α－澱粉酶變體的製作方法

2023-06-29 03:33:46

專利名稱：α－澱粉酶變體的製作方法
技術領域：
本發明特別涉及親本Termamyl-樣α-澱粉酶的新變體，尤其是顯示改變的特性的變體，具體是改變了酶解模式(相對於親本)，這在此類變體的應用中，特別是在工業澱粉處理中(例如，澱粉液化或糖化)是有利的。
背景技術：
α-澱粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)組成催化澱粉和其它直鏈及支鏈1，4-葡糖苷寡糖和多糖水解的一組酶。
有大量的專利和科學文獻涉及此類在工業上很重要的酶。許多α-澱粉酶，例如Termamyl-樣α-澱粉酶可從，例如WO 90/11352，WO 95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873，WO 96/23874和WO 97/41213中了解。
在最近涉及α-澱粉酶的公開內容中，WO 96/23874提供了名為BA2的Termamyl-樣α-澱粉酶的三維，X-射線晶體結構數據，其由解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(包含本文SEQ ID NO6中所示胺基酸序列)的300個N-末端胺基酸殘基，以及地衣芽孢桿菌α-澱粉酶(包含本文SEQ ID NO4中所示胺基酸序列)C-末端的胺基酸301-483(後者可以以商品名TermamylTM買到)組成，它因此與工業上很重要的芽孢桿菌α-澱粉酶(在本文中包括在術語「Termamyl-樣α-澱粉酶」的意義中，並且尤其包括地衣芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，和嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶)密切相關。WO 96/23874進一步描述了根據對親本Termamyl-樣α-澱粉酶的結構分析來設計親本Termamyl-樣α-澱粉酶的表現出特性改變的變體的方法。
WO 96/23874和WO 97/41213(Novo Nordisk)公開了Termamyl-樣α-澱粉酶的一種變體，其酶解模式已發生改變、並包含在本文示於SEQ ID NO4的序列中胺基酸殘基V54，D53，Y56，Q333，G57和A52的突變。
發明簡述本發明涉及Termamyl-樣α-澱粉酶的新的α-澱粉分解變體(突變體)，尤其顯示出改變的酶解模式(對照於親本)的變體，所述改變在澱粉工業處理方面(澱粉的液化，糖化及類似方面)是有利的。
本發明人意外發現一些具有改變的特性的變體，它們與WO 96/23874和WO 97/41213(Novo Nordisk)中披露的Termamyl-樣α-澱粉酶變體(其酶解模式發生了改變，並包含SEQ ID NO4中所示胺基酸序列中殘基V54，D53，Y45，Q333，G57和A52的突變)相比，特性已改變，尤其改變了酶解模式—降低了靠近分支點酶解底物的能力，而且進一步改進了底物特異性和/或改進了比活性。
本發明進一步涉及編碼本發明變體的DNA構建體，包含本發明變體的組合物，製備本發明變體的方法，以及本發明變體和組合物單獨或與其它α-澱粉分解酶聯合在各種工業處理過程中的應用，例如，澱粉液化，在洗滌劑組合物中，例如洗衣，清洗碗碟和硬表面清洗的組合物；乙醇的生產，例如燃料，酒類和工業乙醇的生產；織物，纖維或衣物的退漿等。
命名法在本說明和權利要求中，使用傳統的一個和三個字母表示胺基酸殘基。為便於引用，本發明的α-澱粉酶變體採用下述的命名法原胺基酸位置用於取代的胺基酸根據該命名法，用天冬醯胺取代第30位的丙氨酸被示於Ala30Asn或A30N，在相同位置處缺失丙氨酸被示於Ala30*或A30*，而插入另一個胺基酸殘基，如賴氨酸被示於Ala30AlaLys或A30AK。缺失連續的一段胺基酸殘基，如胺基酸殘基30-33被示於(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當特定的α-澱粉酶相對於其它α-澱粉酶而言含有「缺失」，並在該位置插入某個胺基酸，例如在第36位插入天冬氨酸時，被示於*36Asp或*36D。
多個突變由加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S分別表示在第30和34位，丙氨酸和穀氨酸分別用天冬醯胺和絲氨酸取代。多個突變也可以由下列與加號意義相同的符號隔開Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S。
當在給定的位置插入一個或多個其它胺基酸殘基時，被示於A30N，E或A30N或A30E。
另外，當本文鑑定出適於修飾的位置，而沒有暗示任何具體的修飾時，應理解為可用任一胺基酸殘基取代該位置存在的胺基酸殘基。因此，例如，當提到修飾第30位的丙氨酸，但未具體說明或示於「X」時，應理解為丙氨酸可缺失，或用任一其它胺基酸，即下列任一胺基酸所取代R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。
發明詳述Termamyl-樣α-澱粉酶眾所周知，通過芽孢桿菌種產生的多種α-澱粉酶在胺基酸水平上高度同源。例如，已發現含有SEQ ID NO4中所示胺基酸序列的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶(商品為TermamylTM)與含有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶約89％同源，與含有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶約79％同源。其它同源的α-澱粉酶包括衍生自芽孢桿菌菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375的α-澱粉酶(皆詳細描述於WO 95/26397)，和描述於Tsukamoto等，生物化學和生物物理研究通訊，151(1988)，p25-31中的α-澱粉酶。
其它同源的α-澱粉酶包括由EP 0252666所述的地衣芽孢桿菌菌株(ATCC 27811)所產生的α-澱粉酶，和WO 91/00353和WO 94/18314中鑑定的α-澱粉酶。其它可商購的Termamyl-樣地衣芽孢桿菌α-澱粉酶是OptithermTM和TakathermTM(可衍生自Solvay)，MaxamylTM(可衍生自Gist-brocades/Genencor)，Spezym AATM和Spezyme Delta AATM(可衍生自Genencor)和KeistaseTM(可衍生自Daiwa)。
由於這些α-澱粉酶基本上同源，因此可以認為它們屬於同一類α-澱粉酶，即「Termamyl-樣α-澱粉酶」。
因此，在本發明的上下文中，術語「Termamyl-樣α-澱粉酶」欲指在胺基酸水平上與TermamylTM(即具有本文SEQ ID NO4中所示胺基酸序列的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶)基本上同源的α-澱粉酶。換句話說，Termamyl-樣α-澱粉酶是具有本文SEQ ID NO2，4，6或8中所示胺基酸序列，和WO 95/26397或Tsukamoto等，1988的SEQ ID NO1或2所示胺基酸序列的α-澱粉酶，或者，Termamyl-樣α-澱粉酶是i)與至少一個上述胺基酸序列的同源性至少為60％，優選至少為70％，更優選至少為75％，甚至更優選至少為80％，尤其是至少為85％，尤其優選至少為90％，尤其是至少為95％，甚至尤其更優選至少為97％，尤其是至少為99％的α-澱粉酶，和/或ii)能與針對一種或多種所述α-澱粉酶產生的抗體發生免疫交叉反應的α-澱粉酶，和/或iii)由能與編碼上述-特定α-澱粉酶的DNA序列雜交的DNA序列編碼的α-澱粉酶，所述特定α-澱粉酶的DNA序列分別示於本申請的SEQ ID NO1，3，5和7，以及WO 95/26397的SEQ ID NO4。
關於特性i)，可利用任何常規的算法測定「同源性」(同一性)，優選使用GCG程序包第7.3版(1993年6月)的缺口程序，該程序使用缺口得分的預設值，即缺口產生得分為3.0，缺口延伸得分為0.1(遺傳學計算機組(1991)GCG軟體包程序手冊，第7版，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國53711)。
可使用Termamyl和Termamyl-樣α-澱粉酶之間的結構對比來鑑定其它Termamyl-樣α-澱粉酶中等同的/相應的位置。得到所述結構對比的一個方法是使用GCG程序包中的Pile Up程序，該程序使用預設的缺口得分值，即缺口產生得分為3.0，缺口延伸得分為0.1。其它結構對比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等，(1987)，FEBS LETTERS 224，p.149-155)和反向穿梭(threading)法(Huber，T；Torda，AE，蛋白質科學，卷7，1期，142-149(1998))。α-澱粉酶的特性ii)，即免疫交叉反應性可利用針對或與相關Termamyl-樣α-澱粉酶的的至少一個表位反應的抗體進行分析。所述抗體(為單克隆或多克隆形式)可用本領域已知方法得到，如Hudson等，免疫學實踐(Practical Immunology)，第三版(1989)，Blackwell Scientific Publications所述。免疫交叉反應性可利用本領域已知試驗來測定，如Western印跡或放射性免疫擴散試驗，如Hudson等，1989所述。在這方面，在分別含有胺基酸序列SEQ ID NOS2，4，6，或8的α-澱粉酶間發現了免疫交叉反應性。
可以在所述α-澱粉酶的完整或部分核苷酸或胺基酸序列的基礎上適當製備寡核苷酸探針，然後使用所述探針，根據上述特性iii)鑑定Termamyl-樣α-澱粉酶。
檢測雜交的適當條件包括在5×SSC中預浸泡，於～40℃，在20％甲醯胺，5×Denhardt’s溶液，50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經超聲處理的小牛胸腺DNA中預雜交1小時，接著於～40℃，在添加有100mMATP的相同溶液中雜交18小時，接著於40℃，用2×SSC，0.2％SDS將濾膜洗滌3次，每次30分鐘(低嚴緊性)，優選在50℃(中度嚴緊性)，更優選在65℃(高嚴緊性)，甚至更優選在～75℃(很高的嚴緊性)進行洗滌。有關雜交方法的更多細節描述於Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，1989。
在本發明的上下文中，「衍生自」不僅僅表示由所述生物體產生或可由所述生物體產生的α-澱粉酶，還指由分離自所述菌株的DNA序列編碼的α-澱粉酶，和由所述DNA序列轉化的宿主生物體產生的α-澱粉酶。最後，該術語還表示由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼的，並具有所述α-澱粉酶的鑑定特徵的α-澱粉酶。該術語還表示親本α-澱粉酶可以是天然α-澱粉酶的變體，即修飾(插入，取代，缺失)天然α-澱粉酶的一個或多個胺基酸殘基而得到的變體。
親本雜合型α-澱粉酶親本α-澱粉酶可以是雜合型α-澱粉酶，即含有衍生自至少兩種α-澱粉酶的部分胺基酸序列組合的α-澱粉酶。
親本雜合型α-澱粉酶可以是在胺基酸同源性和/或免疫交叉-反應性和/或DNA雜交(如上所述)的基礎上被確定為屬於Termamyl-樣α-澱粉酶家族的雜合型α-澱粉酶。此時，雜合型α-澱粉酶一般由Termamyl-樣α-澱粉酶的至少一個部分和一種或多種其它α-澱粉酶的部分組成，所述其它α-澱粉酶選自微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物來源的Termamyl-樣α-澱粉酶或非-Termamyl-樣α-澱粉酶。
因此，親本雜合型α-澱粉酶可含有衍生自至少兩種Termamyl-樣α-澱粉酶，或衍生自至少一種Termamyl-樣和至少一種非-Termamyl-樣細菌α-澱粉酶，或衍生自至少一種Termamyl-樣和至少一種真菌α-澱粉酶的部分胺基酸序列組合。衍生得到部分胺基酸序列的Termamyl-樣α-澱粉酶可以是例如本文所述的任何特定的Termamyl-樣α-澱粉酶。
例如，親本α-澱粉酶可含有衍生自地衣芽孢桿菌菌株的α-澱粉酶的C-末端部分，和衍生自解澱粉芽孢桿菌菌株或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-澱粉酶的N-末端部分。例如，親本α-澱粉酶可含有地衣芽孢桿菌α-澱粉酶C-末端部分的至少430個胺基酸殘基，也可含有如SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的37個N端胺基酸殘基的對應胺基酸片段及如SEQ IDNO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的445個C端胺基酸殘基的對應胺基酸片段，或b)對應於嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(具有SEQ ID NO8中所示胺基酸序列)的68個N-末端胺基酸殘基的胺基酸區段，和對應於地衣芽孢桿菌α-澱粉酶(具有SEQ ID NO4中所示胺基酸序列)的415個C-末端胺基酸殘基的胺基酸區段。
