布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法

2023-06-28 11:17:36

專利名稱：：布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種藥物
技術領域：
的檢測方法，具體是一種布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法。
背景技術：
：錐蟲，原生動物門肉鞭動物亞門動鞭毛綱動體目錐蟲科錐蟲屬，可寄生在脊椎動物、無脊椎動物以及植物宿主體內，引起宿主感染疾病。布氏錐蟲(TrypanosomaBrucei)，錐蟲屬的一種，主要分布在非洲，尤其是撒哈拉沙漠以南地區。經採蠅叮咬而被感染者，會得一種名為"非洲錐蟲病"的疾病，又稱非洲睡眠病或嗜睡性腦炎。患者初期可能出現發熱、皮疹、水腫和淋巴結脹大等症狀，其後腦部和腦膜也可能出現炎症。東非錐蟲病的病情可以快速惡化，腦部受影響的情況也較西非錐蟲病早些。錐蟲病晚期時可能會慢慢地出現其它神經系統毛病，昏睡的情況會續漸增加，最終導致昏迷並造成死亡，睡眠病亦因此而命名。目前，還沒有一種有效疫苗可預防非洲錐蟲病，因此能夠篩選出有效抑制錐蟲生長的藥物成為當務之急。氨醯tRNA合成酶，是生命進化過程中最早出現的一類蛋白質。氨醯tRNA合成酶催化胺基酸的活化以及轉移胺基酸與其相應的tRNA結合，是蛋白質合成過程中的一步關鍵的反應。胺基酸與相應tRNA的正確結合，可確保功能蛋白質的正確表達，保證了生命體的嚴謹性和多樣性。基於這一特徵，全球很多實驗室都在針對氨醯tRNA合成酶進行相關抑制劑的設計和篩選。據已有文獻報導，現有研究集中在亮氨醯tRNA合成酶(LeuRS)的研究上。如中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞研究所王恩多教授領導的課題組，在酵母和人的亮氨醯tRNA合成酶研究方面做了很多工作；美國加州AnacorPharmaceuticals公司和歐洲分子實驗室研究人員描述了一種新成分AN2690,能夠通過阻止真菌蛋白合成的亮氨醯tRNA合成酶而消滅真菌，治療常見的由真菌引起的指甲感染。然而，在錐蟲屬，這方面工作還是一片空白。經對現有技術的文獻檢索發現，FernandoL.Rock等在《Science》(科學)2007年第316巻第22期1759-1761頁發表了題為《Anantifungalagentinhibitsanaminoacyl-tRNAsynthetasebytrappingtRNAintheeditingsite》(一種在編輯位點通過誘捕tRNA抑制氨醯tRNA合成酶的抗真菌藥物)一文，文章中提及一種氨醯化測定方法，該方法使用Millipore公司的微孔過濾板裝置進行實驗操作，只適合於進行大規模藥物篩選，並且價格昂貴。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種布氏錐蟲亮氨醯t謂A合成酶活性的檢測方法。本發明的方法能夠進行以布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為靶標的抗錐蟲藥物的篩選。本發明尤其適用小量藥物篩選，具有操作簡便、快速準確、廉價的優點。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明涉及一種布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，包括如下步驟-步驟一，取預反應液，加到含面S0(二甲基亞碸)的離心管中，水浴；步驟二，向離心管中加入ATP，使ATP的終濃度為2raM-8mM，混勻，水浴；步驟三，從水浴後的離心管中取反應液滴加在定性濾紙片上，在三氯乙酸溶液中洗漆定性濾紙片；步驟四，在酒精中漂洗定性濾紙片；步驟五，將濾紙片置於紅外燈下烘乾；步驟六，閃爍計數儀檢測。步驟一中，所述預反應液，其lOOOuL預反應液的組分為，250ul摩爾濃度為250mM、pH值為7.8的HEPES-麗，250ul摩爾濃度為25mM的MgCl"250ul摩爾濃度為225mM的KCl，125ul摩爾濃度10mM的DTT，12.5ul質量分數為2%的BSA，25ul質量分數為20mg/ml的tRNA，50ul活性單位為25U的錐蟲亮氨醯tRNA合成酶，37.5ul的lOOuCi/ml的同位素標記的亮氨酸；將上述組分混合即得預反應液。