也 發現了該物質。一些研究表明和其他類黃酮相同，柚皮苷的生物合成受到環境和遺傳因素的影 響，這些因素決定了這些化合物濃度水平的不同，估算15至18g/kg新鮮葡萄柚皮為常見的 濃度值。皮中的含量也是不同的，未成熟的水果中高於成熟的水果。柚皮苷用於香料中以及給糖果、飲料和焙烤製品增加風味，柚皮苷還因為其抗氧 化和抗誘變特性而得到使用，並且作為油穩定劑。苦味的柑桔提取物可以通過本領域的常規操作(如提取、過濾、濃縮、沉澱、澄清 和最終的乾燥)獲自碾碎的柑桔類水果(尤其是苦橙)。可以在二元的鏈烷醇/水系統中進行提取處理，其中鏈烷醇選自甲醇、乙醇、丙醇等。優選使用甲醇。典型的苦味柑桔提取物 將包含31. 5至71. 5%重量的總類黃酮，例如45至55%重量(如果通過HPLC測定)。特別 地，類黃酮包括柚皮苷、新桔皮苷和枸桔苷。通常，總類黃酮含量將包括(a)17.5至35. 重量的柚皮苷，例如，25至27%重量，(b)7. 7至16. 9%重量的新桔皮苷，例如，11至13%重 量和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷，例如，3至5%重量。隨後，海泡石是天然的含水矽酸鎂，其來源歸功於海洋化石的石灰質沉積。其是白 色或淡黃色的粘土礦物。從遠古時代開始就將其用作粉末狀牙膏。將本發明的組合物應用於遭受瘤胃發酵下降或處於遭受瘤胃發酵下降風險中的 反芻動物。特別地，這些反芻動物包括1)飼餵高濃度(穀物)膳食的反芻動物，例如，用於改善飼料轉化率和避免酮症過 程的出現，尤其是如果反芻動物為a)在加強體系下肥育的動物；b)當濃縮物供給達到最高比例時，處於泌乳高峰期的高泌乳產量的雌性；或c)帶有超過一隻小羊的沉重懷孕的母羊或山羊，其攝入能力已經受到限制。2)接受突然的膳食變化的反芻動物，尤其是該變化為a)從牧場(高_粗糧)改變至高濃縮定量；或b)從可消化性低的澱粉(高粱或玉米)改變至消耗性高的(小麥或大麥)。為了說明的目的，提供以下的實施例為更好地理解本發明。實施例1 :100和300ppm劑量的混合物在牛中的效果基 於 Theodorou M K 等，Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p. 185-197，1994年8月提出的實驗方案，分析了發酵動力學。所用的接種物是來自商業強 化育肥操作的牛的瘤胃液體。將本發明的混合物(20 %重量柚皮苷、40 %重量苦味柑桔提取 物和40%重量海泡石)接種接種物和以常用比例(80 20濃縮物秸稈)補充穀物秸稈 的商業牛飼料(600mg)。在含有800ml接種物稀釋物的密封瓶子中以兩批(2頭牛)重複三 份培養該混合物劑量。測試持續48小時，在2、4、6、12、24、36和48h時記錄瓶內的壓力。從壓力值建立 氣體的產生。在培養10小時後，將一個瓶子分開，並將其內含物取樣，用於測定VFA和DNA 分離，用於分子遺傳測試。通過QIAamp DNAStool Mini 試劑盒(Qiagen Ltd，Carwley，West Sussex,UK)
進行DNA提取。通過分光光度計(NanoDrop )測定dna濃度和純度(總dna)，在260和 280nm處測量吸光度。通過實時PCR使用ABI PRISM 7000序列檢測系統將細菌和牛鏈球菌DNA定量， Ir (Maeda H^, FEMS Immunology andMedicalMicrobiology, 39 (1), p. 81-86, 2003
年 10 月)和牛鏈球菌(TajimaK 等，Applied and Environmental Microbiology, 67 (6), p. 2766-2774,2001年6月)使用了特定的引物。作為用於計算培養基中總細菌濃度的參 考，我們使用了通過瘤胃液體的差速離心(500g，10分鐘，接著20.000g，20分鐘)獲得的 細菌樣品的DNA濃縮物。使用Livak K J等，Methods (聖地牙哥，加利福尼亞)，25 (4)， p. 402-408,2001年12月所述的Δ Δ Ct表達，相對於總細菌的來表示牛鏈球菌的豐度。通過DGGE 使用特定的引物(NUbel U 等，Journal ofBacteriology, 178(19),p. 5636-5643，1996年10月)進行了細菌生物多樣性。電泳使用了 8%丙烯醯胺凝膠，其具 有50% -65%變性脲/甲醯胺梯度，在80V下持續16小時。使用Amersham Biosciences (瑞 典)試劑盒將凝膠染色，並且在掃描後，使用UPGMA (UnweightedPair-Group Method Arithmetic averages)程序分析條帶模式。