在一優選實施方案中，親本Termamyl-樣α-澱粉酶是與SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶相同的雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶，不同在於(成熟蛋白質)N-末端的35個胺基酸殘基被SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(BAN)的成熟蛋白N-末端的33個胺基酸殘基所取代。該雜合型可以進一步含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQ ID NO4的編號)，指LE174。
另一優選的親本雜合型α-澱粉酶是SEQ ID NO6中所示的LE429。
非-Termamyl-樣α-澱粉酶可以是例如真菌α-澱粉酶，哺乳動物或植物α-澱粉酶或細菌α-澱粉酶(不同於Termamyl-樣α-澱粉酶)。這種α-澱粉酶的具體例子包括米麴黴TAKAα-澱粉酶，黑麴黴酸性α-澱粉酶，枯草芽孢桿菌α-澱粉酶，豬胰腺α-澱粉酶和大麥α-澱粉酶。所有這些α-澱粉酶都具有已闡明的，與本文所述典型Termamyl-樣α-澱粉酶的結構顯著不同的結構。
上述真菌α-澱粉酶，即得自黑麴黴和米麴黴的α-澱粉酶在胺基酸水平上高度同源，一般認為它們屬於相同的α-澱粉酶家族。得自米麴黴的真菌α-澱粉酶可以商購，其商品名為FungamylTM。
另外，當提及Termamyl-樣α-澱粉酶的特定變體(本發明的變體)時，提到該變體是通過常規方法，修飾(例如缺失或取代)特定Termamyl-樣α-澱粉酶胺基酸序列中的特定胺基酸殘基而獲得的，應理解在另一個Termamyl-樣α-澱粉酶的等同位置(由各個胺基酸序列之間最有可能的胺基酸序列對比測定)修飾得到的變體也包括在本發明的範圍內。
本發明變體的優選實施方案是得自地衣芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親代Termamyl-樣α-澱粉酶)的變體，例如，上述α-澱粉酶中的一個，如具有SEQ IDNO4中所示胺基酸序列的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的變體。
本發明變體的構建可通過在適於生產變體的條件下，培養含有編碼所述變體之DNA序列的微生物來實現目標變體的構建。所述變體可隨後從得到的培養液中回收。這進一步詳述於下。
改變的性質下面討論突變(本發明變體中出現的)及其導致的所需性質改變(相對於親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的關係。
本發明第一方面涉及親本Termamyl-樣α-澱粉酶變體，其在選自下組的一或多個位置上包含改變W13，G48，T49，S50，Q51，A52，D53，V54，G57，G107，G108，A111，S168，M197，其中(a)所述每一改變是(i)在佔據此位置的胺基酸下遊插入胺基酸，(ii)佔據此位置的胺基酸的缺失，或(iii)佔據此位置的胺基酸用另一胺基酸取代，(b)所述變體具有α-澱粉酶活性且(c)每一位置對應於具有SEQ ID NO4之胺基酸序列的親本Termamyl-樣α-澱粉酶胺基酸序列的位置。
在優選實施方案中本發明上述變體包含一個突變，其位置對應於SEQ IDNO4中所示胺基酸序列中的至少一個下列突變V54N，A52S，A52S+V54N，T49L，T49+G107A，A52S+V54N+T49L+G107A，A52S+V54N+T49L，G107A，Q51R，Q51R+A52S，A52N；或T49F+G107A，T49V+G107A，T49D+G107A，T49Y+G107A，T49S+G107A，T49N+G107A，T49I+G107A，T49L+A52S+G107A，T49L+A52T+G107A，T49L+A52F+G107A，T49L+A52L+G107A，T49L+A52I+G107A，T49L+A52V+G107A；或T49V，T49I，T49D，T49N，T49S，T49Y，T49F，T49W，T49M，T49E，T49Q，T49K，T49R，A52T，A52L，A52I，A52V，A52M，A52F，A52Y，A52W，V54M，G107V，G107I，G107L，G107C。
在優選實施方案中，本發明變體在對應於SEQ ID NO4中所示胺基酸序列中的下列突變的位置包含至少一個突變W13F，L，I，V，Y，A；G48A，V，S，T，I，L；*48aD或*48aY(即D或Y的插入)；T49X；*49aX(即任一可能的胺基酸殘基的插入)S50X，尤其D，Y，L，T，V，I；Q51R，K；
A52X，尤其A52S，N，T，F，L，I，V；D53E，Q，Y，I，N，S，T，V，L；V54X，尤其V54I，N，W，Y，F，L；G57S，A，V，L，I，F，Y，T；G107X，尤其G107A，V，S，T，I，L，C；G108X，尤其G108A，V，S，T，I，L；A111V，I，L；S168Y；M197X，尤其Y，F，L，I，T，A，G。
在優選實施方案中，本發明變體包含SEQ ID NO4所示胺基酸序列中下列位置的突變T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A，並且可以進一步包含G108A。
在優選實施方案中，本發明變體在SEQ ID NO4所示胺基酸序列中的下列位置包含至少一個突變T49L+G107A；T49I+G107A；T49L+G107A+V54I；T49I+G107A+V54I；A52S+V54N+T49L+G107A；A52S+V54I+T49L+G107A；A52S+T49L+G107A；A52T+T49L+G107A；A52S+V54N+T49I+G107A；A52S+V54I+T49I+G107A；A52S+T49I+G107A；T49L+G108A；T49I+G108A；T49L+G108A+V54I；T49I+G108A+V54I；所有上述本發明變體相對於親本α-澱粉酶具有改變了的特性(意指提高或降低的性質)，具體為至少一個下列性質降低了接近分支點酶解底物的能力，提高了底物特異性和/或提高了比活性，改變了底物結合，改變了熱穩定性，改變了pH/活性關係(profile)，改變了pH/穩定性關係，改變了對氧化作用的穩定性，改變了Ca2+倚賴性。
穩定性在本發明內容中，在極低pH(即pH4-6)下獲得改變的穩定性，具體如改進的穩定性(即更高或更低)，的重要突變(包括胺基酸取代和/或缺失)，包括列於上面「改變的特性」部分中的任一突變和下面提到的變體。
以下變體Q360A，K；N102A，N326A，L，N190G，N190K；Y262A，K，E(採用BAN，即，SEQ ID N6，編號)也進行pH穩定性測試。優選的親本α-澱粉酶可以是上述的BA2。按照「材料與方法」部分所述測定pH穩定性。
Ca2+穩定性改變的Ca2+穩定性意味著在Ca2+耗盡(depletion)的情況下改善了酶穩定性，即提高或降低了穩定性。在本發明內容中，在極低pH(即pH4-6)下獲得改變的穩定性，具體如改進的穩定性(即更高或更低)，的重要突變(包括胺基酸取代)，包括列於上面「改變的特性」部分中的任一突變。
比活性在本發明另一方面，能獲得比活性已改變的變體的重要突變，尤其在60-100℃，優選70-95℃，特別是80-90℃提高或降低了比活性的突變，包括列於上文「改變的特性」部分中的任一突變。
用「材料和方法」部分中所述Phadebas方法鑑定LE174和LE429的比活性為16,000NU/mg。
改變的酶解模式在澱粉液化過程中優選使用一種能將澱粉分子為降解長型帶支鏈的寡糖的α-澱粉酶，而不優選使用產生較短的帶支鏈寡糖的α-澱粉酶(如傳統的Termamyl-樣α-澱粉酶)。短型帶支鏈的寡糖(潘糖前體)不能被液化過程中α-澱粉酶處理後使用，或與糖化澱粉葡萄糖苷酶(葡糖澱粉酶)同時使用，或在添加糖化澱粉葡萄糖苷酶(葡糖澱粉酶)之前使用的支鏈澱粉酶充分水解。故在存在潘糖前體的情況下，葡糖澱粉酶處理後的產物混合物中含有很大比例的短型帶支鏈的所謂極限糊精，即三糖潘糖。潘糖的存在極大地降低了糖化產率，這是不希望得到的。
以前有報導(US專利5,234,823)，當用葡糖澱粉酶和支鏈澱粉酶進行糖化時，如果不在糖化前使來自於液化步驟的殘餘α-澱粉酶失活，其活性的存在能導致葡萄糖產量降低。典型的失活方法可以是在降低溫度到60℃以進行糖化之前，於95℃調pH到4.7以下。
這種處理對葡萄糖生產之負影響的原因還不完全清楚，但是設想液化所用α-澱粉酶(例如地衣芽孢桿菌的Termamyl 120 L)通過水解支鏈澱粉中靠近和位於分支點兩側的1，4-α-糖苷鍵而產生「極限糊精」(它們是支鏈澱粉酶較難處理的底物)。葡糖澱粉酶對這些極限糊精的水解導致三糖潘糖的積累，而此糖只能被葡糖澱粉酶緩慢水解。
能避免該缺陷的熱穩定性α-澱粉酶的開發是一大進步，因為無需單獨進行失活步驟。
因此，本發明的目標就是得到突變的α-澱粉酶，它具有適當修飾的澱粉降解特性但保留了親本Termamyl-樣α-澱粉酶的熱穩定性。
相應地，本發明涉及Termamyl-樣α-澱粉酶變體，其降低了靠近分支點酶解底物的能力，並且進一步改進了底物特異性和/或比活性。
特定的目的是一種變體，它酶解支鏈澱粉底物，是從縮短的末端進行，距分支點一個以上葡萄糖單位，優選兩或三個以上葡萄糖單位，即比由野生型地衣芽孢桿菌α-澱粉酶得到的距分支點更遠的位置。
在此可以提及，依照WO 96/23874，預計包含至少一個下列突變的變體能阻止靠近分支點的酶解V54L，I，F，Y，W，R，K，H，E，Q；D53L，I，F，Y，W；Y56W；Q333W；G57，所有可能的胺基酸殘基；A52，大於A的胺基酸殘基，A52W，Y，L，F，I。
與獲得本發明變體有關的目標突變包括SEQ ID NO4所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶中下列位置上的突變，其中所述變體降低了靠近分支點酶解底物的能力，並進一步改進了底物特異性和/或比活性H156，A181，N190，A209，Q264和I201
應該強調的是，不但可以採用下面特別提及的Termamyl-樣α-澱粉酶，而且也可以採用其它市售的Termamyl-樣α-澱粉酶。下面所列並非這樣的α-澱粉酶的全部產自EP 0252666中所述地衣芽孢桿菌(ATCC 27811)的α-澱粉酶，在WO 91/00353和WO 94/18314中鑑定的α-澱粉酶。其它市售的地衣芽孢桿菌Termamyl-樣α-澱粉酶是OptithermTM和TakathermTM(從Solvay可得)，Maxamyl(從Gistbrocades/Genencor可得)，Spezym AATMSpezyme DeltaAATM(從Genencor可得)，和KeistaseTM(從Daiwa可得)。
所有Termamyl-樣α-澱粉酶都適合用作製備本發明變體的骨架。
在本發明優選的實施方案中，親本Termamyl-樣α-澱粉酶是SEQ IDNO4和SEQ ID NO6的雜合型α-澱粉酶。特別地，親本雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶可以是這樣的雜合型α-澱粉酶，其包含示於SEQ ID NO4的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的445個C-末端胺基酸殘基和衍生自解澱粉芽孢桿菌示於SEQ ID NO6的成熟α-澱粉酶的37個N-末端殘基，它可以進一步有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(SEQ ID NO4的編號)。此雜合型稱為LE174。LE174雜合型可與另一突變I201F組合而形成具有如下突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQ ID NO4的編號)的親本Termamyl-樣α-澱粉酶。此雜合型變體示於SEQ ID NO2且用在下面的例子中，稱作LE429。
同樣，LE174或LE429(SEQ ID NO2)或SEQ ID NO4中所示的包含一或多個下列突變的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶可以用作骨架(採用SEQ ID NO4的編號給突變編號)E119C；S130C；D124C；R127C；A52所有可能的胺基酸殘基；S85所有可能的胺基酸殘基；N96所有可能的胺基酸殘基；V129所有可能的胺基酸殘基；A269所有可能的胺基酸殘基；A378所有可能的胺基酸殘基；
