一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝的製作方法
2023-06-02 06:50:51 1
一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝的製作方法
【專利摘要】一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其步驟如下：（1）從茯磚茶中篩選金花菌菌種；（2）製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌,培養；（3）製備金花菌孢子接種液；（4）製備金花菌生長營養液；（5）將幹茶渣粉碎製成培養基質；（6）將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內；（7）完成營養生長，促進閉囊殼產生；（8）發酵，乾燥；（9）基質乾燥，篩分兩次，獲得純度較高的金花。本發明發酵步驟一次性完成，成本較為低廉，同時減少了雜菌的汙染，解決了發酵過程中培養基質受雜菌如青黴、黑麴黴等汙染較為嚴重的問題。
【專利說明】一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及菌種培養【技術領域】，具體涉及一種利用茶渣循環製備金花工藝。
【背景技術】
[0002]金花菌學名為冠突散囊菌crisiar應)，主要存在於黑茶中的獲磚茶內，是我國制茶行業唯一二級機密保護菌種，其在茶葉上生長產生的閉囊殼堆積成肉眼可見的金黃色顆粒狀，俗稱金花，金花的多少歷來是評價茯磚茶品質好壞的重要指標。近年來大量研究資料表明「金花」對高血壓、高血脂、糖尿病等疾病具備良好的保健效果，並有提高機體免疫力的作用。
[0003]隨著金花保健功效的發掘，對其產品的開發成為了時下研究的熱點，這就需要大量的金花作為提取材料。金花菌生長條件較為苛刻，往往只在發酵良好的茯磚茶內部有少量存在，因此從茯磚茶中大量收集金花的方案是不現實的，而利用散茶或其他植物原料培養金花成本亦較高。本發明是為了實現金花產品的開發利用而研製的一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝。
[0004]中國專利(申請號:201210470477.7)提供了 「一種茯磚茶金花菌孢子粉的製備方法」，該專利不足之處在於:
(1)使用250mL/500mL錐形瓶作為培養容器、麩皮平鋪厚度為1.0~1.3cm，一次培養獲得的曲種較少；
(2)首先需發酵培養獲得曲種，再以發酵完成的曲種擴大培養，所有操作均需在無菌條件下進行，發酵容器外需包裹8層紗布，且(T36h時還需加蓋透氣封口膜，其操作較為繁瑣，不適宜大批量生產；`
(3)所用培養基質不可重複利用，原料的消耗量較大。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是:解決現有金花生產工藝原材料消耗大，成本高的問題，而提供一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝，實現了對發酵原料的重複利用，並且生產周期較短，能為金花研究與產品開發提供大量的原料。
[0006]本發明採用的技術方案是:一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其步驟如下:
Cl)從茯磚茶中篩選金花菌菌種；
(2)製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養6d；
(3)將發酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，得到金花菌孢子接種液；
(4)製備金花菌生長營養液；
(5)將幹茶渣粉碎(或是之前製備金花工藝中回收的茶渣)，加入30%左右營養液充分混勻，即為培養基質，將基質平鋪在不鏽鋼方盤發酵容器內，調節厚度為2.5cm左右，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h後重複烘Ih ；
(6)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內，均勻噴灑到冷卻的培養基質表面，Ikg基質用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ；
(7)將容器取出置於28°C環境下持續發酵3d，待白色菌絲遍布基質表面並開始轉黃時，即完成營養生長，此時提高室溫為3(T32°C並加強室內空氣流通，以促進閉囊殼產生；
(8)發酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發酵底物，控溫為38~42°C乾燥；
(9)待基質充分乾燥後，100目電動篩重複篩分兩次，獲得純度較高的金花，並收集茶渣以備下次重複利用。
[0007]所述的步驟(1)中金花菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經廣東微生物研究所鑑定為冠突散囊菌；
所述的步驟(2)中改良PDA發酵液，其特徵在於，每升培養基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖並攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌；
所述的步驟(2)和步驟(3)金花 菌孢子接種液，其具體製備方法為，待改良PDA發酵液滅菌冷卻後，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養6d至產生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上ISOrpm振蕩20min使孢子與菌絲分離，雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；
所述的步驟(3)金花菌孢子接種液，通過塗布平板法測定孢子含量> 108個/mL ；
所述的步驟(4)金花菌生長營養液能提供金花菌生長所需的氮源、碳源等生長素，其中含馬鈴薯30%、蔗糖20%、NaCl 5%，具體製備方法為:將去皮切碎的馬鈴薯300g置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl並攪拌溶解，定容至10OOmT,；
