一種汞離子的超靈敏檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
2023-06-28 18:31:56
一種汞離子的超靈敏檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種汞離子的超靈敏檢測方法及檢測試劑盒。本發明將基於核酸外切酶III介導的信號放大技術與試紙條檢測技術相結合，構建一種痕量汞離子的快速檢測方法。本方法具有很高的靈敏度，對汞離子的檢測限為10pM，檢測結果直觀，肉眼可見，檢測過程方便、迅速，可用於汞離子的實地現場檢測；此外，本發明的檢測方法具有很好的特異性，常見的其他金屬離子對檢測不產生影響；構建得到的檢測試紙條使用起來省時、省力，檢測速度快且操作簡單方便，檢測結果直觀，肉眼可見，不需要使用任何儀器。
【專利說明】一種汞離子的超靈敏檢測方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於分析化學【技術領域】，具體涉及一種核酸外切酶III介導的信號放大用於痕量汞離子的快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]汞離 子(Hg2+)是一種普遍存在的重金屬汙染源，對人體危害嚴重，是環境監測的重要指標。汞離子接觸可不同程度地對健康造成一系列有害影響，包括腎臟衰竭、大腦受損、神經系統以及免疫系統損傷。美國環境保護署規定飲用水中汞離子的最大允許量不得超過ΙΟηΜ。目前，汞離子的常規檢測方法主要有原子吸收法、原子螢光光譜法、電感耦合等離子體發射光譜法等。但是這些方法操作繁瑣，需要麻煩的前處理、專門的分析技術人員以及昂貴的儀器，不利於現場快速分析檢測。近年來，利用汞離子能與DNA中的胸腺嘧啶(thymine, T)特異性地結合，形成T-Hg2+-T複合物，設計了一系列傳感器用於汞離子的檢測(Ono, A and Togashi,H.Angew.Chem.1nt.Ed., 2004,43,4300-4302)。但是潛在的缺點是檢測靈敏度低，難以滿足環境樣品檢測的需要，因此需要通過信號放大來提高檢測靈敏度。
[0003]核酸外切酶III (exonuclease III,Exo III)能從雙鏈DNA中的3'末端開始逐步切去單核苷酸。該酶的最適底物是雙鏈DNA中的平齊末端或3'凹餡末端DNA，對單鏈DNA沒有活性，也不能切割雙鏈DNA中的3'突出末端(Zuo, X.；Xia, F.；Xiao, Y and Plaxco，K.ff.J.Am.Chem.Soc.，2010，132，1816-1818)。
【發明內容】
[0004]針對現有技術中所存在的不足，本發明的目的在於將基於核酸外切酶III介導的信號放大技術與試紙條檢測技術相結合，構建一種痕量汞離子的快速檢測方法。該方法具有很高的靈敏度和特異性，操作簡單，檢測迅速，檢測過程無需使用任何儀器。
[0005]本發明所採取的技術方案是:
[0006]一種汞離子的超靈敏檢測方法，包括如下步驟
[0007](I)構建莖環結構DNA:所述莖環結構DNA的3』端適當延伸，凸出在莖環結構外，凸出部分含有T鹼基；
[0008](2)構建輔助DNA:所述輔助DNA的5』端含有T鹼基，在有汞離子存在時能與莖環結構DNA的3』端通過形成T-Hg2+-T複合物互補，從而打開莖環結構DNA，並形成含有3』平末端的部分互補的雙鏈DNA ；
[0009](3)將待檢樣品與莖環結構DNA、輔助DNA混合後，靜置反應；
[0010](4)往步驟(3)的反應液中加入核酸外切酶III，在有汞離子存在的情況下，莖環結構DNA和輔助DNA通過T-Hg2+-T複合物互補，形成含有3』平末端的部分互補雙鏈DNA，核酸外切酶III能與部分互補的雙鏈DNA中的3』平末端結合，從而開始切割反應，釋放單核苷酸以及汞離子，最後釋放出單鏈DNA，所述單鏈DNA含有莖環結構DNA的環狀區和5』端莖狀區；[0011](5)通過檢測步驟(4)釋放出的單鏈DNA來判斷待檢樣品中是否含有汞離子。
[0012]在汞離子存在的情況下，輔助DNA的5』段與莖環結構DNA的3』端的突出部分及部分莖狀區互補，且輔助DNA的3』末端有至少4個鹼基不能與莖環結構DNA互補形成平末端。
[0013]作為優選的，所述莖環結構DNA中，環狀區部分的鹼基數為9~12，莖狀區部分的鹼基數為18~21個,?狀區的鹼基數比環狀區的鹼基數多。
[0014]作為優選的，所述莖環結構DNA的突出部分以及輔助DNA的5』端均含有I~5個
T鹼基。
[0015]步驟(5)可採用電化學法、螢光法、比色法、電化學發光法或試紙條法檢測釋放出的單鏈DNA。
[0016]作為優選的，步驟(5)採用試紙條法檢測釋放出的單鏈DNA，所用試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜以及吸水紙；
[0017]所述金標墊上噴射有金標DNA探針I，所述金標DNA探針I與莖環結構DNA的環狀區互補；
[0018]所述檢測區上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環結構DNA的5』端莖狀區互補；
[0019]所述質檢區上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I互補。
`[0020]一種汞離子的超靈敏檢測試劑盒，其包括:
[0021](I)莖環結構DNA:所述莖環結構DNA的3』端適當延伸，凸出在莖環結構外，凸出部分含有T鹼基；
[0022](2)輔助DNA:所述輔助DNA的5』端含有T鹼基，在有汞離子存在時能與莖環結構DNA的3』端通過形成T-Hg2+-T複合物互補，從而打開莖環結構DNA，形成含有3』平末端的部分互補的雙鏈DNA ；
[0023](3)核酸外切酶III ;
[0024](4)檢測試紙條。
[0025]所述檢測試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜以及吸水紙；
[0026]所述金標墊上噴射有金標DNA探針I，所述金標DNA探針I與莖環結構DNA的環狀區互補；
[0027]所述檢測區上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環結構DNA的5』端莖狀區互補；
[0028]所述質檢區上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I互補。
[0029]所述DNA探針2用鏈黴親和素與生物素修飾。
[0030]所述DNA探針3用鏈黴親和素與生物素修飾。
[0031]下面舉例介紹一下本發明方法的技術原理:
[0032]如圖1所示，莖環結構的DNA包含有4個功能區域，分別是1、2、4、和2*區域，其中2和2*是互補的，形成莖環結構的莖狀區；4為莖環結構的環狀區。在DNA中，5』端用小正方形表示，3』端用箭頭表示。莖環結構DNA的3』端適當延伸，凸出在莖環結構外，即為I區域。在I區域中含有I~5個T鹼基。輔助DNA包含有3個區域(1*、2*和3*)，其中在區域I*中也含有I~5個T鹼基。在有Hg2+存在時，莖環結構DNA的I區域通過形成T-Hg2+-T複合物與輔助DNA的I*區域結合，在莖環結構DNA的3』末端形成平末端，並開始介導DNA鏈置換反應，打開莖環結構，使輔助DNA的2*區域和莖環結構DNA的2區域結合，形成更長的部分互補的雙鏈DNA(1*和I互補，2*和2互補)。然後加入核酸外切酶IIKExo III)進行信號放大(圖1，反應b)。Exo III能與部分互補的雙鏈DNA中的3』平末端結合，從而開始切割反應，釋放單核苷酸以及汞離子，最後釋放出單鏈DNA(包含2*區域、4區域以及部分2區域)。同時由於部分互補雙鏈DNA中的輔助DNA3』端的3*區域不與莖環結構DNA互補形成平末端，因此Exo III不會切割輔助DNA。最終，切割反應後輔助DNA被釋放出來，汞離子也被釋放出來，從而可以開始下一輪的反應(圖1，反應C)。最後形成大量的單鏈DNA，可採用電化學法、螢光法、比色法、電化學發光法或試紙條法檢測釋放出的單鏈DNA。下面將介紹其中的試紙條法。
[0033]如圖2所示，檢測試紙條包含4個部分:樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，這四個部分從左到右依次固定於膠板上(如圖2所示)。DNA探針I (DNApiObel)的5』端用巰基(-SH)修飾，固定在金納米顆粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNA probe I複合物噴射在金標墊上。硝酸纖維素膜上劃有兩個檢測區域:檢測區和質控區，其中檢測區固定的是鏈黴親和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探針2 (SA-biotin-DNA probe2)，質控區固定的是鏈黴親和素(SA)-生物素(biotin)-DNA 探針 3 (SA-biotin-DNA probe3)。其中 DNA probe I的4*區域與莖環結構DNA的4區域是互補的；DNA probe2的2區域與莖環結構DNA的2*區域是互補的；DNAprobe3與DNAprobel互補。
[0034]將上面得到的單鏈DNA滴於試紙條的樣品墊，通過毛細管遷移作用向前移動，經過金標墊時， 單鏈DNA的4區域與DNAprobel的4*區域雜交,形成複合物。該複合物繼續往前移動，通過檢測區時，單鏈DNA的2*區域會與固定在檢測區的SA-biotin-DNA probe2相互作用，從而抓住該複合物，使其在檢測區聚集。聚集的金納米顆粒形成肉眼可見的紅色區域。過量的AuNPs-DNA probe I複合物會與質控區上的DNAprobe3雜交,在質控區聚集,從而質控區也呈紅色。也就是說有汞離子存在時候，檢測區和質控區都顯示紅色。當沒有汞離子存在時，莖環結構的DNA和輔助DNA不會相互作用，Exo III無法作用於莖環結構DNA，因而沒有單鏈DNA形成。從而檢測區沒有紅色出現，而質控區始終顯示紅色，表明組裝的試紙條可用。
[0035]本發明的有益效果是:
[0036](I)Exo III能介導信號放大過程，使汞離子可不斷循環，達到高靈敏檢測的目的；
[0037](2)本發明所述的汞離子的檢測方法具有很高的靈敏度，對汞離子的檢測限為ΙΟρΜ，檢測結果直觀，肉眼可見，檢測過程方便、迅速，可用於汞離子的實地現場檢測；
[0038](3)本發明所述的汞離子檢測方法具有很好的特異性，常見的其他金屬離子對檢測不產生影響；
[0039](4)本發明的試紙條檢測方法使用起來省時、省力，檢測速度快且操作簡單方便，不需要使用任何儀器，不需要專業的技術人員，無須培訓即可推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】[0040]圖1為Exo III介導的信號擴增示意圖；