S148所有可能的胺基酸殘基，尤其S148N；E211所有可能的胺基酸殘基，尤其E211Q；N188所有可能的胺基酸殘基，尤其N188S，N188P；M197所有可能的胺基酸殘基，尤其M197T，M197A，M197G，M197I，M197L，M197Y，M197F，M197I；W138所有可能的胺基酸殘基，尤其W138Y；D207所有可能的胺基酸殘基，尤其D207Y；H133所有可能的胺基酸殘基，尤其H133Y；H205所有可能的胺基酸殘基，尤其H205H，H205C，H205R；S187所有可能的胺基酸殘基，尤其S187D；A210所有可能的胺基酸殘基，尤其A210S，A210T；H405所有可能的胺基酸殘基，尤其H405D；K176所有可能的胺基酸殘基，尤其K176R；F279所有可能的胺基酸殘基，尤其F279Y；Q298所有可能的胺基酸殘基，尤其Q298H；G299所有可能的胺基酸殘基，尤其G299R；L308所有可能的胺基酸殘基，尤其L308F；T412所有可能的胺基酸殘基，尤其T412A；此外，SEQ ID NO4中所示、含至少一個下列突變的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶可用作骨架M15所有可能的胺基酸殘基；A33所有可能的胺基酸殘基；當通過組合LE174與突變I201F(SEQ ID NO4編號)而利用LE429(SEQID NO2中所示)作骨架(即，作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)，可根據本發明在一或多個下列位置產生，突變/改變，尤其取代，缺失和插入，以降低靠近分支點酶解底物的能力，改進底物特異性和/或比活性W13，G48，T49，S50，Q51，A52，D53，V54，G57，G107，G108，A111，S168，M197(採用SEQ ID NO4編號)其中(a)所述每一改變是(i)在佔據此位置的胺基酸下遊插入胺基酸，(ii)佔據此位置的胺基酸的缺失，或
(iii)佔據此位置的胺基酸用另一胺基酸取代，(b)所述變體具有α-澱粉酶活性且(c)每一位置對應於具有SEQ ID NO4之胺基酸序列的親本Termamyl-樣α-澱粉酶胺基酸序列的位置。
在優選實施方案中本發明的變體包含至少一個突變，其位置對應於下列突變(在示於SEQ ID NO4的胺基酸序列中的)V54N，A52S，A52S+V54N，T49L，T49+G107A，A52S+V54N+T49L+G107A，A52S+V54N+T49L，G107A，Q51R，Q51R+A52S，A52N；或T49F+G107A，T49V+G107A，T49D+G107A，T49Y+G107A，T49S+G107A，T49N+G107A，T49I+G107A，T49L+A52S+G107A，T49L+A52T+G107A，T49L+A52F+G107A，T49L+A52L+G107A，T49L+A52I+G107A，T49L+A52V+G107A；或T49V，T49I，T49D，T49N，T49S，T49Y，T49F，T49W，T49M，T49E，T49Q，T49K，T49R，A52T，A52L，A52I，A52V，A52M，A52F，A52Y，A52W，V54M，G107V，G07I，G107L，G107C。
在優選實施方案中，本發明變體在對應於SEQ ID NO4中所示胺基酸序列的下列突變的位置包含至少一個突變W13F，L，I，V，Y，A；G48A，V，S，T，I，L；*48aD或*48aY(即D或Y的插入)；T49X；*49aX(即任一胺基酸殘基的插入)S50X，尤其D，Y，L，T，V，I；Q51R，K；A52X，尤其A52S，N，T，F，L，I，V；D53E，Q，Y，I，N，S，T，V，L；V54X，尤其V54I，N，W，Y，F，L；G57S，A，V，L，I，F，Y，T；G107X，尤其G107A，V，S，T，I，L，C；G108X，尤其G108A，V，S，T，I，L；A111V，I，L；S168Y；
M197X，尤其Y，F，L，I，T，A，G。
在優選實施方案中，本發明變體包含至少一個下列突變，其位置對應於SEQ ID NO4中所示胺基酸序列中的下列突變T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A，並且可以進一步包含G108A。
在優選實施方案中，本發明變體包含至少一個突變，其位置對應於下列突變(在示於SEQ ID NO4的胺基酸序列中)T49L+G107A；T49I+G107A；T49L+G107A+V54I；T49I+G107A+V54I；A52S+V54N+T49L+G107A；A52S+V54I+T49L+G107A；A52S+T49L+G107A；A52T+T49L+G107A；A52S+V54N+T49I+G107A；A52S+V54I+T49I+G107A；A52S+T49I+G107A；T49L+G108A；T49I+G108A；T49L+G108A+V54I；T49I+G108A+V54I；本發明變體中的一般突變優選本發明的變體除了含有上述變化外，還含有一個或多個修飾。因此，經修飾的α-澱粉酶變體中一個或多個脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代較為有利，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然非脯氨酸殘基，優選為丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
類似地，優選親代α-澱粉酶被修飾的胺基酸殘基中存在的一個或多個半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘基取代，所述非半胱氨酸殘基可以是例如絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
另外，本發明的變體可以(作為唯一的修飾或與上述任何修飾聯合)被修飾，以使對應於SEQ ID NO4中185-209的胺基酸片段中存在的一個或多個Asp和/或Glu分別被Asn和/或Gln取代。另外，用Arg取代對應於SEQ IDNO4中185-209的胺基酸片段中存在的一個或多個Lys殘基也很有意義。
應理解本發明包含摻入了兩個或多個上述修飾的變體。
另外，在本文所述的任何變體中導入點突變較為有利。
製備α-澱粉酶的方法將突變引入基因的多種方法為本領域所知。在對編碼α-澱粉酶的DNA序列的克隆進行簡要討論後，以下討論在α-澱粉酶編碼序列內的特定位點產生突變的方法。
克隆編碼本發明α-澱粉酶的DNA序列可使用本領域眾所周知的多種方法，從產生所述α-澱粉酶的任何細胞或微生物中分離出編碼親代α-澱粉酶的DNA序列。首先，應使用源自產生待研究之α-澱粉酶的生物的染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然後，如果α-澱粉酶的胺基酸序列是已知的，可合成同源的經標記的寡核苷酸探針，使用該探針從生產自所述生物的基因組文庫中鑑定編碼α-澱粉酶的克隆。或者，將含有與已知α-澱粉酶基因同源之序列的經標記的寡核苷酸探針用作探針，使用較低嚴緊度的雜交和洗滌條件鑑定編碼α-澱粉酶的克隆。
另一種鑑定編碼α-澱粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達載體，如質粒，用所得基因組DNA文庫轉化α-澱粉酶-陰性細菌，然後將經轉化的細菌鋪於含有α-澱粉酶底物的瓊脂上，從而鑑定出表達α-澱粉酶的克隆。
或者，可通過已建立的標準方法合成生產編碼酶的DNA序列，所述方法例如S.L.Beaucage和M.H.Camthers(1981)所述的膦醯胺法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦醯胺法中，可在例如自動化的DNA合成僅中合成寡核苷酸，對其進行純化，退火，再連接並克隆至適當的載體。
最終，DNA序列可以是根據標準技術，通過連接合成的，基因組的或cDNA來源的片段(適當時是對應於完整DNA序列的多個部分的片段)而生產的混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源或混合的基因組和cDNA來源的DNA序列。也可以使用特定的引物，如US 4,683,202或R.K.Saiki等(1988)所述的引物經聚合酶鏈反應(PCR)生產DNA序列。
定點誘變一旦分離出編碼α-澱粉酶的DNA序列，並鑑定出合乎需要的突變位點，可使用合成的寡核苷酸導入突變。這些寡核苷酸含有側翼於所需突變位點的核苷酸序列；在合成寡核苷酸的過程中插入突變的核苷酸。在特定的方法中，在攜有α-澱粉酶基因的載體中產生橋連α-澱粉酶-編碼序列的單鏈DNA缺口。然後，使攜有所需突變的合成核苷酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然後用DNA聚合酶I(Klenow片段)補平其餘缺口，使用T4連接酶連接構建體。該方法的特例描述於Morinaga等(1984)。US 4,760,025公開了通過對盒進行微小的改變而導入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，由於Morinaga法可以導入多種長度的多個寡核苷酸，因此可在任何一次導入甚至更多個突變。
Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導入編碼α-澱粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個步驟產生含有所需突變的PCR片段，所述突變是通過使用化學合成的DNA鏈作為PCR反應的一個引物而導入的。通過用限制性內切核酸酶裂解，可從PCR-產生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，並將該片段重新插入表達質粒。
隨機誘變可在翻譯成本文所示胺基酸序列的基因的至少3個部分中，或在整個基因內適當地進行隨機誘變，所述誘變可以是定域的或區域-特異性的隨機誘變。
利用本領域已知的任何方法，可以方便地對編碼親代α-澱粉酶的DNA序列進行隨機誘變。
關於上文，本發明的另一方面涉及產生親代α-澱粉酶的變體的方法，例如，其中變體相對於親代而言，表現出經改變的或增加的熱穩定性，所述方法包括(a)對編碼親代α-澱粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達α-澱粉酶變體的宿主細胞，所述變體相對於親代α-澱粉酶而言具有經改變的特性(如熱穩定性)。
優選使用添加引物進行本發明上述方法中的步驟(a)。
例如，可使用適當的物理或化學誘變劑，使用適當的寡核苷酸，或通過對DNA序列進行PCR以產生誘變來進行隨機誘變。另外，可使用這些誘變劑的任何組合進行隨機誘變。誘變劑可以是例如誘導鹼基轉換，顛換，倒位，倒頻，缺失和/或插入的試劑。
適用於本發明目的的物理或化學誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，鄰甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當使用這些誘變劑時，一般通過在適於發生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下保溫待誘變的編碼親代酶的DNA序列來進行誘變，然後篩選具有所需特性的突變DNA。
當利用寡核苷酸進行誘變時，在合成待改變位置處的寡核苷酸的過程中，可同時添加寡核苷酸和3個非-親代核苷酸。添加的目的是避免不必要胺基酸的密碼子。可通過任何公開的技術如使用PCR，LCR或適當時使用任何DNA聚合酶和連接酶，將添加的寡核苷酸摻入編碼α-澱粉酶的DNA。
優選使用「恆隨機的添加」進行添加，其中各個位置的野生型和突變的百分比是預先確定好的。另外，添加可以導致優先導入某些核苷酸，從而優先導入一個或多個特定的胺基酸殘基。例如，進行添加後可在每個位置導入90％野生型和10％突變。選擇添加方案的其它考慮基於遺傳學以及蛋白質-結構的限制。可使用DOPE程序(見「材料和方法」部分)制訂添加方案，所述程序可特別地確保不導入終止密碼子。
當使用PCR-產生的誘變時，可在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經化學處理或未經處理的編碼親代α-澱粉酶的基因進行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變株對編碼α-澱粉酶的DNA進行隨機誘變，誘變方法包括例如將含有親代糖基酶的質粒轉化至增變株，培養含有質粒的增變株，從增變株中分離突變的質粒。隨後，將突變的質粒轉化至表達生物。
待誘變的DNA序列可以方便地存在於基因組或cDNA文庫中，所述文庫生產自表達親代α-澱粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在於適當的載體，如質粒或噬菌體上，再與誘變劑一起保溫或要不然暴露於誘變劑中。待誘變的DNA也可存在於宿主細胞中，或者整合於所述細胞的基因組中，或者存在於細胞所攜帶的載體上。最後，待誘變的DNA也可以是分離的形式。應理解接受隨機誘變的DNA序列優選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下可於實施表達步驟b)或篩選步驟c)前方便地擴增突變的DNA序列。可根據本領域已知的方法進行擴增，本發明優選的方法是使用根據親代酶的DNA或胺基酸序列生產的寡核苷酸引物進行PCR擴增。
