一種促進雞免疫狀況的中藥組合物及其製備方法與流程

2023-06-29 01:13:51 1

本發明屬於農業養殖領域，涉及一種促進雞免疫狀況的中藥組合物及其製備方法，特別地涉及以滸苔和白禿馬勃為活性原料藥物的組合物在禽類飼料添加劑以及禽類疾病控制中的用途。
背景技術：
：禽類特別是肉雞的養殖中最重要的內容是疫病的預防與治療，儘管生產實踐中有各種藥物可以治療禽類疾病，但疾病預防也十分重要。疾病的預防主要分特異性病原的預防，比如各種疫苗的接種。還有非特異性的增強免疫力。能夠增強免疫力的添加劑可以促進禽類生產性能，中藥免疫調節劑可以提高禽類免疫力，不會產生毒副作用和耐藥性等問題，在禽類生產中越來越重要。滸苔(entermorphaprolifera)俗稱苔條、海苔，綠藻門綠藻綱石蓴目石蓴科，是石蓴科的主要屬種。常見種類有緣管滸苔、扁滸苔、條滸苔，在我國野生藻類中資源豐富，在東南沿海均有分布。滸苔在我國作為食物和藥材具有悠久的歷史，寧波奉化溪口的「千層餅」，就是以幹滸苔磨成的粉為原料做成的，其工藝已有100多年歷史。滸苔還可供藥用，中醫藥理研究認為：「滸苔味鹹、寒、具有涼血、清熱、消炎、解毒和軟堅散結的功能.」在《本草綱目》、《隨息居飲食譜》和《海藥本草》中均有記載。白禿馬勃菌(calvatiacandida)，別名白馬勃，是擔子菌綱、灰包目、灰包科、馬勃屬的食藥用真菌，是我國著名的藥用真菌之一，主要分布於我國山西、黑龍江、河北、新疆、陝西、甘肅、遼寧等地區。子實體小，扁球形，近球形，梨形，淺棕灰色，並有發達的根狀的菌絲索。外包被薄，粉狀，有斑紋，內包被堅實而脆。孢子體蜜黃色到淺茶色，孢子球形，淺青黃色，直徑4-5μm。光滑或有極細的小疵，常殘留有小柄。幼時可食用，老後藥用。白馬勃含有賴氨酸、蛋氨酸等人體必需的八種胺基酸以及馬勃素、麥角固醇、類脂、抗敗血酸、脫氫抗敗血酸和白馬勃多糖等。由於其優良的食療保健作用，國際市場對該菌的需求不斷增加。主要是用作清熱解毒的藥品，其主要有抑菌、止血、殺蟲、抗腫瘤、消腫、解毒、清肺、鎮痛、抗炎、治咳嗽等作用。現有技術中未見白禿馬勃菌在禽類養殖或疫病防治中的用途的報導，更未見滸苔與白禿馬勃作為活性成分的組合物的報導。技術實現要素：為了解決至少上述問題，本發明提供了一種中藥組合物，所述中藥組合物的活性藥物原料包括：滸苔和白禿馬勃菌。在一些實施方案中，所述中藥組合物的製備方法如下：(1)滸苔提取物的製備a.水提：將滸苔水煮，而後過濾，將所得濾液濃縮。b.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入93-97％乙醇，靜置醇沉。c.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，取出沉澱，沉澱依次用80-87％乙醇、93-97％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得滸苔提取物。(2)白禿馬勃菌提取物的製備i.水提：將白禿馬勃水煮，而後過濾，將所得濾液濃縮。ii.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入93-97％乙醇，靜置醇沉。iii.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，取出沉澱，沉澱依次用80-87％乙醇、93-97％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得白禿馬勃菌提取物。(3)中藥組合物的配置將步驟(1)製備的滸苔提取物與步驟(2)製備的白禿馬勃提取物混合。在一些實施方案中，所述中藥組合物的製備方法如下：(1)滸苔提取物的製備a.水提：將滸苔樣品用自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾；將濾液濃縮至其體積的1/4到1/3。b.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入1-5倍體積的93-97％乙醇，3-5℃靜置醇沉。c.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3000-5000rpm離心10-30min，取出沉澱，沉澱依次用80-87％乙醇、93-97％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得滸苔提取物。