根據2X2(混合物X劑量)因子設計分析混合物對瘤胃發酵的效果，考慮了將動 物認為是實驗模塊。MM1.-氣體產牛在之前所述的體外條件下，培養基中包含混合物對VFA產生或總VFA產生的動力 學沒有效果。實驗處理也沒有影響最重要的VFA的摩爾比例，其顯示出60%醋酸、29%丙酸 和9%丁酸的平均比例。2.-通過PCR的實時細菌定量表1顯示了通過分光光度測定(260nm)獲得的總DNA濃度，並且我們可以看到培 養基中的DNA濃度是怎樣沒有受到包含混合物改變的。然而，通過更特異性的程序(實時 PCR)的細菌DNA量的測定表明混合物的包含使得細菌DNA明顯增加，表明細菌生長增加。 由於混合物的存在引起的微生物生長的明顯差異的存在(在氣體(C02+NH3)產生或更高的 VFA釋放中沒有發現所述差異)表明混合物對微生物合成效率具有積極作用。同一表格還顯示了牛鏈球菌的特定DNA序列拷貝的濃度，已經鑑定該細菌為乳酸 的主要生產者之一，並因此涉及由瘤胃酸中毒引起的狀況。加入混合物使得培養基中該 物種濃度得到非常明顯的限制，所述濃度表示為相對於細菌DNA拷貝總數的對應於牛鏈 球菌(2(ACt)*1000)的DNA拷貝的數量或相對於對照培養基的拷貝數量的百分比減少 (2(Δ ACt))。表1 通過實時PCR計算的培養基中的不同DNA類型的濃度；作為細菌生物多樣性指標的培養基中的DNA 16S拷貝數量 當我們分析混合物的劑量對以上參數的作用時，我們發現使用該濃度的混合物沒 有顯著的差異。因此，所獲得的結果表明100和300ppm的初始濃度超過了所述化合物對瘤 胃發酵過程的活性極限。另一方面，儘管研究混合物改變了牛鏈球菌的濃度，但其沒有改變 群體的生物多樣性。這證實了所述物質對某些微生物群的選擇性作用。3. ~結論和優點
給研究混合物補充來自在商業強化育肥條件下給予的濃縮食物定量的接種物使 得瘤胃發酵過程產生了顯著變化。混合物的存在沒有改變氣體或VFA產生水平。然而，其對接種物中的不同微生物 群具有顯著的作用。儘管促進了種群合成水平的顯著提高，但其顯著抑制了牛鏈球菌生長。
權利要求
包含10％至25％重量的柚皮苷、10％至65％重量的苦味柑桔提取物和補足量至100％重量的海泡石的混合物在改善反芻動物瘤胃發酵中的用途。
2.權利要求1的用途，其中混合物包含15%至25%重量的柚皮苷、20%至60%重量的 苦味柑桔提取物和補足量至100%的海泡石。
3.權利要求2的用途，其中混合物包含20%重量的柚皮苷、40%重量的苦味柑桔提取 物和40%重量的海泡石。
4.權利要求1至3任一項的用途，其中苦味柑桔提取物包含31.5%至71. 5%重量的總 類黃酮。
5.權利要求1至3任一項的用途，其中苦味柑桔提取物包含44至55%重量的總類黃酮。
6.權利要求4或5的用途，其中總類黃酮包含(a)17. 5至35. 重量的柚皮苷，(b) 7. 7 至16. 9%重量的新桔皮苷和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷。
7.權利要求4或5的用途，其中總類黃酮包含(a)25至27%重量的柚皮苷，(b)ll至 13%重量的新桔皮苷和(c) 3至5%重量的枸桔苷。
8.權利要求1至7任一項的用途，其中所述改善調節了給予濃縮食物定量的反芻動物 中的微生物發酵過程。
9.權利要求1至7任一項的用途，其中所述改善包括限制引起瘤胃酸中毒的細菌的生長。
10.權利要求9的用途，其中引起瘤胃酸中毒的細菌是牛鏈球菌(Streptococcus bovis)ο
11.權利要求1至7任一項的用途，其中所述改善優化了反芻動物在強化育肥中的生產力。
12.權利要求11的用途，其中反芻動物是牛。
13.權利要求1至8任一項的用途，其包括以10至2000ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
14.權利要求1至8任一項的用途，其包括以50至IOOOppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
15.權利要求1至8任一項的用途，其包括以100至300ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
全文摘要
本發明涉及柚皮苷、苦味柑桔提取物和海泡石的混合物用於改善反芻動物瘤胃發酵的用途。
文檔編號A61K31/35GK101909616SQ200980102006
公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月8日 優先權日2008年1月9日
發明者F·J·克雷斯波, F·埃雷迪亞, J·巴爾塞爾斯, M·D·M·塞拉 申請人:艾克斯奎姆股份有限公司