與誘變劑保溫或暴露於誘變劑之後，通過在允許發生表達的條件下培養攜有突變DNA序列的適當宿主細胞來表達突變的DNA。用於此目的的宿主細胞可以是被突變的DNA序列(任選其存在於載體上)轉化的宿主細胞，或者是在誘變處理的過程中攜有編碼親代酶的DNA序列的宿主細胞。適當宿主細胞的例子如下革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌，淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌；和革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進一步含有能使突變的DNA序列表達的DNA序列。
定域隨機誘變隨機誘變可有利地定域於所述親代α-澱粉酶的一部分。例如，當酶的某些區域被鑑定為對酶的給定特性特別重要時，以及當預期修飾能導致具有改良特性的變體時，定域隨機誘變較為有利。當親代酶的三級結構已被闡明，且所述結構與酶的功能相關時，一般可鑑定出所述區域。
通過使用上述的PCR產生的誘變技術或本領域已知的任何其它適當的技術，可以方便地進行定域的或區域-特異性的隨機誘變。或者，通過例如插入適當的載體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨後可使用上述任何誘變方法對所述部分進行誘變。
提供α-澱粉酶變體的其它方法提供α-澱粉酶變體的其它方法包括本領域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.)和WO 96/00343(NovoNordisk A/S)所述的方法。
本發明α-澱粉酶變體的表達根據本發明，可使用表達載體，以酶的形式表達通過上述方法，或通過本領域已知的任何其它方法產生的編碼變體的DNA序列，所述表達載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號的控制序列，並任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發明α-澱粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能對其方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經常取決於導入該載體的宿主細胞。因此，載體可以是自我複製的載體，即作為染色體外實體存在的載體，所述載體的複製獨立於染色體的複製，所述載體包括例如質粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體。或者，載體可以是當導入宿主細胞時可以整合至宿主細胞基因組，並與整合了該載體的染色體一起複製的載體。
在載體中，DNA序列應該與適當的啟動子序列可操作相連。啟動子可以是在選定宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質的基因。介導編碼本發明α-澱粉酶變體之DNA序列轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的適當啟動子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈黴菌瓊脂酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖澱粉酶基因(amyM)啟動子，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(amyQ)啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉錄，有用的啟動子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶，米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴中性α-澱粉酶，黑麴黴酸穩定的α-澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，米赫根毛黴脂肪酶，米麴黴鹼性蛋白酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴乙醯胺酶。
本發明的表達載體也含有適當的轉錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發明α-澱粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當地得自與啟動子相同的來源。
載體可進一步含有能使載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。所述序列的例子是質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的複製起點。
載體也可含有選擇標記，例如其產物可以補償宿主細胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青黴素，卡那黴素，氯黴素或四環素抗性。另外，載體可含有麴黴屬選擇標記，如amdS，argB，niaD和sC，產生潮黴素抗性的標記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉化來完成選擇。
儘管細胞內表達在某些方面(例如當使用某些細菌作為宿主細胞時)有利，但一般優選在細胞外進行表達。通常，本文所述的芽孢桿菌α-澱粉酶含有允許表達的蛋白酶分泌至培養基的前區。必要時，該前區可被不同的前區或信號序列取代，通過取代編碼各個前區的DNA序列可以方便地實現此目的。
分別連接編碼α-澱粉酶變體的本發明DNA構建體，啟動子，終止子和其它元件，並將它們插入含有複製所需信息的適當載體的方法是本領域技術人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發明DNA構建體或表達載體的本發明細胞可以有利地用作宿主細胞，以重組產生本發明的α-澱粉酶變體。可以方便地通過將編碼變體的本發明DNA構建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構建體轉化細胞。一般認為整合是有利的，因為整合後DNA序列可以在細胞中更加穩定地維持。根據常規方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構建體整合至宿主染色體。或者，可用與不同類型的宿主細胞有關的上述表達載體轉化細胞。
本發明的細胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選其為微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適合的細菌為革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌(B.alkalophilus)，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌，淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細菌的轉化可以被，例如原生質轉化或以感受態細胞本身已知的方式使用該細胞而影響。
酵母生物可優選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌優選屬於麴黴屬，例如，米麴黴或黑麴黴。真菌細胞可用一種方法轉化，該方法涉及原生質形成、原生質轉化、然後細胞壁以其本身已知的方式再生。麴黴屬宿主細胞轉化的適合方法如EP 238 023所述。
在另一方面，本發明涉及生產本發明α-澱粉酶變體的方法，該方法包含在有利於變體生產的條件下培養如上所述宿主細胞以及從細胞和/或培養液中回收變體。
用於培養細胞的培養基可以是適於培養所述宿主細胞，並表達本發明α-澱粉酶變體的任何常規培養基。適當的培養基可以商購，或者可根據公開的配方(例如美國典型培養物保藏中心目錄中所述的配方)生產。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養基與細胞分開，利用諸如硫酸銨等鹽沉澱培養基中的蛋白質成分，接著利用層析法，如離子交換層析，親和層析等，可以從培養基中方便地回收宿主細胞分泌的α-澱粉酶變體。
工業化應用本發明的α-澱粉酶變體具有能進行多種工業應用的有價值的特點。具體地，本發明酶變體適於作為洗衣，碗碟清洗，硬表面清洗的洗滌劑組合物的成分來應用。多種變體可特別有效用於從澱粉生產增甜劑和乙醇中，如燃料，酒類或工業用乙醇，和/或用於織物退漿。傳統澱粉轉化工藝包括澱粉液化和/或糖化加工的條件描述於，例如US 3,912,590和EP專利出版物252730和63 909。
從澱粉生產增甜劑將澱粉轉化為果糖漿的「傳統」過程通常由三個連續的酶處理步驟構成，即液化步驟，然後是糖化步驟和異構化步驟。在液化期間，澱粉在pH5.5-6.2，95-160℃下用α-澱粉酶(例如TermamylTM)降解約2小時而成為糊精。為確保在這些條件下優化酶穩定性，添加了1mM鈣(40ppm游離鈣離子)。
液化步驟之後，通過添加葡糖澱粉酶(例如，AMGTM)和脫支酶如異澱粉酶或支鏈澱粉酶(例如，PromozymeTM)可使糊精轉化為葡萄糖。在此步驟之前，將pH調到4.5以下，保持較高溫度(95℃以上)，使液化α-澱粉酶失活。溫度降低到60℃，加入葡糖澱粉酶和脫支酶。糖化步驟持續24-72小時。
糖化步驟後，pH升高到6-8，優選pH7.5，鈣通過離子交換除去。接著使用例如固定化葡糖異構酶(如SweetzymeTM)將葡萄糖漿轉化為高果糖漿。
此步驟可至少有一個酶性改進降低液化α-澱粉酶的鈣倚賴性。需要加入游離鈣以確保α-澱粉酶的高度穩定性，但是游離鈣會強烈限制葡糖異構酶的活性，且需要通過一種昂貴的單元操作除去到一定程度(游離鈣水平在3-5ppm以下)。如果能避免使用這類操作就可以節約費用，液化步驟可以在未加入游離鈣離子的情況下進行。
為達到這一點，需要一種在低游離鈣濃度(＜40ppm)下仍保持穩定和高活性的鈣倚賴性較小的Termamyl-樣α-澱粉酶。這類Termamyl-樣α-澱粉酶的最佳pH範圍應為4.5-6.5，優選為4.5-5.5。
本發明還涉及一種組合物，其包括，衍生自具有SEQ ID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個本發明變體與衍生自具有SEQ ID NO4中所示序列的地衣芽孢桿菌Termamyl-樣α-澱粉酶的混合物。
此外，本發明還涉及一種組合物，其包括，衍生自具有SEQ ID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多種本發明變體，以及包含SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的一部分和SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的一部分的雜合型α-澱粉酶。後一雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶包含SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的445個C-末端胺基酸殘基和SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的37個N-末端胺基酸殘基。該後一雜合型α-澱粉酶優選含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(採用SEQ ID NO4編號)。優選地，這後一雜合型α-澱粉酶最好含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(採用SEQ ID NO4編號)。在以下實例中，被稱為LE429(示於SEQ ID NO2)的該最後提及的親本雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶用於製備本發明的變體，這些變體可用於本發明的組合物中。
本發明的α-澱粉酶變體或本發明的組合物在本發明的一個方面中可用於澱粉液化，在洗滌劑組合物如洗衣、清洗碗碟和硬表面清洗的洗滌劑組合物中使用，用於乙醇生產，如燃料，酒類和工業用乙醇的生產，用於織物，纖維和衣物的退漿。
材料和方法酶LE174雜合型α-澱粉酶變體LE174是與Termamyl序列即，示於SEQ ID NO4的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶相同的雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶，不同處在於其(成熟蛋白)N-末端35個胺基酸殘基被BAN，即示於SEQ ID NO6的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(成熟蛋白)的N-末端33個胺基酸殘基取代。該LE174進一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(SEQ ID NO4)。