所述的步驟(5)發酵容器為不鏽鋼方盤(500cmX350cmX4.5cm)，容器蓋為面積略大於方盤的玻璃，以便於在發酵過程中觀察，玻璃蓋上後應無明顯空隙。使用時將培養基質放在方盤內攤平，厚度不超過3.5cm,每盤約可容納基質500g ;該容器蓋上玻璃後為半封閉狀態，可有效控制培養基質內的水分緩慢散發，培養基質前期溼度較大利於菌絲生長，後期溼度降低則可促使耐乾燥的閉囊殼產生。玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利於空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界黴菌孢子也不易透過縫隙對基質造成汙染，正確操作下每盤培養基質雜菌汙染面積< 2cm2。
[0008]所述的步驟(6)中67°C預烘Ih是金花菌發酵前的關鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所汙染的雜菌，並且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環境要求較低，無需使用無菌操作間等設施。
[0009]所述的步驟(7)中菌絲開始轉黃並產生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產生；
所述的步驟(8)中發酵6d時基質應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，乾燥過程中溫度不應超過42°C，此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產生；
所述的步驟(9)中產品金花為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮溼處易結塊且顏色加深，置於密封清潔容器乾燥處保存；所述的步驟(9)中回收的培養基質中營養物質已基本耗盡，但物理特性基本穩定，較為適宜金花菌菌絲生長，通過加入營養液便可作為發酵底物重複利用。
[0010]本發明和現有的專利與文獻相比，具備以下顯著優點:
(1)由孢子懸液直接接種至培養基質，發酵步驟一次性完成；
(2)所用茶渣可以是通過浸提之後的茶葉洛，也可以是茶葉加工中的邊角料，成本較為低廉，通過粉碎進一步提高了金花菌的生長面積，且乾燥後金花與茶渣較易分離；
(3)通過加入適宜金花菌生長的營養液，解決了一次發酵後茶渣中營養成分耗盡的問題，實現了對發酵基質的循環利用；
(4)利用改良發酵容器，半封閉式發酵滿足了金花菌生長所需的氧氣與一定溼度，同時減少了雜菌的汙染；
(5)通過發酵容器改良與接種後預烘工藝，殺死了雜菌而保留金花菌孢子活力，解決了發酵過程中培養基質受雜菌如青黴、黑麴黴等汙染較為嚴重的問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為金花囷接種液照片；
圖2為發酵過程中的茶渣照片；
圖3為茶渣培育金花6d照片；
圖4為二次過篩的金花照片；
圖5為本發明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0012]步驟1.金花菌的分離純化:金花菌來源為湖南省益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶。具體分離純化步驟為:用鑷子取茯磚茶磚心處長有金花的茶葉10g，加入到裝有90mL無菌水的三角瓶內，蓋上無菌封口膜，置搖床上180rpm振搖20min，製成10_2倍樣品稀釋液，梯度稀釋至10-6，取ImL稀釋液塗布於CZG平板上，28°C培養5~6d，用接種針挑取長勢較好的金花菌菌落進行劃線分離，重複劃線2~3次後獲得純培養金花菌菌株。
[0013]步驟2.金花菌孢子接種液的製作:馬鈴薯200g洗淨去皮，加1000mL水煮沸15min後過濾，濾液加入50g蔗糖，攪拌至溶解後，分裝三角瓶滅菌。在超淨工作檯下用接種環挑取斜面保存的金花菌菌體，接種至發酵液中，28°C培養6d。
[0014]步驟3.將上述發酵液瓶SOrpm振搖20min，雙層無菌紗布過濾即為金花菌孢子接種液。
[0015]金花菌孢子接種液見附圖1。
[0016]步驟4.製備金花菌生長營養液:將馬鈴薯去皮洗淨，取300g切碎放入燒杯中，加1000mL水，煮沸後維持20min左右，用雙層紗布過濾去除馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl，攪拌至溶解，即為金花菌生長營養液`。
[0017]步驟5.培養基質製備:將幹茶渣置於植物粉碎機內粉碎並挑去雜質，選取Ikg茶葉渣放在盤內，加入300mL營養液並攪拌均勻，製成金花培養基質。
[0018]溼熱滅菌:將培養基質平鋪在不鏽鋼方盤內，調節厚度為2.5cm左右，最厚處不超過3.5cm。蓋上一塊略大於方盤的玻璃蓋並確認無明顯縫隙，置烘箱內100°C烘lh，冷卻24h後重複烘lh，取出冷卻；
步驟6:接種與預烘:將金花菌接種液裝入已消毒的噴壺內，揭起玻璃蓋，將懸液均勻噴灑到培養基質上，保證基質表面被接種液完全覆蓋即可。蓋上玻璃蓋，將方盤置烘箱67°C烘Ih。
[0019]金花菌發酵中的茶渣見附圖2。
[0020]步驟7:金花菌發酵:將方盤取出置於28°C環境下發酵3d，待白色的營養菌絲長滿基質表明並開始轉黃時，將室溫升高至3(T32°C，並每日打開門窗透氣半小時，以促進金花
大量產生。
[0021]發酵6d的基質見附圖3。
[0022]步驟8:乾燥與金花收集:發酵6d左右，此時金花布滿了培養基質，將玻璃蓋揭去，拌勻基質，提高室溫為38°C~42°C，48h左右即可充分乾燥。
步驟9:將上述乾燥的基質置於100目電動振搖篩中振搖3min，便可將大部分金花篩下，再次過100目篩即獲得純度較高的金花，用自封袋將金花包裝好放置在陰涼乾燥處儲存，茶渣收集以重複利用。
[0023]二次過篩的金花見 附圖4。
【權利要求】
