一種來源於瘤胃的中性植酸酶cp53及其基因和應用的製作方法

2023-06-02 07:38:46 1

專利名稱：一種來源於瘤胃的中性植酸酶cp53及其基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種來源於瘤胃的中性植酸酶 CP53及其基因和應用。
背景技術：
反芻動物比起單胃動物，能更加有效的利用飼料中的植酸磷，原因在於在動物的 瘤胃中可能存在一些能夠降解植酸的微生物。Yanke et al. (1998)胃中分離的許多厭養 細菌例如 Selenomonas ruminantium、Prevotella ruminicola、Megasphaera elsdenii、 Mitsuokella multiacidus、Mitsuokella jalaludinii 等中都檢測到了植酸酶活性，其中 S. ruminantium的植酸酶活性最高(Yanke et al. 1998，144 1565-1573)。不同於其他類植 酸酶，該植酸酶有一個自己的典型序列(保守的活性位點)HCXXGXXR[T/S]。在空間結構上分為兩個結構域大結構域和小結構域。大域主要由β片層和α 螺旋構成，類似三明治的結構。小域是由β片層構成的β摺疊桶結構。活性部位序列 HCXXGXXR[T/S]形成一個環狀結構(p-loop)，活性中性Cys位於p-loop中。活性中心處於 大小結構域之間，它的功能可能是作為與底物結合的口袋，這個口袋的深淺是決定底物特 異性的重要因素。該類植酸酶水解植酸酶的終產物和Aspergillusniger的HAP植酸酶相 似(ffyss et al. 1999，65 :367 373.)，都是2_單磷酸肌醇。，它的活性會受一些金屬離子 的抑制，如Cu2+、Zn2+和Hg2+。CP植酸酶是一類從瘤胃環境中分離的植酸酶，目前進行過性質測定的該類植酸酶 比較少，該類植酸酶的最適PH值一般在4. 0-5. O之間，未見中性植酸酶的報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種能高效應用的中性植酸酶。本發明的再一目的是提供編碼上述中性植酸酶的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明的另一目的是提供一種製備上述中性植酸酶的基因工程方法。本發明的另一目的是提供上述中性植酸酶的應用。本發明從瘤胃液中獲得一種新的中性植酸酶，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MKKSLALLFALALLLSSCSHQHYTYLRAAEERETVTAAQREEYAAFVWRERRDREALPDNFRICRNEFR QRSAVSGYDPEFVPSRKGLDELKVSASSDFSAGELDAAIAEIRKYHDGPITVVDLRKETHGLLNGNHVSRYGKQNWD NISLSREEIIASEKEIIHGTVGTQVETGSTRPGGRTSTMDVTTAQTEAELCASRGIGYFRLTVLDHCFSDPESIDAF IAFVRTLPENTWLHFHWQAGVGRANMYLIFYDFLRNPDVPEKDIVYRHFNQGGNFMYYQ⑶KPNEEEYKIPLAKEKA EMIPLVRQYIQEQQPKGFKLSffTQffKARRR其中，該酶基因編碼331個胺基酸，前21個胺基酸為信號肽序列。因此，成熟的中性植酸酶CP53的理論分子量為36. 2kDa。該植酸酶CP53在中性pH範圍內具有較高的活 性。本發明首次從瘤胃環境直接克隆的中性植酸酶，其最適pH值為6.5，在pH 2. 5-8.5之 間有較好的穩定性；最適溫度為50°C，熱穩定性相對較差，在50°C處理20min後，植酸酶活 基本上損失；比活為 58U/mg，Km = 0. 65mmol/L, Vmax = 107. 5 μ mol/mg/min。與以往所報 道的CP植酸酶相比，該CP植酸酶在中性條件下具有更高的催化活性，這是首次發現的中性 CP類植酸酶，該結果進一步加深了對CP植酸酶的認識。其信號肽序列為MKKSLALLFALALLLSSCSHQ(SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的中性植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示HYTYLRAAEE RETVTAAQRE EYAAFVWRFE RRDREALPDN FRICRNEFRQRSAVSGYDPE60FVPSRKGLDE LKVSASSDFS AGELDAAIAE IRKYHDGPIT WDLRKETHGLLNGNHVSRY120GKQNWDNISL SREEIIASEK EIIHGTVGTQ VETGSTRPGG RTSI1DVTTAQTEAELCASR180GIGYFRLTVL DHCFSDPESI DAFIAFVRTL PENTWLHFHW QAGVGRANMYLIFYDFLRNP240DVPEKDIVYR HFNQGGNFMY YQGDKPNEEE YKIPLAKEKA EMIPLVRQYIQEQQPKGFKL300SffTQffKARRR本發明提供了編碼上述中性植酸酶的基因cp53。