LE429雜合型α-澱粉酶變體與Termamyl序列即，示於SEQ ID NO4的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶相同的雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶，不同處在於其(成熟蛋白)N-末端35個胺基酸殘基被BAN，即示於SEQ ID NO6的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(成熟蛋白)的N-末端33個胺基酸殘基取代。該LE429進一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQ ID NO4)。LE429示於SEQ ID NO2，其通過SOE-PCR(Higuchi等，1988，核酸研究167351)構建。
DextrozymeTME衍生自黑麴黴和Bacillus deramificans(可衍生自NovoNordiskA/S)所選菌株的葡糖澱粉酶(AMG)和支鏈澱粉酶的平衡混合物。
α-澱粉酶變體的發酵和純化攜有相關表達質粒的一株枯草芽孢桿菌菌株在含有-80℃貯存的10微克/毫升卡那黴素的LB-瓊脂平板上劃線接種，並在37℃下過夜培養。將菌落轉移到裝在500ml搖瓶中的添加有10微克/毫升卡那黴素的100ml BPX培養基中。
BPX培養基的組成馬鈴薯澱粉 100g/l大麥粉 50g/lBAN 5000 SKB 0.1g/l酪蛋白酸鈉 10g/l大豆粉(Soy Bean Meal) 100g/lNa2HPO4，12H2O 9g/lPluronicTM0.1g/l培養物在37℃下以270rpm振蕩培養5天。
通過4500rpm離心20-25分鐘除去發酵液中的細胞和細胞碎片。然後將上清液過濾來獲得完全澄清的溶液。濃縮濾液並在UF濾器上進行洗滌(10000截留膜)，再將緩衝液換成20mM醋酸(Acetate)pH5.5。將UF濾液上樣到S-Sepharose F.F上並且在同樣的緩衝液中通過採用0.2MNaCl的逐步洗脫法進行洗脫。洗脫液對10mM Tris pH9.0透析，上樣到Q-Sepharose F.F上，利用0-0.3M NaCl的線性梯度洗脫6個柱體積。收集具有活性(通過Phadebas分析法測定)的餾分，調節pH到pH7.5並通過採用0.5％W/vol.的活性碳處理5分鐘來除去殘留色素。
活性測定-(KNU)一千個α-澱粉酶單位(1 KNU)是指，用Novo Nordisk的在下列條件下測定α-澱粉酶的標準方法所測，每小時分解5.26g澱粉(Merck，AmylumSolubile，Erg.B 6，批號9947275)所需的酶量底物 可溶性澱粉溶劑中鈣含量 0.0043M反應時間 7-20分鐘溫度 37℃pH5.6隻要提出要求就可得到NovoNordisk分析方法(AF9)的詳細描述。
α-澱粉酶活性的測定通過以Phadebas片為底物的方法測定α-澱粉酶活性。Phadebas片(Phadebas澱粉酶試驗，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交聯的不可溶藍色澱粉聚合物，其與牛血清白蛋白和一種緩衝物質相混合併被壓片。
每次測定時，將一個片劑懸浮在含有5ml 50mM Britton-Robinson緩衝液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2，用NaOH將pH調到所需值)的試管中。試驗在所需溫度的水浴中進行。要測定的α-澱粉酶用x ml的50mM Britton-Robinson緩衝液稀釋。1ml的該α-澱粉酶溶液被加到5ml 50mM Britton-Robinsond緩衝液中。澱粉被該α-澱粉酶水解並產生可溶的藍色片段。在620nm下分光光度法測定藍色溶液的吸光度，其是α-澱粉酶活性的函數。
重要的是經10或15分鐘溫育(試驗時間)後在620nm下測定的吸光度是在0.2至2.0個620nm光吸收單位的範圍內。在這一光吸收範圍內活性與光吸收值之間成線性關係(Lambert-Beer定律)。因此必須調節酶的稀釋度以適合這一標準。在一系列特定的條件(溫度、pH、反應時間、緩衝液)下，1mg的給定α-澱粉酶將水解一定量的底物並產生藍色。在620nm下測定顏色的強度。測定的吸光值直接與在所述一系列特定條件下測得的目標α-澱粉酶的比活性成比例(活性/mg純α-澱粉酶蛋白)。
比活性的測定採用Phadebas分析方法(Pharmacia)將比活性測定為活性/mg酶。
測定pH活性圖譜(pH穩定性)將變體保存在20mM TRIS pH7.5，0.1mM，CaCl2中，檢測在30℃，50mMBritton-Robinson，0.1mM CaCl2中進行。使用上述Phadebas試驗在pH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，7.0，8.0，9.5，9.5，10，和10.5下測定pH活性。
測定AGU活性並表示為AGU/mg一個Novo澱粉葡糖苷酶單位(AGU)定義為37℃，pH4.3下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量。此分析方法的詳述(AEL-SM-0131)可要求NovoNordisk提供。
用Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒以修飾的(AEL-SM-0131)方法將活性為測定AGU/ml。標準品AMG-標準品，批次7-1195，195 AGU/ml。
375μL底物(50mM乙酸鈉中加入1％麥芽糖，pH4.3)37℃溫育5分鐘。添加25μL的酶的乙酸鈉稀釋液。10分鐘後，加入100μL 0.25M NaOH終止反應。20μL轉到一96孔微滴板上，加入200μLGOD-Perid溶液。室溫30分鐘後，測定650nm吸光度，參照AMG標準品以AGU/mg計算活性。
活性(AGU/ml)除以蛋白濃度(mg/ml)可算得以AGU/mg表示的比活性。
實施例實施例1本發明Termamyl變體的構建Termamyl(地衣芽孢桿菌α-澱粉酶SEQ ID NO4)由枯草芽孢桿菌中的質粒pDN1528表達。此質粒包含了編碼了Termamyl的完整基因，amyl，其表達其自身啟動子指導。此外，該質粒包含質粒pUB110的複製起點ori和來自質粒pC194的賦予氯黴素抗性的cat基因。pDN1528示於WO 96/23874的圖9中。製備含有SEQ ID NO3編碼區之主要部分的特異性誘變載體。該載體pJeEN1的重要特徵包括來自pUC質粒的複製起點，賦予對氯黴素抗性的cat基因，bla基因的移碼型，所述bla基因的野生型(ampR表型)通常賦予氨苄青黴素抗性。此突變型產生amps表型。質粒pJeEN1示於WO 96/23874的


圖10中，大腸桿菌複製起點ori，bla，cat，Termamyl澱粉酶基因的5』-截短型，以及所選限制性位點都指示在該質粒上。
按照Deng和Nickoloff(1992，Anal.Biochem.200，81-88頁)所述方法將突變引入amyl，不同處在於，帶有「選擇引物」(引物#6616；見下面)的質粒根據轉化的大腸桿菌細胞(該細胞攜有含修復的bla基因的質粒)的ampR表型來選擇，而不採用Deng和Nickoloff所述的利用限制性酶消化的選擇方法。用於誘變的化學品和酶由Stratagene的Chameleon誘變試劑盒(目錄號200509)得到。
在確認變異質粒中的DNA序列後，含有所需改變的截短型基因被作為PstI-EcoRI片段亞克隆至pDN1528，並轉化至蛋白酶和澱粉酶已耗盡的枯草芽孢桿菌SHA273株(述於WO92/11357和WO95/10603中)以表達這種酶變體。
通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體V54WPG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG(SEQ ID NO9)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體A52W+V54WPG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG(SEQID NO10)引物#6616(5』到3』從左到右書寫；P表示5』磷酸)P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C(SEQ ID NO11)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體V54EPGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG(SEQ IDNO12)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體V54MPGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG(SEQ IDNO13)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體V54IPGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG(SEQ IDNO14)
通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體Y290E和Y290KPGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAAC(SEQ ID NO15)Y代表C和T的等量混合物。在位置290出現的編碼穀氨酸或賴氨酸的密碼子由DNA測序證實。
通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)構建Termamyl變體N190FPCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C(SEQ ID NO16)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)構建Termamyl變體N188P+N190FPCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC(SEQ IDNO17)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)構建Termamyl變體H140K+H142DPCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AATTAG(SEQ ID NO18)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體H156YPCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG(SEQ IDNO19)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體A181TPCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC(SEQ ID NO20)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體A209VPCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC(SEQID NO21)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體Q264S
PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTAAAC(SEQ ID NO22)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體S187DPGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC(SEQ ID NO23)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體δ(K370-G371-D372)(即370，371，372號胺基酸缺失)PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC(SEQ IDNO24)通過使用下列誘變引物(5』到3』從左到右書寫)，構建Termamyl變體δ(D372-S373-Q374)PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C(SEQID NO25)用能切割pDN1528質粒兩次，產生1116bp的片段和3850bp的載體部分(即包含該質粒的複製起點)的限制酶ClaI，消化含有A181T的pDN1528質粒樣質粒(即在amyl內含有導致A181T改變之突變的pDN1528)和含有A209V的pDN1528質粒樣質粒(即在amyl內含有導致A209V改變之突變的pDN1528)，可將Termamyl變體A181T和A209V組合為A181T+A209V。包含A209V突變的片段和包含A181T突變的載體部分在瓊脂糖膠上分離後，用QIAquick凝膠提取試劑盒(購買自QIAGEN)純化。將所述片段和載體連接並轉化至上述蛋白酶和澱粉酶耗盡型枯草芽孢桿菌菌株。分析amy+(含澱粉瓊脂平板上的透明區)及氯黴素抗性轉化體的質粒上兩個突變是否並存。