1.一種茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，其步驟如下: (1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種； (2)製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養6d； (3)將發酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，得到金花菌孢子接種液； (4)製備金花菌生長營養液； (5)將幹茶渣粉碎(或是之前製備金花工藝中回收的茶渣)，加入30%左右營養液充分混勻，即為培養基質，將基質平鋪在不鏽鋼方盤發酵容器內，調節厚度為2.5cm左右，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h後重複烘Ih ； (6)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內，均勻噴灑到冷卻的培養基質表面，Ikg基質用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ； (7)將容器取出置於28°C環境下持續發酵3d，待白色菌絲遍布基質表面並開始轉黃時，即完成營養生長，此時提高室溫為30~32°C並加強室內空氣流通，以促進閉囊殼產生； (8)發酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發酵底物，控溫為38~42°C乾燥； (9)待基質充分乾燥後，100目電動篩重複篩分兩次，獲得純度較高的金花，並收集茶渣以備下次重複利用。
2.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(I)中金花菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經廣東微生物研究所鑑定為冠突散囊菌。
3.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(2)中改良PDA發酵液，其特徵在於，每升培養基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖並攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
4.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(2)和步驟(3)金花菌孢子接種液，其具體製備方法為，待改良PDA發酵液滅菌冷卻後，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養6d至產生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上180rpm振蕩20min使孢子與菌絲分離,雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的步驟(3)金花菌孢子接種液，通過塗布平板法測定孢子含量> IO8個/mL。
5.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(4)金花菌生長營養液能提供金花菌生長所需的氮源、碳源等生長素，其中含馬鈴薯30%、蔗糖20%、NaCl 5%，具體製備方法為:將去皮切碎的馬鈴薯300g置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入200g蔗糖、50gNaCl並攪拌溶解，定容至1000mL。
6.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(5)發酵容器為不鏽鋼方盤(500cmX350cmX4.5cm)，容器蓋為面積略大於方盤的玻璃，以便於在發酵過程中觀察，玻璃蓋上後應無明顯空隙；使用時將培養基質放在方盤內攤平，厚度不超過3.5cm,每盤約可容納基質500g ;該容器蓋上玻璃後為半封閉狀態,可有效控制培養基質內的水分緩慢散發，培養基質前期溼度較大利於菌絲生長，後期溼度降低則可促使耐乾燥的閉囊殼產生；玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利於空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界黴菌孢子也不易透過縫隙對基質造成汙染，正確操作下每盤培養基質雜菌汙染面積< 2cm2。
7.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(6)中67°C預烘Ih是金花菌發酵前的關鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所汙染的雜菌，並且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環境要求較低，無需使用無菌操作間等設施。
8.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(7)中菌絲開始轉黃並產生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產生。
9.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(8)中發酵6d時基質應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，乾燥過程中溫度不應超過42V,此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產生。
10.根據權利要求1所述的茶渣添加營養液循環製備金花工藝，其特徵在於，所述的步驟(9)中產品金花為金黃色粉末狀， 輕嗅有菌花香，在潮溼處易結塊且顏色加深，置於密封清潔容器乾燥處保存；所述的步驟9中回收的培養基質中營養物質已基本耗盡，但物理特性基本穩定，較為適宜金花菌菌絲生長，通過加入營養液便可作為發酵底物重複利用。
【文檔編號】C12R1/645GK103865811SQ201410114978
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】趙運林, 胡治遠, 劉石泉, 龍立平, 彭雨軒 申請人:湖南城市學院