步驟一和步驟二中，所述水浴具體為，溫度為2(TC-37°C，時間為5-60分鐘。步驟三中，所述洗滌具體為先將濾紙片在三氯乙酸溶液中靜置5-15分鐘，然後搖晃洗滌1-5分鐘，完成一次洗滌過程；重複該過程三次，每次均更換三氯5乙酸溶液。步驟三中，所述三氯乙酸溶液，其組分及質量百分數為三氯乙酸5%_20%，餘量為水。步驟四中，所述漂洗具體為先將濾紙片放在酒精中靜置5-15分鐘，然後搖晃洗滌1-5分鐘，完成一次漂洗過程；重複該過程三次，每次均更換酒精。步驟四中，所述漂洗中酒精的體積分數為80%-100%。步驟五中，所述烘千具體為在80W-150W紅外燈下烘乾10-30分鐘。本發明根據酶與底物的特異性結合原理，每一種氨醯tRNA合成酶都能特異性的識別一種tRNA和關聯胺基酸，並催化胺基酸活化結合到tRNA上；本發明將放射性同位素標記在胺基酸上，通過檢測胺基酸-tRNA複合體的放射性強度來間接檢測氨醯tRNA合成酶的活性，當加入不同的氨醯tRNA合成酶抑制劑或不同濃度的抑制劑時，氨醯tRNA合成酶活性被抑制的程度不同，從而催化合成相應胺基酸-tRNA複合物的能力不同。本發明具有如下有益效果本發明結合錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的特性，確定了最佳實驗條件，並提出一種簡便、廉價的實驗方案，即根據tRNA與定性濾紙的特異性結合這一特性，直接將結合有胺基酸-tRNA的濾紙投放在三氯乙酸溶液中。本發明可應用於抗錐蟲藥物篩選中，快速準確地確定特定濃度下化合物對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的抑制率；本發明還可應用於藥物作用機制研究中，結合定點突變確定藥物對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶作用的位點。本發明尤其適用小量藥物篩選，具有操作簡便、快速準確、廉價的優點。圖1為以布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為耙標的錐蟲抑制劑對酶的抑制率圖；圖2為以布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為靶標的錐蟲抑制劑對酶的抑制曲線圖。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpring6HarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例l以布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為靶標的錐蟲抑制劑的篩選步驟一，標準抑制劑對照物LRSI-ST和待篩選化合物的稀釋，具體見表l，表l離心管編號0123456789化合物———LRSI-STABCDEFG0011111111終濃度/MM00100100100100100100100100體積/uL7(DMS0)7(DMS0)77777777離心管編號#10111213141516171819化合物HI了KMN0PQ濃度/pM1111111111終濃度/MM100100100100100100100100100100體積/uL7777777777匿so為二甲基亞碸。表1中，錐蟲抑制劑終濃度為100pM，用DMSO稀釋化合物1000uL預反應液的組分為250ul摩爾濃度為250mM、pH值為7.8的HEPES-K0H，250ul摩爾濃度為25raM的MgCl2，250ul摩爾濃度為225mM的KCl，125ul摩爾濃度10mM的DTT，12.5ul質量分數為2。/。的BSA，25ul質量分數為20mg/ml的tRNA，50ul活性單位為25U的錐蟲亮氨醯tRNA合成酶，37.5ul的100uCi/ml的同位素標記的亮氨酸。其中，亮氨醯t脂A合成酶活性單位1U的定義是在20ul反應體系含pH值為7.8的50mMHEPES-KOH，5mMMgCl2，45mMKC1，lmMDTT，0.02%(質量分數)BSA，0.4mg/mltRNA，3uCi/ml同位素標記的亮氨酸，加入錐蟲LeuRS酶後，在37。C溫度下，4mMATP誘發反應20分鐘，將放射性同位素標記的亮氨酸活化並轉移到tRNA'e"上，用閃爍計數儀檢測，使得DPM值達1000時的酶量定義為l個活性單位(Unit，U)。步驟二，取56^L預反應液，依次加到離心管抑、#1、#2......H19中，離心管在37。