具體地，該基因的基因組序列如 SEQ ID NO. 4 所示ATGAAMAGAGTCTTGCCTTGCTGTTCGCGCTGGCGTTGCTGCTCTCCTCCTGCAGCCACCAGCACTACACC TACCTCCGGGCGGCCGMGAGCGGGAMCCGTGACGGCCGCGCAGCGGGMGMTACGCCGCCTTCGTCTGGCGCTTCGA GCGCCGCGACCGGGMGCCCTGCCCGACAATTTCCGGATCTGCCGGMCGAGTTCAGGCAGCGGAGCGCCGTGCCGGGCT ACGACCCGGMTTCGTGCCCTCCCGCMGGGCCTGGATGAGCTGMGGTCAGCGCGAGCTCGGACTTCAGCGCCGGGGAG CTGGACGCCGCGATCGCGGMATCCGMMTACCATGACGGCCCGATCACGGTCGTGGACCTGCGGAMGAGACCCACGG CCTGCTGMCGGCMCCACGTGTCCCGCTACGGCMGCAGMCTGGGACMCATCGGCCTGAGCCGGGMGAGATTATCG CATCCGAAMGGAMTCATCCACGGCACGGTGGGAACGCAGGTGGAGACGGGMGCACCCGCCCCGGCGGACGCACCAGC ACGATGGACGTGACGACGGCCCAGACGGMGCCGMCTCTGCGCGAGCCGCGGCATCGGCTATTTCCGCCTGACGGTCCT CGACCACTGCTTCTCCGATCCCGAMGCATCGACGCGTTCATCGCCTTCGTGCGGACGCTCCCGGAGMCACCTGGCTGC ACTTCCATTGCCAGGCGGGCATGGGCCGCACGAACATGTACCTGATCTTCTACGACTTCCTGCGCMCCCGGACGTTCCG GAAMGGATATCGTGTACCGCCACTTCMCCAGGGCGGCMCTTCATGTACTACCAGGGCGACMGCCCMCGAGGAGGA GTACMGATCCCCCTCGCCAAGGAGAMGCCGAMTGATCCCGCTGGTCCGCCAGTACATCCAGGAGCAGCAGCCCMGG GCTTCMGCTCAGCTGGACGCAGTGGMGGCCCGCCGGCGCTM本發明通過PCR的方法分離克隆了這一植酸酶基因cp53，DNA全序列分析結果表 明，植酸酶CP53結構基因cp53全長996bp。其中，信號肽的鹼基序列為ATGAAAAAGA GTCTTGCCTT GCTGTTCGCG CTGGCGTTGC TGCTCTCCTCCTGCAGCCAC CAG(SEQ ID NO. 6)。成熟的植酸酶CP53的基因序列如SEQ ID N0. 5所示。SEQ IDN0. 5cactacacct acctccgggc ggccgaagag cgggaaaccg tgacggccgc gcagcgggaa gaatacgccgccttcgtctg gcgcttcgag cgccgcgacc gggaagccct gcccgacaat ttccggatct gccggaacga gttcaggcagcggagcgccg tgccgggcta cgacccggaa ttcgtgccct cccgcaaggg cctggatgag ctgaaggtcagcgcgagctc ggacttcagc gccggggagc tggacgccgc gatcgcggaa
4atccgaaaat accatgacggcccgatcacg gtcgtggacc tgcggaaaga gacccacggc ctgctgaacg gcaaccacgt gtcccgctacggcaagcaga actgggacaa catcggcctg agccgggaag agattatcgc atccgaaaag gaaatcatccacggcacggt gggaacgcag gtggagacgg gaagcacccg ccccggcgga cgcaccagca cgatggacgtgacgacggcc cagacggaag ccgaactctg cgcgagccgc ggcatcggct atttccgcct gacggtcctcgaccactgct tctccgatcc cgaaagcatc gacgcgttca tcgccttcgt gcggacgctc ccggagaaca cctggctgcacttccattgc caggcgggca tgggccgcac gaacatgtac ctgatcttct acgacttcct gcgcaacccg gacgttccggaaaaggatat cgtgtaccgc cacttcaacc agggcggcaa cttcatgtac taccagggcg acaagcccaacgaggaggag tacaagatcc ccctcgccaa ggagaaagcc gaaatgatcc cgctggtccg ccagtacatccaggagcagc agcccaaggg cttcaagctc agctggacgc agtggaaggc ccgccggcgc taa 成熟蛋白理論分子量為36. 2kDa。將植酸酶基因cp53序列及推導出的胺基酸序列 在GenBank中進行BLAST比對。該基因與來源於Megasphaera elsdenii的假定的CP植酸 酶基因序列一致性最高，胺基酸序列一致性為42%，說明CP53是一種新的植酸酶。