(2)白禿馬勃菌提取物的製備i.水提：將白禿馬勃菌樣品用自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾；將濾液濃縮至其體積的1/4到1/3。ii.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入1-5倍體積的93-97％乙醇，3-5℃靜置醇沉。iii.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3000-5000rpm離心10-30min，取出沉澱，沉澱依次用80-87％乙醇、93-97％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得白禿馬勃菌提取物。(3)中藥組合物的配置將步驟(1)製備的滸苔提取物與步驟(2)製備的白禿馬勃提取物按重量比1:100-100:1的比例混合。在一些實施方案中，所述中藥組合物的製備方法如下：(1)滸苔提取物的製備a.水提：將滸苔樣品用自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾；將濾液濃縮至其體積的1/4到1/3。b.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入4倍體積的95％乙醇，4℃靜置過夜醇沉。c.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3500rpm離心15min，取出沉澱，沉澱依次用85％乙醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得滸苔提取物。(2)白禿馬勃菌提取物的製備i.水提：將白禿馬勃菌樣品用自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾；將濾液濃縮至其體積的1/4到1/3。ii.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入4倍體積的95％乙醇，4℃靜置過夜醇沉。iii.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3500rpm離心15min，取出沉澱，沉澱依次用85％乙醇、95％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得白禿馬勃菌提取物。(3)中藥組合物的配置將步驟(1)製備的滸苔提取物與步驟(2)製備的白禿馬勃提取物按重量比3-7的比例混合。在一些實施方案中，所述中藥組合物的製備方法如下：a.水提：將滸苔樣品與白禿馬勃樣品用按重量比1:100-100:1的比例混合，自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾；將濾液濃縮至其體積的1/4到1/3。b.醇沉：將濃縮的濾液濃縮至一定體積後，加入1-5倍體積的93-97％乙醇，3-5℃靜置醇沉。c.乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3000-5000rpm離心10-30min，取出沉澱，沉澱依次用80-87％乙醇、93-97％乙醇、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得所述中藥組合物提取物。在一些實施方案中，所述滸苔用整株滸苔，所述白禿馬勃菌用菌絲體。本發明還提供了上述任一種中藥組合物在製備禽類飼料添加劑中的用途。本發明還提供了上述任一種中藥組合物在製備用於改善禽類免疫性能的飼料添加劑或藥物中的用途。本發明還提供了上述任一種中藥組合物在製備禽類疫苗佐劑或免疫增強劑中的用途。本發明還提供了上述任一種中藥組合物在製備能夠通過提高il-2、il-6，ifn-γ中任一種、任兩種或其三種的濃度而治療、預防或改善禽類的疾病或亞健康狀況或降低禽類患病風險的藥物、飼料添加劑或保健品中的用途。將該組合物加入飼料飼養肉雞可以有效改善肉雞的生長性能，提高免疫分子指標，提高免疫臟器指數。因此，該中藥組合物可以用作禽類特別是肉雞的飼料添加劑，增強其免疫力。具體實施方式為了更好的解釋本發明的技術方案，下面詳細介紹本發明的各個實施例。