C下孵育20分鐘；步驟三，向離心管中依次加7yL40mMATP，並迅速混勻；立即從離心管ftO7中取三等份20yL反應液，分別滴加到1.lramX3.2腿定性濾紙上，並立即投入到質量分數為5%的三氯乙酸溶液中作為陰性對照；其餘離心管#1(空白對照)、#2...W9在37。C下繼續孵育20分鐘;步驟四，從ftl(空白對照)、#2...W9離心管中分別取三等份20ixL反應液滴加在1.lmmX3.2mm定性濾紙片上；步驟五，迅速將濾紙片投放在100ml的質量分數為5%的三氯乙酸溶液中，浸泡8分鐘，然後搖動洗滌2分鐘，完成一次洗滌過程；重複該過程三次，每次均更換三氯乙酸溶液；步驟六，將濾紙片放在體積分數為95%酒精中靜置8分鐘，然後搖晃洗滌2分鐘，完成一次漂洗過程；重複該過程三次，每次均更換酒精。步驟七，置於100W紅外燈下烘乾15分鐘；歩驟八，閃爍計數儀檢測。如圖1所示，實驗結果為IO(VMLRSI-ST的抑制率為87%，與多次實驗結果相符，誤差在允許範圍內；同時在A-Q化合物中篩選到100(aM抑制率較高的化合物G、M和P作為進一步篩選，獲得半抑制濃度(IC50)的候選化合物。圖1中橫坐標空白對照為不加抑制劑時錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性被抑制情況，LRSI-ST為加標準錐蟲抑制劑時酶活性被抑制情況，A-Q為加候選錐蟲抑制劑時酶活性被抑制情況，縱坐標為錐蟲抑制劑對亮氨醯tRNA合成酶的抑制率。實施例2以錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為靶標的錐蟲抑制劑的半抑制濃度(IC50)的測定步驟一，稀釋待選化合物，具體見表2，表2tableseeoriginaldocumentpage8DMSO為二甲基亞碸。表2中，用DMSO稀釋化合物，每一反應為70ul總體積，1000uL預反應液的組分為，250ul摩爾濃度為250mM、pH值為7.8的HEPES-K0H，250ul摩爾濃度為25mM的MgCl2，250ul摩爾濃度為225mM的KCl，125ul摩爾濃度10raM的DTT，12.5ul質量分數為2。/。的BSA，25ul質量分數為20mg/ml的t認A，50ul活性單位為25U的錐蟲亮氨醯tRNA合成酶，37.5ul的100nCi/ml的同位素標記的亮氨酸。其中，亮氨醯tRNA合成酶活性單位lU的定義是在20ul反應體系含pH值為7.8的50mMHEPES-KOH，5mMMgC12，45mMKC1，lmMDTT，0.02%(質量分數)BSA，0.4mg/mltRNA，3nCi/ml同位素標記的亮氨酸。加入錐蟲LeuRS酶後，在37C溫度下，4mMATP誘發反應20分鐘，將放射性同位素標記的亮氨酸活化並轉移到tRNALeu上，用閃爍計數儀檢測，使得DPM值達1000時的酶量定義為1個活性單位(Unit，U)。步驟二，取56nL反應液，依次加到離心管M)、#1、ft2......的中，離心管在37。C下孵育20分鐘；步驟三，向離心管中依次加7iiL40mMATP，並迅速混勻；立即從離心管恥中取三等份20yL反應液，分別滴加到1.1咖X3.2mm定性濾紙上，並立即投入到質量分數為5%的三氯乙酸溶液中，作為陰性對照；其它離心管W、#2...粉在37。C下繼續孵育20分鐘；步驟四，每個離心管中各取三等份20yL反應液分別滴加在1.lmmX3.2誦定性濾紙片上；步驟五，迅速將濾紙片投放在100ml的質量分數為5%的三氯乙酸溶液中，浸泡8分鐘，然後搖動洗漆2分鐘，完成一次洗滌過程；重複該過程三次，每次均更換質量分數為5%的三氯乙酸溶液；步驟六，將濾紙片放在體積分數為95%酒精中靜置8分鐘，然後搖晃洗滌2分鐘，完成一次漂洗過程；重複該過程三次，每次均更換酒精；步驟七，置於100W紅外燈下烘乾15分鐘；步驟八，閃爍計數儀檢測。如圖2所示，實驗結果為由Gr鄰hPadPrism作圖計算得到標準抑制劑對照物LRSI-ST的半抑制濃度(IC50)為9.588uM(a圖)，與多次實驗結果相符，誤差在允許範圍內。錐蟲抑制劑G對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的IC50為5.548uM(b圖)；錐蟲抑制劑M對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的IC50為28.94uM(c圖)；錐蟲抑制劑P對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的IC50為30.93iiM(d圖)。