本發明還提供了包含上述植酸酶基因的重組載體，優選為pET22b_cp53。將本發明 的植酸酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表 達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將植酸酶基因插入到質 粒pET22b(+)上的NcoI和XhoI限制性酶切位點之間，得到重組表達質粒pET22b_cp53。本發明還提供了包含上述植酸酶基因的重組菌株，其保藏編號為CGMCC No. 3493， 優選為重組菌株BL21cp53。本發明還提供了一種製備中性植酸酶的方法，包括以下步驟1)用權利要求重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組植酸酶的表達；以及3)回收並純化所表達的植酸酶。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21/cp53。本發明還提供了上述中性植酸酶的應用。本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、 適合於在飼料工業中應用新的植酸酶。本發明獲得了一種中性植酸酶CP53，最適pH6. 5，在 PH 2. 5-8. 5之間有較好的穩定性。這些性質符合動物消化生理特點，能夠提高飼料消化率 和代謝能，降低配方成本，減少環境汙染。本發明的植酸酶在中性條件下展現了較高的植酸 酶活性，屬於中性植酸酶。飼料中添加植酸酶，可有效分解存在於飼糧中的植酸，釋放無機 磷，提高飼料中植酸磷的利用率，降低糞便中磷的排放量，減少環境汙染。同時可以解除植 酸的抗營養作用。


圖1在大腸桿菌中表達的重組植酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白質 Marker ；1 含有植酸酶基因的大腸桿菌培養上清液濃縮液；2 純化的重組植酸酶。圖2重組植酸酶的最適pH。圖3重組植酸酶的pH穩定性。
圖4重組植酸酶的最適溫度。圖5重組植酸酶的熱穩定性。含本發明的植酸酶的重組菌株大腸埃希氏菌CP53 (Escherichia coli CP53)，其 保藏編號為CGMCC No. 3493，保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(北京市 朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，保藏日期2009年12月3曰。
具體實施例方式試驗材料和試劑1、載體大腸桿菌表達載體pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3)購自 於Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養基(I)LB 培養基(g/Ι)酵母粉 5.0，蛋白腖 10.0，NaCl 10. 0，ρΗ7· 0。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。實施例1瘤胃環境宏基因組的提取採用直接裂解法分別提取山羊和牛的瘤胃液微生物的宏基因組DNA。具體步驟如 下1、取50mL瘤胃液，用紗布過濾除去未消化的草根及大的顆粒，並用適量的滅菌磷酸鹽 緩衝液衝洗草根中吸附的部分微生物；2、上清轉移至多個新的50mL離心管中，加入兩倍體 積預熱的裂解緩衝液，70°C水浴2h，其間每隔IOmin輕輕晃動混勻一次；3、取出後冷卻至室 溫，5，OOOrpm離心lOmin，棄沉澱，重複離心一次；4、上清中加入0. 7倍體積的異丙醇，輕柔 混勻，冰上放置30min，10，OOOrpm離心30min，沉澱用70%的乙醇清洗一次真空乾燥lOmin， 溶於ImL ddH20中；5、取5_10 μ L此粗提的宏基因組DNA電泳檢測；粗提的宏基因組DNA用 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收分子量在20-40b的基因組DNA，進一步電泳檢測，備用。實施例2植酸酶編碼基因cp53的克隆根據CP 植酸酶基因的保守([V/M/I]-D-L-R-[Q/K/E]-E-[S/T]-H 和 W-L-H-F-H-C- [X] - [A/E] -G- [X] -G-R-T-T)序列設計合成了簡併引物 P1，P2Pl 5' -GTGGACCTRCGRSARGARWCICA-3『；P2 5' -GTCCGACCATTGCCTGCYTCRCARTGRAMRTGIADCCA-3')。以純化的瘤胃液宏基因組DNA為模板進行PCR擴增。降落PCR反應參數為94°C 變性5min ；94°C變性30sec，58_52°C退火30sec，72°C延伸lmin，10個循環(每個循環降落 I0C ),然後 94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 個循環，72°C保溫 IOmin。得 到一約400bp片段，將該片段回收後與PEASY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。根據測序得到的400bp的核苷酸序列，設計上遊和下遊各四條TAIL-PCR特異性引 物設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在spl的內側，sp3位於sp2的內 側，sp4位於sp3的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 650C 0並將它們分別命名為uspl,usp2, usp3, usp4(上遊特異性引物)， dspl，dsp2，dsp3，dsp4(下遊特異性引物)見表1。