[0041]圖2為試紙條檢測示意圖；
[0042]圖3為對不同濃度的汞離子檢測的結果圖；
[0043]圖4為特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0044]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
[0045]實施例1 一種汞離子的超靈敏檢測試劑盒的構建
[0046]一、莖環結構DNA與輔助DNA的設計
[0047]莖環結構DNA的序列如SEQ ID NO:1所示,其結構如下:
[0048]
【權利要求】
1.一種汞離子的超靈敏檢測方法，包括如下步驟 (1)構建莖環結構DNA:所述莖環結構DNA的3』端適當延伸，凸出在莖環結構外，凸出部分含有T鹼基； (2)構建輔助DNA:所述輔助DNA的5』端含有T鹼基，在有汞離子存在時能與莖環結構DNA的3』端通過形成T-Hg2+-T複合物互補，從而打開莖環結構DNA，並形成含有3』平末端的部分互補的雙鏈DNA ； (3)將待檢樣品與聖環結構DNA、輔助DNA混合後，靜直反應； (4)往步驟(3)的反應液中加入核酸外切酶III，在有汞離子存在的情況下，莖環結構DNA和輔助DNA通過T-Hg2+-T複合物互補，形成含有3』平末端的部分互補雙鏈DNA，核酸外切酶III能與部分互補的雙鏈DNA中的3』平末端結合，從而開始切割反應，釋放單核苷酸以及汞離子，最後釋放出單鏈DNA，所述單鏈DNA含有莖環結構DNA的環狀區和5』端莖狀區； (5)通過檢測步驟(4)釋放出的單鏈DNA來判斷待檢樣品中是否含有汞離子。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，在汞離子存在的情況下，輔助DNA的5』段與莖環結構DNA的3』端的突出部分及部分莖狀區互補，且輔助DNA的3』末端有至少4個鹼基不能與莖環結構DNA互補形成平末端。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述莖環結構DNA中，環狀區部分的鹼基數為9~12,?狀區部分的鹼基數為18~21個,?狀區的鹼基數比環狀區的鹼基數多。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述莖環結構DNA的突出部分以及輔助DNA的5』端均含有I~5個T鹼基。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(5)可採用電化學法、螢光法、t匕色法、電化學發光法或試紙條法檢測釋放出的單鏈DNA。
6.根據權利要求1或5所述的檢測方法，其特徵在於，步驟(5)採用試紙條法檢測釋放出的單鏈DNA，所述試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜以及吸水紙； 所述金標墊上噴射有金標DNA探針I，所述金標DNA探針I與莖環結構DNA的環狀區互補； 所述檢測區上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環結構DNA的5』端莖狀區互補； 所述質檢區上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I互補。
7.一種汞離子的超靈敏檢測試劑盒，其包括: (1)莖環結構DNA:所述莖環結構DNA的3』端適當延伸，凸出在莖環結構外，凸出部分含有T喊基； (2)輔助DNA:所述輔助DNA的5』端含有T鹼基，在有汞離子存在時能與莖環結構DNA的3』端通過形成T-Hg2+-T複合物互補，從而打開莖環結構DNA，形成含有3』平末端的部分互補的雙鏈DNA ； (3)核酸外切酶III； (4)檢測試紙條。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特徵在於所述檢測試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區和質控區的硝酸纖維素膜以及吸水紙；所述金標墊上噴射有金標DNA探針I，所述金標DNA探針I與莖環結構DNA的環狀區互補； 所述檢測區上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環結構DNA的5』端莖狀區互補； 所述質檢區上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I互補。
9.根據權利要求8所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述DNA探針2用鏈黴親和素與生物素修飾。
10.根據權利要求8所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述DNA探針3用鏈黴親和素與生物素修飾。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773856SQ201410005177
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】陳俊華, 周順桂, 溫俊林 申請人:廣東省生態環境與土壤研究所