以上述相似的方式，利用限制性內切酶Acc65I和EcoRI將H156Y和A209V相結合，得到H156Y+A209V。
利用限制性內切酶Acc65I和HindIII將H156Y+A209V和A181T+A209V結合為H156Y+A181T+A209V。
通過SOE-PCR法(Higuchi等1988，核酸研究167351)將Termamyl變體H156Y+A181T+A209V的成熟部分的35個N-末端殘基用解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(SEQ ID NO4)(在此上下文中稱為BAN)33個N-末端殘基取代，如下所示
引物19364(5』-3』排列)CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTAAAT GGC ACG CTG(SEQ ID NO26)引物19362CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAAATG TTC CG(SEQ ID NO27)引物19363CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC(SEQID NO28)引物1CCTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC(SEQ ID NO29)採用來自Boehringer Mannnheim的Pwo熱穩定聚合酶按照生產商的指導進行標準的PCR，聚合酶鏈式反應，溫度循環為94℃5分鐘，(94℃30秒，50℃45秒，72℃1分鐘)的25個循環，72℃10分鐘。
在首輪PCR (PCR1)中，用引物19364和19362在含有編碼解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因的DNA片段上對約130bp的片段進行擴增。
在另一輪PCR(PCR2)中，用引物19363和1C在模板pDN1528上對約400bp的片段進行擴增。
PCR1和PCR2用瓊脂糖凝膠純化，並在PCR3中用作模板，以引物19364和1C獲得約520bp的片段。此片段因此包含編碼BAN N-末端的一段DNA，所述BAN與編碼Termamyl的DNA的一部分從第35個胺基酸融合。
通過限制性內切酶PstI和SacII消化，如上所述進行枯草芽孢桿菌的連接以及轉化，將該520bp片段亞克隆至pDN1528樣質粒(包含編碼Termamyl變體H156Y+A181T+A209V的基因)。在來自amy+及氯黴素抗性轉化體的提純質粒中進行DNA測序，以確定在限制性位點PstI和SacII間的DNA序列。
最終的構建體包含來自BAN的正確的N-末端和H156Y+A181T+A209V，將其表示為BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V。
通過進行上述誘變，但用編碼Termamyl變體BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列取代pJeEN1中的amyL序列，而將N190F與BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V組合為BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V。
通過進行上述誘變，但將pJeEN中的amyL序列變為編碼Termamyl變體BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列，而將Q264S與BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V組合為BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V+Q264S。
利用限制性內切酶BsaHI(將BsaHI位點引至A209V突變附近)和PstI，將BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V+Q264S和BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V組合為BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S。
通過進行上述誘變使I201F與BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S組合為BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQ ID NO2)。使用誘變引物AM100，引入I201F取代，同時除去ClaI限制性位點，其有利於突變體的簡便的穩定定位(pin-point)。
引物AM1005』GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3』(SEQ ID NO30)實施例2本發明具有改變的酶解模式的Termamyl-樣α-澱粉酶變體的構建熱穩定的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶變體含有示於SEQ ID NO4的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶445個C-末端胺基酸殘基和示於SEQ ID NO6的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶37個N-末端胺基酸殘基，並且進一步含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(此變體的構建如實施例1所述，胺基酸序列示於SEQ IDNO2)，此變體在接近分支點處酶解底物的能力減小。
在進一步改進該α-澱粉酶變體在接近分支點處減小的酶解底物能力的嘗試中，採用Sarkar和Sommer，1990(生物技術(BioTechnigques)8404-407)所述的大範圍引物(mega-primer)法進行定點誘變。
LE313的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+V54N用基因特異性引物27274和誘變引物AM115通過PCR擴增pDN1528樣質粒(在編碼SEQ ID NO4的澱粉酶的基因中攜有突變BAN(1-35)+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S)中約440bp的DNA片段。
此440bp片段經瓊脂糖凝膠純化，並作為大範圍引物與引物113711一起以相同模板進行第二次PCR中。
所得約630bp的片段經限制性內切酶EcoRV和Acc65I消化，所得約370bp的DNA片段經純化並連接至以相同酶消化的pDN1528樣質粒。枯草芽孢桿菌SHA273(低澱粉酶和蛋白酶)的感受態細胞用該連接物轉化，通過DNA測序檢測氯黴素抗性轉化體，以證實質粒上存在正確的突變。
引物272745』CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3』(SEQ ID NO31)引物1B5』CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3』(SEQ ID NO32)引物AM1155』GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3』(SEQ ID NO33)LE314的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S以相似的方式進行，但使用的誘變引物是AM116。
AM1165』GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3』(SEQ ID NO34)LE315的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S+V54N以相似的方式進行，但使用的誘變引物是AM117。
AM1175』GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3』(SEQ IDNO35)LE316的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+T49L以相似的方式進行，但使用的誘變引物是AM118。
AM1185』GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3』(SEQ ID NO36)LE317的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+T49L+G107A以相似的方式進行，但同時使用誘變引物AM118和AM119。
AM1195』CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3』(SEQ ID NO37)LE318的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S+V54N+T49L+G107A以相似的方式進行，但同時使用誘變引物AM120和AM119。
AM1205』GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC3』(SEQ ID NO38)LE319的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S+V54N+T49L以相似的方式進行，但使用誘變引物AM120。
LE320的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+G107A以相似的方式進行，但使用誘變引物AM119。
LE322的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+Q51R+A52S以相似的方式進行，但使用誘變引物AM121。
AM1215』GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3』(SEQ ID NO39)LE323的構建BAN/Termamyl雜合型+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52N以相似的方式進行，但使用誘變引物AM122。
AM1225』GAACGAGCCAAA CGACGTGGGCTACGG 3』(SEQ ID NO40)實施例3LE429變體的檢驗(糖化)標準反應條件底物濃度 30％w/w溫度 60℃初始pH(60℃) 5.5酶劑量葡糖澱粉酶0.18 AGU/g DS支鏈澱粉酶0.06 PUN/g DSα-澱粉酶 10μg酶/gDSDextrozymeTME用於提供葡糖澱粉酶和支鏈澱粉酶活性。
糖化底物的製備如下，在去離子水中溶解普通玉米澱粉，調整至乾物質含量約30％w/w。pH調到5.5(在60℃測定)，將相當於10g乾重的底物等分樣移入藍蓋玻璃搖瓶中。
然後將搖瓶置於60℃平衡的振動水浴中，加入酶。如果需要，再次將pH調整至5.5。糖化48小時後取樣；將pH調整至3.0，然後沸水浴15分鐘使酶失活。冷卻後，樣品用0.1g混合床離子交換樹脂(BIO-RAD 501 X8(D))在旋轉混合器上處理30分鐘，除去鹽和可溶性N。過濾後，經HPLC測定糖組成。得到下面結果此變體的親本α-澱粉酶是LE 429。
與對照相比，液化過程中，本發明活性α-澱粉酶變體的存在導致了潘糖水平的降低(DP3)。
尤其，LE429的T49L+G107A變體和LE429的A52S+V54N+T49L變體，分別導致潘糖水平的顯著降低(DP3)。如果這些α-澱粉酶變體用於澱粉液化，將不需要在糖化開始之前使酶失活。
實施例4LE429變體的液化和糖化在相同條件下對其它多個LE429變體重複實施例3的實驗。
結果如下變體/蔗糖圖譜DP1DP2 DP3 DP4+T4 9V+G107A95.9％ 1.72％ 1.27％1.11％T4 9Y+G107A95.3％ 1.73％ 1.29％1.65％T4 9N+G107A95.7％ 1.64％ 1.51％1.18％