以下實施例用於進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的固定或限制。若未特別指明，實施例中所用的技術特徵可以替換為具有在不背離發明構思前提下等同或相似功能或效果的其他本領域已知的技術特徵。1.實驗材料1.1滸苔提取物的製備(1)水提：整株滸苔樣品用自來水衝洗，烘製恆重後，水浴鍋內恆溫水煮，而後用紗布過濾。將濾液濃縮至小體積，以第一組提取後所得濾液體積為準，各組均濃縮到其體積的1/4到1/3。(2)濃縮後醇沉：濃縮至一定體積後，加入4倍體積的95％乙醇，4℃靜置過夜。(3)乾燥：醇沉後倒出上清，將沉澱離心，3500rpm離心15min，取出沉澱，沉澱依次用85％、95％、無水乙醇、乙醚脫水，p2o5真空乾燥過夜，即得滸苔提取物。1.2滸苔提取物的表徵(1)糖含量的測定以標準葡萄糖作標準曲線，酚-硫酸法測總糖含量。(2)樣品多糖含量的測定將滸苔多糖各取5mg，定容至50ml，然後取乾燥潔淨試管，將0.1mg/ml糖溶液，6％苯酚溶液，濃硫酸依次按l：0.5：2.5的比例加入，混勻，在沸水浴中加熱15min後冷卻，靜止，每個樣品平行做三管，蒸餾水作對照，然後在490nm下測od值，所得數值取平均值對照標準曲線可得多糖含量。(3)蛋白質含量用凱氏定氮法測得蛋白質含量。(4)氣相色譜(gc)分析粗多糖gc分析表明，其水溶性多糖組成為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸。(5)sepharosecl-6b柱層析檢查經sepharosecl-6b(1.5×90cm)柱層析，酚-硫酸法測多糖分子量分布，稱重面積百分比。以各最高峰od值查測分子量標準曲線，得各糖峰分子量再分別乘各自佔總體積的面積，百分數相加即為平均分子量。1.2白禿馬勃菌的提取物與滸苔多糖提取物的製備方法相同，僅中藥材料使用白禿馬勃菌菌絲體。1.3中藥組合物的製備1.1中滸苔提取物與1.2中白禿馬勃菌的提取物按照需要的重量比混合作為組合物，用於飼餵動物。2試驗動物及飼養條件本試驗所用動物為健康愛拔益加(aa)肉雞，北京華都肉雞公司提供，選用1日齡肉雞開始分組試驗，每組6個重複，每個重複10隻。飼養試驗在中國科學院動物研究所實驗中心進行。飼糧參照我國《肉雞飼養標準》(ny/t33—2004)配製，其組成及營養水平見表1。肉仔雞詞養在三層鐵籠內，前兩周使用飲水器和料盤，後四周使用全塑水槽與料槽，自由採食和飲水。參考肉雞飼養管理手冊，第1周溫度為32℃，此後每周降低3℃，直到23℃並維持。溼度1～4周維持在60％～70％，5～6周50％～60％。光照時間前兩周24h，後4周22h。試驗前雞舍進行充分衝洗和嚴格消毒，按常規的肉仔雞免疫程序進行免疫。表1試驗飼糧組成和營養水平(風乾基礎)(％)1)維生素預混料為每千克飼糧提供：va12500iu，vd34000iu，ve10iu，vk30.5mg，vb11.8mg，vb24.0mg，vb63.0mg，vb1210μg，泛酸11mg，煙酸55mg，葉酸0.5mg，生物素0.12mg；2)礦物質元素預混料為每千克飼糧提供：cu8mg，zn75mg，fe80mg，mn100mg，i0.85mg，se0.25mg。3藥效測定3.1用藥方法本發明是在飼料中添加相應的中藥成分然後測定不同指標的。為了方便在表格中表示，使用了代號：c為對照組，飼餵基礎日糧，期成分如表1所示；d1、d2代表在日糧中分別添加0.1％、0.8％重量的滸苔提取物；e1、e2代表在日糧中分別添加0.1％、0.8％重量的白禿馬勃提取物；f1、f2代表在日糧中分別添加0.1％重量的滸苔提取物和0.1％重量的白禿馬勃提取物的組合物，以及0.8％重量的滸苔提取物和0.8％重量的白禿馬勃提取物的組合物。試驗期42d，分前期育雛階段(1～21d)和後期育肥階段(22～42d)兩個階段。3.2生長性能指標的測定肉雞14、28和42日齡時，於稱重前1天22:00開始禁食，期間可自由飲水，次日08:00以重複為單位空腹稱重，計算平均日增重。試驗期間以重複為單位記錄第1～14d、15～28d、29～42d的耗料量、雞重量及雞隻數，得出肉雞的平均日採食量，計算料重比。結果如表2-4所示。3.3免疫學指標的測定肉雞42日齡時，每重複隨機抽取2隻雞，用一次性採血針翼下靜脈採血5ml注入乾淨促凝離心管內，常溫下傾斜靜置，製備血清，待血清析出後，以3000r/min離心l0min，吸取上清，分裝於eppendorf管中，於-80℃冰箱中保存。