一種艾塞那肽固相合成方法

2023-06-28 18:25:46

專利名稱：一種艾塞那肽固相合成方法
技術領域：
本發明涉及多肽藥 物合成技術領域，具體涉及一種艾塞那肽固相合成方法。
背景技術：
糖尿病(diabetes mellitus)是由於胰島素絕對或相對不足引起的以高血糖和多併發症並存為特徵的內分泌代謝性常見病、多發病，據世界衛生組織(WHO)最新公布數據顯示，2007年全球糖尿病患者人數已達I. 8億，且發病率仍逐年增加，預測到2025年，全球糖尿病患者人數將達3億，成為繼心腦血管和癌症之後的人類第三大殺手。糖尿病主要分為I型(膜島素依賴型，insulin dependent diabetes, IDDM)和II型(非胰島素依賴型糖尿病，non-insulin dependent diabetes, NIDDM),其中II型糖尿病患者佔90%以上。II型糖尿病患者多存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足兩方面異常，在發病的中晚期往往出現胰島β細胞凋亡。目前臨床使用的口服降糖藥的作用機理多為增強胰島素敏感性或促進胰島素分泌以穩定血糖，均無法解決β細胞凋亡這一難題。然而，胰高血糖素樣肽-I (Glucagon-like peptide 1，GLP-1)及其類似物藥物的應用使得II型糖尿病的治療獲得突破性進展，有望為糖尿病治療提供全新的選擇方案。但由於GLP-I易被二肽酶(dipeptidyl pepidiase IV, DPP IV)迅速降解,在體內半衰期只有2分鐘左右,故外源GLP-I難以獲得臨床使用。Exendin-4是一種從美洲希拉巨蜥(Heloderma suspectum)唾液中分離得到的含有39個胺基酸的天然多肽激素，與GLP-I有53%的序列同源性，不但具有類GLP-I促胰島素分泌的功能，而且其體內穩定性也遠高於GLP-1。根據Exendin-4的這一特點，美國Amylin公司和Eli Lilly公司聯合開發了化學合成的藥物Exendin_4(又稱Exenatide,式I化合物，中文名艾塞那肽，商品名Byetta)。Byetta是世界上首個腸促胰島素類似物藥物，於2005年4月經美國FDA批准上市。研究表明，艾塞那肽不僅能很好地控制血糖，還可促進胰島細胞的新生和增殖，減少β細胞凋亡，改善β細胞功能，具有非常明顯的臨床應用優勢。此外，臨床研究中發現艾塞那肽還能夠減慢胃腸排空的速度，使人沒有飢餓感而減少攝入食物，從而使人的體重下降。其結構式如下151015H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20253035Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-PTo-Pro-Ser-NH2艾塞那肽的製備方法主要有生物合成法與化學合成法。生物合成法利用人工基因重組方式得到Exenatide全序列(如專利CN101501209A)。化學合成法通常可採用常規的全固相合成(如專利W02008109079A2、CN101357938A、CN101538324A)技術。全固相合成操作簡單，對於一些片段較短的肽鏈是一個快捷高效的方法。然而，隨著肽鏈的延長，其中疏水性強的肽段形成β-摺疊的可能性很大，固相合成方法往往導致出現困難序列。此外，固相肽合成中還存在肽鏈與樹脂載體之間的分子集聚(aggregation)現象,這都會造成偶聯和脫保護效率大大降低。在艾塞那肽的固相合成中，主要的挑戰有兩處。一處是肽鏈中部從第26到第19個胺基酸的序列中存在多個疏水性氨基 酸，形成第一個「困難序列」區，固相合成實踐表明，第26位的Leu、第23位的He、第21位的Leu及第19位的Val縮合都非常困難，即便使用了改善的反應條件，如變換縮合反應體系、延長反應時間、多次重複縮合等，結果亦收效甚微。第二個「困難序列」區涉及到三個連續的穀氨酸殘基。在固相合成中，重複的穀氨酸序列在帶上側鏈保護基後，疏水性大大增加，導致在樹脂上產生扭曲的部分，這使得難以在該重複的穀氨酸序列上繼續偶聯其他胺基酸以延長肽鏈。在化學合成法中，W02009053315A1公開了一種採用固相和液相結合合成艾塞那肽的方法。固液結合的方法因為縮短了片段的長度，因此單個片段在固相上的合成較為容易，且純度較高，有利於最終產物的純化。然而，在液相中進行片段縮合時容易出現片段溶解困難、C-端消旋化以及二級結構導致的縮合困難等問題。另外，每個片段的合成必須使用相對較貴的全保護肽樹脂，大大增加了成本。鑑於艾塞那肽重要的藥學應用價值，有必要提供更有效的艾塞那肽合成方案，能夠克服以上方法的缺陷並適合工業規模的生產。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種成本低、適於工業化生產的艾塞那肽的合成方法。技術方案本發明提供了一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於包括以下步驟(I)用固相合成方法由Fmoc-Ser (tBu)-OH和取代度為O. 3-1. 2mmol/g的氨基樹脂為起始原料，反應製得Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂；(2) Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂在Fmoc脫保護試劑作用下脫去Fmoc後,在偶聯體系作用下於偶聯溶劑中依肽序依次連接Fmoc胺基酸以及至少一個氨基保護的Fmoc胺基酸或醯胺N上臨時取代的二肽，並在Fmoc脫保護試劑作用下依次脫去Fmoc，製得側鏈全保護的艾塞那妝氣基樹脂；(3)對側鏈全保護的艾塞那肽氨基樹脂在裂解體系作用下裂解脫除側鏈保護基，冰乙醚沉澱，即得艾塞那肽。其中，步驟(I)中，所述氨基樹脂為Rink Amide樹脂、Rink Amide-AM樹脂、RinkAmide-MBHA樹脂或Sieber Amide樹脂；氨基樹脂和Fmoc-Ser (tBu) -OH的質量摩爾比為Ig : (O. 5-5) mmol ;反應時間O. 5_2h，反應溫度為10_40°C。其中，步驟(2)中，所述氨基保護的Fmoc胺基酸為2_羥基_4_甲氧基苄基(Hmb)、2，4- 二甲氧基苄基(Dmb)或2，4，6-三甲氧基苄基(Tmb)保護的胺基酸，所述醯胺N上臨時取代的二肽為偽脯氨酸或醯胺N上臨時取代基為2-羥基-4-甲氧基苄基、2，4- 二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基保護的二肽；其中，Hmb的結構式為權利要求