T49L+A52S+G107A95.7％ 1.73％ 0.95％ 1.67％T49L+A52T+G107A95.8％ 1.66％ 1.03％ 1.48％T49L+A52F+G107A95.7％ 1.69％ 1.16％ 1.42％T49L+A52L+G107A95.5％ 1.70％ 1.40％ 1.38％T49L+A52I+G107A95.9％ 1.72％ 1.31％ 1.07％T49L+A52V+G107A94.7％ 1.69％ 1.16％ 2.44％T49L+A52V+G107A+A111V 94.5％ 1.75％ 0.72％ 2.99％LE429 94.9％ 1.71％ 1.85％ 1.51％實施例5對多個LE429變體重複實施例3的實驗，但液化在95℃，pH6.0進行，糖化在60℃，pH4.5，40ppm CaCl2下進行，然後使酶失活。下述變體是LE 429變體。實驗結果如下變體/蔗糖圖譜 DP4+DP3 DP2 DP1T49F1.150.921.8396.12T49D+G107A 0.841.031.8296.3T49I+G107A 0.97o.641.8496.55T49L+G107A 0.960.811.8296.42T49L+A52S+G107A 1.370.751.8896.01T49L+A52T+G107A 0.870.811.8 96.52T49L+A52F+G107A 0.980.831.8796.31T49V+G107A 0.650.8 2.1396.43T49Y+G107A 0.830.941.8996.35LE429 1.161.211.7795.87參考文獻Klein，C.，等，生物化學1992，31，8740-8746，Mizuno，H.，等，分子生物學雜誌(J.MoI.Biol.)(1993)234，1282-1283，Chang，C.，等，分子生物學雜誌(J.MoI.Biol.)(1993)229，235-238，
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序列表110Novo Nordisk A/S12013016040170PatentIn Ver.2.121012111443212DNA213解澱粉芽孢桿菌220221CDS222(1)..(1443)400 1gta aat ggc acg etg atg cag tat ttt gaa tgg tat acg ccg aac gac 48Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15ggc cag cat tgg aaa cga ttg cag aat gat gcg gaa cat tta tcg gat 96Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp20 25 30atc ggt att act gcc gtc tgg att ccc ccg gca tat aag gga acg agc 144Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser35 40 45caa gcg gat gtg ggc tac ggt gct tac gac ctt tat gat tta ggg gag 192Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu50 55 60ttt cat caa aaa ggg acg gtt cgg aca aag tac ggc aca aaa gga gag 240Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu65 70 75 80ctg caa tct gcg atc aaa agt ctt cat tcc cgc gac att aac gtt tac 288Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr85 90 95ggg gat gtg gtc atc aac cac aaa ggc ggc gct gat gcg acc gaa gat 336Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp100 105 110gta acc gcg gtt gaa gtc gat ccc gct gac cgc aac cgc gta att tca 384Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser115 120 125gga gaa cac cta att aaa gcc tgg aca cat ttt cat ttt ccg ggg cgc 432Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg130 135 140ggc agc aca tac agc gat ttt aag tgg tat tgg tac cat ttt gac gga 480Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160acc gat tgg gac gag tcc cga aag ctg aac cgc atc tat aag ttt caa 528Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln165 170 175ggg aag act tgg gat tgg gaa gtt tcc aat gaa ttc ggc aac tat gat 576Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp180 185 190tat ttg atg tat gcc gac ttt gat tat gac cat cct gat gtc gta gca 624Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala195 200 205gag att aag aga tgg ggc act tgg tat gcc aat gaa ctg caa ttg gac 672Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp210 215 220ggt ttc cgt ctt gat gct gtc aaa cac att aaa ttt tct ttt ttg cgg 720Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg225 230 235 240gat tgg gtt aat cat gtc agg gaa aaa acg ggg aag gaa atg ttt acg 768Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr245 250 255gta gct gag tac tgg tcg aat gac ttg ggc gcg ctg gaa aac tat ttg 816Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu260 265 270aac aaa aca aat ttt aat cat tca gtg ttt gac gtg ccg ctt cat tat 864Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr275 280 285cag ttc cat gct gca tcg aca cag gga ggc ggc tat gat atg agg aaa 912Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys290 295 300ttg ctg aac ggt acg gtc gtt tcc aag cat ccg ttg aaa tcg gtt aca 960Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr305 310 315 320ttt gtc gat aac cat gat aca cag ccg ggg caa tcg ctt gag tcg act 1008Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr325 330 335gtc caa aca tgg ttt aag ccg ctt gct tac gct ttt att ctc aca agg 1056Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg340 345 350gaa tct gga tac cct cag gtt ttc tac ggg gat atg tac ggg acg aaa 1104Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys355 360 365gga gac tcc cag cgc gaa att cct gcc ttg aaa cac aaa att gaa ccg 1152Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro370 375 380atc tta aaa gcg aga aaa cag tat gcg tac gga gca cag cat gat tat 1200Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr385 390 395 400ttc gac cac cat gac att gtc ggc tgg aca agg gaa ggc gac agc tcg 1248Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser405 410 415gtt gca aat tca ggt ttg gcg gca tta ata aca gac gga ccc ggt ggg 1296Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly420 425 430gca aag cga atg tat gtc ggc cgg caa aac gcc ggt gag aca tgg cat 1344Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His435 440 445gac att acc gga aac cgt tcg gag ccg gtt gtc atc aat tcg gaa ggc 1392Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly450 455 460tgg gga gag ttt cac gta aac ggc ggg tcg gtt tca att tat gtt caa 1440Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln465 470 475 480aga 1443Arg2102211481212PRT213解澱粉芽孢桿菌400 2Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp20 25 30Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser35 40 45Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu50 55 60Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu65 70 75 80Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr85 90 95Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp100 105 110Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser
115 120 125Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg130 135 140Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln165 170 175Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp180 185 190Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala195 200 205Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp210 215 220Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg225 230 235 240Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr245 250 255Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu260 265 270Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr275 280 285Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys290 295 300Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr305 310 315 320Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr325 330 335Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg340 345 350Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys355 360 365Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro370 375 380Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr385 390 395 400Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser405 410 415Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly420 425 430Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His435 440 445Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly450 455 460Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln465 470 475 480Arg21032111920212DNA213地衣芽孢桿菌220221CDS222(421)..(1872)4003cggaagattg gaagtacaaa aataagcaaa agattgtcaa tcatgtcatg agccatgcgg 60gagacggaaa aatcgtctta atgcacgata tttatgcaac gttcgcagat gctgctgaag 120agattattaa aaagctgaaa gcaaaaggct atcaattggt aactgtatct cagcttgaag 180aagtgaagaa gcagagaggc tattgaataa atgagtagaa gcgccatatc ggcgcttttc 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ggctacggtg c 412103921128212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40039gaacgagccg atcggacgtg ggctacgg282104021128212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物40040gaacgagcca aaacgacgtg ggctacgg28
權利要求
1.一種親本Termamyl-樣α-澱粉酶的變體，其在選自下組的一或多個位置處包含改變W13，G48，T49，S50，Q51，A52，D53，V54，G57，G107，G108，A111，S168，M197，其中(a)所述每一改變是(i)在佔據此位置的胺基酸下遊插入胺基酸，(ii)佔據此位置的胺基酸的缺失，或(iii)佔據此位置的胺基酸用另一胺基酸取代，(b)所述變體具有α-澱粉酶活性且(c)每一位置對應於具有SEQ ID NO4之胺基酸序列的親本Termamyl-樣α-澱粉酶胺基酸序列的位置。
2.權利要求1的變體，其包含一個突變，該突變的位置對應於SEQ IDNO4中所示胺基酸序列中至少一個下列突變V54N，A52S，A52S+V54N，T49L，T49+G1 07A，A52S+V54N+T49L+G107A，A52S+V54N+T49L，G107A，Q51R，Q51R+A52S，A52N；或T49F+G107A，T49V+G107A，T49D+G107A，T49Y+G107A，T49S+G107A，T49N+G107A，T49I+G107A，T49L+A52S+G107A，T49L+A52T+G107A，T49L+A52F+G107A，T49L+A52L+G107A，T49L+A52I+G107A，T49L+A52VG107A；或T49V，T49I，T49D，T49N，T49S，T49Y，T49F，T49W，T49M，T49E，T49Q，T49K，T49R，A52T，A52L，A52I，A52V，A52M，A52F，A52Y，A52W，V54M，G107V，G107I，G107L，G107C。
3.權利要求1或2的變體，其包含一個突變，該突變的位置對應於SEQID NO4中所示胺基酸序列中的至少一個下列突變W13F，L，I，V，Y，A；G48A，V，S，T，I，L；*48aD或*48aY(即D或Y的插入)；T49X；*49aX(即任何胺基酸殘基的插入)；S50X，尤其D，Y，L，T，V，I；Q51R，K；A52X，尤其A52S，N，T，F，L，I，V；D53E，Q，Y，I，N，S，T，V，L；V54X，尤其V54I，N，W，Y，F，L；G57S，A，V，L，I，F，Y，T；G107X，尤其G107A，V，S，T，I，L，C；G108X，尤其G108A，V，S，T，I，L；A111V，I，L；S168Y；M197X，尤其Y，F，L，I，T，A，G。
4.權利要求1-3中任一項的變體，其包含下列突變，所述突變對應於SEQ ID NO4中所示胺基酸序列中的至少一個下列突變T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A
5.權利要求1-4的變體，其進一步含有G108A。
6.權利要求1-5的變體，其包含下列突變，所述突變對應於SEQ ID NO4中所示胺基酸序列中的至少一個下列突變T49L+G107A；T49I+G107A；T49L+G107A+V54I；T49I+G107A+V54I；A52S+V54N+T49L+G107A；A52S+V54I+T49L+G107A；A52S+T49L+G107A；A52T+T49L+G107A；A52S+V54N+T49I+G107A；A52S+V54I+T49I+G107A；A52S+T49I+G107A；T49L+G108A；T49I+G108A；T49L+G108A+V54I；T49I+G108A+V54I
7.權利要求1-6中任一項的變體，其中該變體與親本α-澱粉酶相比，降低了在靠近分支點酶解寡糖底物的能力。
8.權利要求1-7中任一項的變體，其還顯示了相對於親本Termamyl-樣α-澱粉酶改進的底物特異性和/或改進的比活性。
9.權利要求1-8中任一項的變體，其中親本α-澱粉酶是SEQ ID NO4和SEQ ID NO6的雜合型α-澱粉酶。
10.權利要求1-9中任一項的變體，其中親本雜合型α-澱粉酶是含有SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的445個C-末端胺基酸殘基和SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的37個N-末端胺基酸殘基的雜合型α-澱粉酶。
11.權利要求1-10中任一項的變體，其中親本雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶還含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(採用SEQ IDNO4中的編號)或LE174。
12.權利要求1-11中任一項的變體，其中親本雜合型Termamyl-樣α-澱粉酶還含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(採用SEQ IDNO4中的編號)或LE429。
13.DNA構建體，其含有編碼權利要求1-12中任一項之α-澱粉酶變體的DNA序列。
14.重組表達載體，其攜有權利要求13的DNA構建體。
15.用權利要求13的DNA構建體或權利要求14的載體轉化的細胞。
16.權利要求9的細胞，它是微生物，具體為細菌或真菌，如革蘭氏陽性細菌如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌。
17.一種組合物，其包括(i)具有SEQ ID NO4中所示序列的地衣芽孢桿菌α-澱粉酶，與具有SEQID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個如權利要求1-12所述變體的混合物；或(ii)具有SEQ ID NO8中所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶，與衍生自一或多個其它親本Termamyl-樣α-澱粉酶的一或多個如權利要求1-12所述變體的混合物；或(iii)具有SEQ ID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個如權利要求1-12所述變體，與衍生自一或多個其它親本Termamyl-樣α-澱粉酶的一或多個本發明變體的混合物。
18.一種組合物，其包括具有SEQ ID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個如權利要求1-12所述變體，與衍生自地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO4中所示序列之α-澱粉酶的Termamyl-樣α-澱粉酶的混合物。
19.一種組合物，其包括具有SEQ ID NO8中所示序列之嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個如權利要求1-12所述變體，與含有SEQ IDNO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶之一部分和SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶之一部分的雜合型α-澱粉酶，的混合物。
20.一種組合物，其包括衍生自含有SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶之一部分和SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶之一部分的雜合型α-澱粉酶(作為親本Termamyl-樣α-澱粉酶)的一或多個如權利要求1-12所述變體的混合物。
21.權利要求20的組合物，其中雜合型α-澱粉酶是包含SEQ ID NO4中所示地衣芽孢桿菌α-澱粉酶的445個C-末端胺基酸殘基和SEQ ID NO6中所示解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的37個N-末端胺基酸殘基的雜合型α-澱粉酶。
22.權利要求21的組合物，其中雜合型α-澱粉酶進一步含有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(採用SEQ ID NO4的編號)或LE174。
23.權利要求21的組合物，其中雜合型α-澱粉酶進一步含有下列突變如SEQ ID NO2所示的H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F或LE429。
24.一種產生親本Termamyl-樣α-澱粉酶的變體的方法，該變體相對於所述親本表現出在靠近分支點酶解底物的能力減小，並且進一步表現出底物特異性改進和/或比活性改進，該方法包括(a)對編碼親本Termamyl-樣α-澱粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達步驟(a)所得突變的DNA序列，並且(c)篩選表達突變的α-澱粉酶的細胞，所表達的酶相對於親本α-澱粉酶提高了低pH和低鈣濃度下的穩定性。
25.權利要求1-12中任一項的α-澱粉酶變體或權利要求17-23中任一項的組合物的應用，所述應用為用於澱粉液化；用於洗滌劑組合物，如洗衣、碗碟清洗和硬表面清洗組合物中；用於乙醇生產，如燃料、酒類和工業用乙醇的生產；用於織物，纖維或衣物的退漿。
全文摘要
本發明涉及親本Termamy1－樣α澱粉酶的變體,此變體表現了改變的特性,尤其降低了靠近分支點酶解底物的能力,而且改進了底物特異性和/或改進了相對於親本α－澱粉酶的比活性。
文檔編號C12P19/14GK1346404SQ00805949
公開日2002年4月24日 申請日期2000年3月28日 優先權日1999年3月30日
發明者卡斯滕·安德森, 克裡斯特爾·T·喬根森, 亨裡克·比斯加德-弗蘭岑, 艾倫·斯文德森, 索倫·傑拉爾夫 申請人:諾維信公司