表1.植酸酶CP53 TAIL-PCR特異性引物 通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收後送三博生物 技術有限公司測序。通過四步Tail-PCR獲得該片段的上下遊側翼序列。拼接後CP53植酸 酶基因全長996bp，編碼331個胺基酸和一個終止密碼子。用SignalP (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)進行分析表明N端21個胺基酸為預測的信號肽。預測該基因 所編碼的成熟蛋白的理論分子量為36. 2kDa，等電點為6. 6。胺基酸序列在GenBank中進行 BLAST比對發現，該基因與來源於Megasphaera elsdenii的假定的CP植酸酶基因序列一致 性最高，胺基酸序列一致性為42%。其三維結構通過預測分析，具有典型的CP植酸酶的結 構，活性位點Cys位於催化中心的P-Ioop上。實施例3重組植酸酶的製備。將表達載體pET22b (+)進行雙酶切(NcoRI+XhoI)，同時將編碼植酸酶的基因cp53 雙酶切(NcoRI+XhoI)，切出編碼成熟植酸酶的基因片段與表達載體pET22b(+)連接，獲得 含有植酸酶基因cp53的重組質粒pET22b-cp53並轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸 桿菌菌株BL21 cp53。取含有重組質粒的BL21菌株，接種於3mL LB (100 μ g/mL的氨苄青黴素)培養液 中，37°C培養過夜。接菌於20mL LB (加有100 μ g/mL的氨苄青黴素)，37°C振蕩培養約 2 3h (OD600達到0. 6 0. 8)後加入終濃度0. 6mmol/L的誘導劑IPTG，20°C 180rpm震蕩 培養12h。12000rpm離心5min，收集培養基上清。經過IPTG在30°C誘導8h後，在誘導液的細胞破碎液中檢測到植酸酶活性，在pH 4. 5的條件下，檢測到的植酸酶的活性是0. 51U/mL。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組植酸 酶在大腸桿菌中得到了表達。所表達的植酸酶經過純化之後，其蛋白質的含量達到總蛋白
7的90%以上。實施例4重組植酸酶的活性分析植酸酶活性的測定採用藍鉬法(Huang et al. , 2006)將酶液用含有0. 05% BSA 和0.05% Triton X-100的0. 25mol/L的pH 5. 0的乙酸-乙酸鈉緩衝液稀釋，取50 μ L稀 釋的酶液加入950 μ L 1. 5mmol/L底物植酸鈉(用0. 25mol/L的pH 5. 0的乙酸-乙酸鈉緩 衝液配製)，37°C水浴中反應15min，加ImL 10% TCA終止反應，接著加2mL顯色液(IOg四 水合鉬酸銨，32mL濃硫酸，73. 2g硫酸亞鐵，加水定容至1L)，對反應液進行顯色。對照則加 酶液後先加TCA混勻，再加底物。顯色IOmin後，在700nm下測其OD值，最後計算酶活單位。實施例5重組植酸酶CP53的性質測定1、重組植酸酶CP53的最適pH和pH穩定性的測定方法如下將實施例4純化的重組植酸酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底 物植酸鈉用不同PH的緩衝液37°C下進行植酸酶活力測定。結果(圖2)表明，CP53的最適 PH為6.5，在pH 4.5到？!1 8. 0條件下，該酶具有較好的催化活性。植酸酶於上述各種不同 PH的緩衝液中37°C處理60min，再在pH6. 5緩衝液體系中37°C下測定酶活性，以研究酶的 PH耐性。結果(圖3)表明，該重組酶在整個酸性條件下具有極好的穩定性，在鹼性條件下 穩定性較差。2、植酸酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下植酸酶的最適溫度的測定為在pH6. 5緩衝液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐 溫性測定為植酸酶在不同溫度下處理不同時間，再在37°C下進行酶活性測定。酶反應最適 溫度測定結果(圖4)表明，其最適溫度為50°C。酶的熱穩定性性試驗表明(圖5)，在50°C 處理5min後，損失了近60%的相對活性，處理30min後，基本檢測不到植酸酶活性。3、植酸酶的Km值測定方法如下用不同濃度的植酸鈉(0. 125、0.25、0.5、l、2、4mM)為底物，在最適pH緩衝體 系中，37°C下測定酶活性，計算相應的反應速度，利用米氏方程雙倒數法求得Km值及 Vmax (Lineweaver-Burk法)。採用雙倒數做圖法，繪製重組植酸酶的動力學曲線，該植酸酶 的 Km = 0. 65mmol/L, Vmax = 107. 5 μ mol/mg/min。4、不同金屬離子化學試劑對CP53酶活的影響測定如下在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質終濃度為lmmol/L。在50°C、pH6. 5條件下測定酶活性。結果(表2)表明 不同離子或化學試劑處理後，重組植酸酶CP53的酶活的變化情況。從表中可以看出絕大多 數的離子對酶活性具有部分抑制作用，如Fe3+，Hg2+，Ag+對植酸酶的活性幾乎完全抑制， 另外，SDS也幾乎完全抑制其活性。表2.各種化學試劑對植酸酶CP53活力的影響