細胞因子(包括il-2、il-6、ifn-γ)和新城疫抗體效價的檢測均採用上述製備的血清進行檢測，細胞因子採用雙抗體夾心法進行elasa試驗，酶標儀(synergyh1型號，biotek公司,美國)測定吸光度值(od值)，最後通過標準曲線計算血清中細胞因子的濃度，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，並嚴格按照說明書進行操作。新城疫抗體免疫後效價採用hi試驗測定，結果以log2的平均值表示。淋巴細胞轉化率用全血進行檢測，將上述每重複隨機抽取的2隻雞翼下靜脈採血5ml，注入edta抗凝的離心管內，並於採集後2小時內在超淨臺中分離淋巴細胞並進行細胞培養，最後採用四甲基偶氮唑鹽(mtt)法檢測吸光度值，結果以刺激指數(si值)表示；免疫器官指數的測定是將上述42日齡時每重複採血完成後的2隻雞頸靜脈放血，屠宰剖殺後迅速剝離兩側胸腺、脾臟和法氏囊，剔除附著組織，用吸水紙拭去表面液體，準確稱重，計算胸腺、脾臟和法氏囊指數：免疫器官指數(mg/g)＝免疫器官重量(mg)/活體重(g)。結果參見表5-124結果與分析4.1滸苔多糖對肉雞生長性能的影響表2表3表4從表2-4中的數據可以看出，兩種中藥成分均能降低料重比，且組合物比單一成分降低的效果更好，發生了協同增效作用，可以起到節省飼料的效果。2.2滸苔多糖對肉雞血清細胞因子的影響表5組別肉雞血清il-2(ng/l)c7.05d17.15d28.40e17.21e27.63f17.37f28.52表6組別血清il-6(ng/l)c3.44d13.49d24.48e14.12e25.17f14.22f26.16表7組別血清ifn-γ(ng/l)c28.04d138.02d245.18e135.69e243.15f144.37f259.26從表5-7中的數據可以看出，兩種中藥成分均能提高肉雞血清il-2、il-6、ifn-γ，且組合物比單一成分提高的程度更大，發生了協同增效作用，可以起到提高免疫力的效果。2.3滸苔多糖對肉雞新城疫抗體滴度的影響表8組別血清新城疫抗體滴度(log2)c4.61d15.42d26.61e15.35e26.43f16.21f27.45從表8中的數據可以看出，兩種中藥成分均能提高肉雞血清新城疫抗體滴度，且組合物比單一成分提高的程度更大，發生了協同增效作用，可以起到提高免疫力的效果，可作為免疫佐劑或免疫增強劑來使用。2.4滸苔多糖對肉雞血液淋巴細胞轉化率的影響表9組別淋巴細胞轉化率(is)c1.59d11.78d22.18e11.82e22.21f12.24f22.75從表9中的數據可以看出，兩種中藥成分均能提高肉雞淋巴細胞轉化率，且組合物比單一成分提高的程度更大，發生了協同增效作用，可以起到提高免疫力的效果，可作為免疫增強劑來使用。2.5滸苔多糖對肉雞免疫器官指數的影響表10組別胸腺器官指數(mg/g)c4.51d15.52d26.03e15.24e25.87f16.31f27.20表11組別脾臟器官指數(mg/g)c1.70d11.82d22.02e11.79e21.95f11.89f22.16表12組別法氏囊器官指數(mg/g)c1.62d11.75d22.39e11.81e22.43f11.91f22.89從表10-12中的數據可以看出，兩種中藥成分均能提高肉雞胸腺器官指數、脾臟器官指數和法氏囊器官指數，且組合物比單一成分提高的程度更大，發生了協同增效作用，可以起到提高免疫力的效果，可作為免疫增強劑來使用。5.組合物免疫增強試驗試驗試劑盒和方法同3.3中的新城疫抗體效價的檢測，取42日齡肉雞，分別添加不同重量比的滸苔提取物和滸苔提取物，測定血清新城疫抗體滴度，參見表13。表13滸苔提取物％白禿馬勃菌提取物％血清新城疫抗體滴度(log2)0.010.995.580.100.906.740.300.707.630.500.506.820.700.306.470.900.106.310.990.015.89從表13中的數據可以看出，在總用量相同的情況下，不同單一成分重量比，藥物組合物均能提高血清新城疫抗體滴度，且滸苔提取物與白禿馬勃菌提取物重量比為3:7的效果更好。以上各個實施例只是用於進一步說明本發明，並不是用來限制本發明的保護範圍，凡是基於本發明的構思所作出的等同變換及對本發明的各個技術方案顯而易見的改進，均落入本發明的保護範圍。當前第1頁12