圖2中橫坐標是錐蟲抑制劑濃度的對數值，縱坐標是反應錐蟲亮氨醯t固A合成酶活性的閃爍計數DPM值，並且在32個化合物中獲得多個高效抑制物，最小的IC50僅為1.306pM，成為抗錐蟲藥物的前導物。圖2中，a圖是標準錐蟲抑制劑LRSI-ST對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的抑制曲線；b圖是錐蟲抑制劑G對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的抑制曲線圖；c圖是錐蟲抑制劑M對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的抑制曲線圖；d圖是錐蟲抑制劑P對錐蟲亮氨醯tRNA合成酶的抑制曲線圖。權利要求1、一種布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，取預反應液，加到含DMSO的離心管中，水浴；步驟二，向離心管中加入ATP，使ATP的終濃度為2mM-8mM，混勻，水浴；步驟三，從水浴後的離心管中取反應液滴加在定性濾紙片上，在三氯乙酸溶液中洗滌定性濾紙片；步驟四，在酒精中漂洗定性濾紙片；步驟五，將濾紙片置於紅外燈下烘乾；步驟六，閃爍計數儀檢測。2、根據權利要求l所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟一中，所述預反應液，其1000ul預反應液的組分為，250ul摩爾濃度為250mM、pH值為7.8的HEPES-K0H，250ul摩爾濃度為25mM的MgCl"250ul摩爾濃度為225mM的KC1，125ul摩爾濃度lOraM的DTT，12.5ul質量分數為2%的BSA，25ul質量體積比為20mg/ral的環A，50ul活性單位為25U的錐蟲亮氨醯tRNA合成酶，37.5ul濃度為100uCi/ml的同位素標記的亮氨酸；將上述組分混合即得預反應液。3、根據權利要求l所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟一和步驟二中，所述水浴具體為，溫度為20。C-37°C，時間為5-60分鐘。4、根據權利要求l所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟三中，所述洗滌具體為先將濾紙片在三氯乙酸溶液中靜置5-15分鐘，然後搖晃洗滌1-5分鐘，完成一次洗滌過程；重複該過程三次，每次均更換三氯乙酸溶液。5、根據權利要求4所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟三中，所述三氯乙酸溶液，其組分及質量百分數為三氯乙酸5%-20%，餘量為水。6、根據權利要求l所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟四中，所述漂洗具體為先將濾紙片放在酒精中靜置5-15分鐘，然後搖晃洗滌1-5分鐘，完成一次漂洗過程；重複該過程三次，每次均更換酒精。7、根據權利要求6所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟四中，所述漂洗中酒精的體積分數為80%-100%。8、根據權利要求l所述的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，其特徵是，步驟五中，所述烘乾具體為在80W-150W紅外燈下烘乾10-30分鐘。全文摘要一種藥物篩選
技術領域：
的布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶活性的檢測方法，該方法步驟如下取預反應液，加到含DMSO(二甲基亞碸)的離心管中，水浴；向離心管中加入ATP，使ATP的終濃度為2mM-8mM，混勻，水浴；從離心管中取反應液滴加在定性濾紙片上，在三氯乙酸溶液中洗滌濾紙片；在酒精中漂洗濾紙片；將濾紙片置於紅外燈下烘乾；閃爍計數儀檢測。本發明的方法能夠進行以布氏錐蟲亮氨醯tRNA合成酶為靶標的抗錐蟲藥物的篩選。本發明尤其適用小量藥物篩選，具有操作簡便、快速準確、廉價的優點。文檔編號C12Q1/25GK101497917SQ20091004668公開日2009年8月5日申請日期2009年2月26日優先權日2009年2月26日發明者李大偉,杲光偉申請人:上海交通大學