序列表
中國農業科學院飼料研究所
一種來源於瘤胃的中性植酸酶CP53及其基因和應用
6
1
331
PRT
牛、山羊(bowt、goat)
1
MKKSLALLFALALLLSSCSH QHYTYLRAAEERETVTAAQR EEYAAFVffRF
ERRDREALPD60
NFRICRNEFRQRSAVSGYDP EFVPSRKGLDELKVSASSDF SAGELDAAIA
EIRKYHDGPI120
TVVDLRKETHGLLNGNHVSR YGKQNWDNISLSREEIIASE KEIIHGTVGT
QVETGSTRPG180
GRTSTMDVTTAQTEAELCAS RGIGYFRLTVLDHCFSDPES IDAFIAFVRT
LPENTffLHFH240
WQAGVGRA匪YLIFYDFLRN PDVPEKDIVYRHFNQGGNFM YYQ⑶KPNEE
EYKIPLAKEK300
AEMIPLVRQYIQEQQPKGFK LS WTQffKARR R331
2
310
PRT
牛、山羊(bowt、goat)
2
HYTYLRAAEERETVTAAQRE EYAAFVffRFERRDREALPDN FRICRNEFRQ
RSAVSGYDPE60
FVPSRKGLDELKVSASSDFS AGELDAAIAEIRKYHDGPIT VVDLRKETHG0108]LLNGNHVSRY
0109]GKQNWDNISL SREEIIASEK EIIHGTVGTQ VETGSTRPGG RTSTMDVTTA
0110]QTEAELCASR
0111]GIGYFRLTVL DHCFSDPESI DAFIAFVRTL PENTffLHFHW QAGVGRANMY
0112]LIFYDFLRNP
0113]DVPEKDIVYR HFNQGGNFMY YQ⑶KPNEEE YKIPLAKEKA EMIPLVRQYI
0114]QEQQPKGFKL
0115]SffTQffKARRR
0116]3
0117]21
0118]PRT
0119] 牛、山羊(bowt、goat)
0120]3
0121]MKKSLALLFA LALLLSSCSH Q
0122]4
0123]996
0124]DNA
0125] 牛、山羊(bowt、goat)
0126]4
0127]atgaaaaaga
0128]cagcactaca
0129]gaagaatacg
0130]aatttccgga
0131]gaattcgtgc
0132]agcgccgggg
0133]acggtcgtgg
0134]tacggcaagc
0135]aaggaaatca
0136]ggacgcacca
0137]cgcggcatcg
0138]atcgacgcgt
0139]tgccaggcgg
0140]ccggacgttc
0141]tactaccagg
0142]gccgaaatga
0143]ctcagctgga
0144]5
0145]955
0146]DNA
120
180
240
300 310
21
gtcttgccttgctgttcgcgCtggCgttgCtgctctcctcctgcagccac60cctacctccgggcggccgaagagcgggaaaccgtgacggccgcgcagcgg120ccgccttcgtctggcgcttcgagcgccgcgaccgggaagccctgcccgac180tctgccggaacgagttcaggcagcggagcgCCgtgCCgggctacgacccg240cctcccgcaagggcctggatgagctgaaggtcagcgcgagctcggacttc300agctggacgccgcgatcgcg aataccatgacggcccgatc360acctgcggaaagagacccacggcctgctgaacggcaaccacgtgtcccgc420agaactgggacaacatcggcctgagccgggaagagattatcgcatccgaa480tccacggcacggtgggaacgcaggtggagacgggaagcacCCgCCCCggC540gcacgatggacgtgacgacggcccagacggaagccgaactctgcgcgagc600gctatttccgcctgacggtcctcgaccactgcttctccgatcccgaaagc660tcatcgccttcgtgcggacgctcccggagaacacctggctgcacttccat720gcatgggccgcacgaacatgtacctgatcttctacgacttcctgcgcaac780cggaaaaggatatcgtgtaccgccacttcaaccagggcggcaacttcatg840gcgacaagcccaacgaggaggagtacaagatccccctcgccaaggagaaa900tcccgctggtccgccagtacatccaggagcagcagcccaagggcttcaag960cgcagtggaaggcccgccggcgctaa9960147]〈213〉牛、山羊(bowt、goat)0148]〈400>50149]cactacacctacctccgggcggccgaagag0150