1.一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)用固相合成方法由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度為O. 3-1. 2mmol/g的氨基樹脂為起始原料，反應製得Fmoc-Ser (tBu)-氨基樹脂； (2)Fmoc-Ser (tBu) -氨基樹脂在Fmoc脫保護試劑作用下脫去Fmoc後，在偶聯體系作用下於偶聯溶劑中依肽序依次連接Fmoc胺基酸以及至少一個氨基保護的Fmoc胺基酸或醯胺N上臨時取代的二肽，並在Fmoc脫保護試劑作用下依次脫去Fmoc，製得側鏈全保護的艾塞那妝氣基樹脂； (3)對側鏈全保護的艾塞那肽氨基樹脂在裂解體系作用下裂解脫除側鏈保護基，冰乙醚沉澱，即得。
2.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(I)中，所述氨基樹脂為 Rink Amide 樹脂、Rink Amide-AM樹脂、Rink Amide-MBHA樹脂或 Sieber Amide樹脂。
3.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(2)中，所述氨基保護的Fmoc胺基酸為2-羥基-4-甲氧基苄基、2，4- 二甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基保護的胺基酸，所述醯胺N上臨時取代的二肽為偽脯氨酸或醯胺N上臨時取代基為2-輕基-4-甲氧基節基、2，4- 二甲氧基節基、2，4, 6- 二甲氧基節基保護的二妝；其中， 2-羥基-4-甲氧基苄基的結構式為
4.根據權利要求3所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於所述偽脯氨酸包括 Fmoc-Gly-Thr (vMe』MePro)-0H、Fmoc-Phe-Thr (vMe』MePro)-0H、Fmoc-Thr (tBu) -Ser ( ΨΜ0>MePro) -OH、Fmoc-Leu-Ser (iyMe』MePro) -OH、Fmoc-Pro-Ser ( vMe』MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -Ser ( ￥Me,MePro) -OH。
5.根據權利要求3所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於所述2-羥基-4-甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基保護的胺基酸包括 Fmoc-(Hmb) Gly-OH、Fmoc-(Hmb) Leu-OH、Fmoc- (Hmb) Ala-OH ;Fmoc_ (Dmb) Gly-OH、Fmoc-(Dmb) Leu-OH、Fmoc-(Dmb) Ala-OH、Fmoc-(Tmb) Gly-OH、Fmoc- (Tmb) Leu-OH 和Fmoc-(Tmb)Ala-OH。
6.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(2)中，偶聯溶劑為DCM，DMF或NMP中的任意一個或一個以上的組合；偶聯體系為HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個或多個與DIC的組合，或為HOBt、HOAt, HOOBt或Cl-HOBt中的任意一個或多個與DPIEA或NMM中的任意一個或兩個與HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一個或多個的組合。
7.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(2)中，Fmoc脫保護試劑為哌啶，脫保護反應溫度為10-50°C，反應時間為5-60min，Fmoc脫保護試劑與偶聯溶劑的體積比為I: (3-5)。
8.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(3)中，所述裂解體系包括三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、水和三異丙基矽烷的混合溶液，其體積比為(90-95)(2-5)(2-5) :(1_5)。
9.根據權利要求I所述的一種艾塞那肽固相合成方法，其特徵在於步驟(3)中，冰乙醚沉澱後，還包括純化步驟，具體為將艾塞那肽溶於乙酸水溶液中，過濾，濾液經C18或CS柱梯度洗脫，流動相為水和乙腈，凍幹，即得艾塞那肽。
全文摘要
本發明提供了一種艾塞那肽固相合成方法，包括以下步驟1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度為0.3-1.2mmol/g的氨基樹脂為起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基樹脂；2)Fmoc-Ser(tBu)-氨基樹脂脫去Fmoc保護基後，依肽序依次連接Fmoc胺基酸以及至少一個氨基保護的Fmoc胺基酸或醯胺N上臨時取代的二肽，脫去Fmoc，製得側鏈全保護的艾塞那肽氨基樹脂；3)對樹脂脫除側鏈保護基，冰乙醚沉澱，即得艾塞那肽。該合成方法效率高、反應操作簡單、後處理容易，適於工業化生產。
文檔編號C07K1/04GK102942625SQ201210504949
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者蘇賢斌, 錢依冰, 毛怡春, 葉青, 董海軍 申請人:南京工業大學, 南京英沛生物技術有限公司