]gaatacgccgccttcgtctggcgcttcgag0151]ttccggatctgccggaacgagttcaggcag0152]ttcgtgccctcccgcaagggcctggatgag0153]gccggggagctggacgccgcgatcgcggaa0154]gtcgtggacctgcggaaagagacccacggc0155]ggcaagcagaactgggacaacatcggcctg0156]gaaatcatccacggcacggtgggaacgcag0157]cgcaccagcacgatggacgtgacgacggcc0158]ggcatcggctatttccgcctgacggtcctc0159]gacgcgttcatcgccttcgtgcggacgctc0160]caggcgggcatgggccgcacgaacatgtac0161]gacgttccggaaaaggatatcgtgtaccgc0162]taccagggcgacaagcccaacgaggaggag0163]gaaatgatcccgctggtccgccagtacatc0164]agctggacgcagtggaaggcCCgCCggCgC0165]60166]630167]DNA0168]〈213〉牛、山羊(bowt、goat)0169]〈400>50170]atgaaaaaga gtcttgccttgctgttcgcg0171]cag
cgggaaaccgtgacggccgcgcagcgggaa60cgccgcgaccgggaagccctgcccgacaat120cggagcgccgtgccgggctacgacccggaa180ctgaaggtcagcgcgagctcggacttcagc240atccgaaaataccatgacggcccgatcacg300ctgctgaacggcaaccacgtgtcccgctac360agccgggaagagattatcgcatccgaaaag420gtggagacgggaagcacccgccccggcgga480cagacggaagccgaactctgcgcgagccgc540gaccactgcttctccgatcccgaaagcatc600ccggagaacacctggctgcacttccattgc660ctgatcttctacgacttcctgcgcaacccg720cacttcaaccagggcggcaacttcatgtac780tacaagatccccctcgccaaggagaaagcc840caggagcagcagcccaagggcttcaagctc900taa933ctggcgttgctgctctcctcctgcagccac60
1權利要求
一種來源於瘤胃的中性植酸酶CP53，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.如權利要求1所述的中性植酸酶CP53，其特徵在於，序列SEQID NO. 1在N端包含 信號肽，所述信號肽的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一種中性植酸酶基因cp53，其特徵在於，編碼權利要求1所述的中性植酸酶CP53。
4.如權利要求3所述的中性植酸酶基因cp53，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.如權利要求3所述的中性植酸酶基因cp53，其特徵在於，所述中性植酸酶基因cp53 包括信號肽序列，所述序列如SEQ ID NO. 6所示。
6.包含權利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重組載體。
7.包含權利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重組載體pET22b-cp53。
8.包含權利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重組菌株，其保藏編號為 CGMCCNo. 3493。
9.一種製備中性植酸酶CP53，其特徵在於，包括以下步驟1)用權利要求6的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組植酸酶表達；3)回收並純化所表達的中性植酸酶CP53。
10.權利要求1所述中性植酸酶CP53的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種來源於瘤胃的中性植酸酶CP53及其基因和應用。本發明提供了一種來源於瘤胃宏基因組DNA的植酸酶CP53，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發明提供了編碼上述植酸酶的基因組編碼基因cp53。本發明的植酸酶具有以下性質最適pH 6.5，最適溫度50℃，在pH 2.5-8.5之間有較好的穩定性，在中性pH條件下具有高的催化活性。做為一種新型的酶製劑，可廣泛用於反芻動物和水產飼料工業等。
文檔編號C12N9/16GK101914507SQ20091024237
公開日2010年12月15日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者史秀雲, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農業科學院飼料研究所