一種固定化的螢光標記細胞色素c、其製備方法及用途與流程

2023-06-28 15:21:21 3

本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種螢光標記的細胞色素c的固定化方法，以及所述固定化的螢光標記細胞色素c在生物樣品檢測中的用途。

背景技術：

一氧化氮(no)是具有多種生物活性的信使分子和效應分子，對心腦血管系統、消化系統、神經系統都具有重要的調節作用，近來研究表明no還能發揮非特異性宿主防禦作用，介導組織損傷、細胞凋亡等病理過程，進而引起炎症反應和自身免疫性皮膚病。no雖然結構簡單，但在有氧環境下極不穩定，檢測難度大，因而相關分析方法的研究極大的關注，cn105153214提供了一種矽基羅丹明一氧化氮螢光探針、cn103923641提供了一種檢測線粒體中一氧化氮的螢光探針。

細胞色素c是一種定位於線粒體內外膜間隙的血紅素蛋白，廣泛存在於各種含線粒體呼吸鏈的生物體中。細胞色素c含有c型血紅素，能夠與no通過配位反應完成各種生理功能。早期的研究表明細胞色素c能夠直接與no結合與解離。

目前，發明人前期針對細胞色素c與no反應機制的研究發現no進入溶液以no形式存在，使cytc周圍的微環境發生變化，進入到heme腔中改變其電子分布，增大了met80與heme之間的距離，使其相互作用減弱，met與heme之間的配位鍵改變，分子間發生重排，其中心fe與no形成新配位鍵，但所形成的fe-n鍵不穩定，當no量較少時，隨時間變化又會斷裂，再次生成五配位fe，可以與溶液中的自由基團結合，最終達到一個平衡，當不斷通入no時，所形成的配位鍵不再發生斷裂，破壞了其達到的平衡。

在對上述結合機制進行深入研究的基礎上進一步發現，由於cytc與no的配位反應伴隨著空間構象的改變、配位鍵的形成，因此在不破壞細胞色素c結構和與no結合活性的基礎上，用螢光標記細胞色素c將能夠用於檢測細胞色素c與no結合過程中的能量轉移。

目前，國內外還沒有利用固定化螢光標記的細胞色素c來檢測一氧化氮的方法和產品。

技術實現要素：

針對現有技術中的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種固定化的螢光標記細胞色素c，通過細胞色素c與no的配位反應，引起細胞色素c構象的改變和能量的遷移，進而導致螢光光密度的改變，從而實現no的檢測。

本發明為解決上述技術問題所採用的技術方案如下：

本發明提供一種螢光標記細胞色素c的固定化方法，包括以下步驟：

(1)從微生物中提取純化細胞色素c；

(2)將細胞色素c與螢光素反應製備螢光標記的細胞色素c，除去游離螢光素；

(3)用異丙醇鋁製備鋁膠母液；

(4)將步驟(2)和(3)的產物混勻，塗布固相載體。

其中，所述細胞色素c來自光合細菌。

所述螢光標記細胞色素c的固定化方法，所述細胞色素c包含的胺基酸序列如seqidno:1所示。

所述螢光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(1)具體為：將菌體凍融後，超聲破碎，上清液過離子交換色譜，洗脫液再過分子篩層析，獲得電泳純的細菌源細胞色素c。

所述螢光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(2)具體為：將1mg細胞色素c溶解於nahco3溶液中，加入5μl20mm的螢光素琥珀醯亞胺酯，混勻，4℃反應2h，0.01m的ph7.4磷酸鹽緩衝液透析，除去未結合的游離螢光素二乙酸酯。

所述螢光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(3)具體為：取2g異丙醇鋁，加入44ml沸水中，80℃攪拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷卻至4℃。

所述螢光標記細胞色素c的固定化方法，步驟(4)具體為：取等量的步驟(2)和(3)的產物混勻，4℃反應1h，均勻塗覆於固相載體表面。

本發明第二個目的是：提供通過所述螢光標記細胞色素c的固定化方法製備的固定化螢光標記細胞色素c。

本發明第三個目的是：提供上述螢光標記細胞色素c的固定化方法在製備檢測生物樣品中no的檢測試劑中的用途。

本發明第四個目的是：提供上述螢光標記細胞色素c的固定化方法在製備檢測生物樣品中no的檢測裝置中的用途。

本發明所述檢測生物樣品中no的檢測裝置為細胞色素c珠、細胞色素c片、細胞色素c容器或細胞色素c傳感器。

所述的細胞色素c珠是表面塗覆有細胞色素c的透明球狀固體、細胞色素c片是表面塗覆有細胞色素c的透明片狀固體、細胞色素c容器是內表面塗覆有細胞色素c的透明容器、細胞色素c傳感器是指感應部件上塗覆有所述細胞色素c。

與現有技術相比，本發明的優點在於：

(1)本發明首次公開了一種固定化螢光標記的細胞色素c。其能夠立即響應溶液中的no使得螢光光密度值瞬間大幅度改變，從而能夠快速、靈敏的檢測生物樣本、細胞培養液、發酵液等液體環境中易被氧化而瞬間消失的no。本發明所述固定化螢光標記細胞色素c對溶液中no的響應速度約為0.4s，no的檢測限約為10μm。

(2)螢光標記方法簡單並且避免了對細胞色素c空間結構和功能的影響。本發明採用螢光素二乙酸酯標記法，通過雙功能基團將螢光素標記於細胞色素c蛋白質支鏈的伯氨基上，不影響以鐵卟啉為活性中心的no結合位點的功能。

(3)本發明所述固定化螢光標記的細胞色素c應用範圍廣，可以固定於螢光光度計的樣品杯透光避內部，也可以固定於透明載體上，可重複多次使用。尤其適用於體外培養的血管內皮細胞、巨噬細胞、神經細胞的檢測，具有較好的經濟價值。

附圖說明

圖1為純化的沼澤紅假單胞菌atcc:17001細胞色素c電泳圖。泳道1是純化的細胞色素c，泳道2是蛋白marker，由上到下依次為95、77、55、43、34、26、17kda，所述純化的蛋白位於約55-77kda之間。

圖2為不同溶液中，固定化螢光標記細胞色素c在510-590nm激發光下產生的的螢光光密度值。粗線為螢光標記的細胞色素玻璃珠在超聲除氣的磷酸鹽緩衝溶液中的螢光光密度值；細線為螢光標記的細胞色素玻璃珠在no飽和的磷酸鹽緩衝溶液中的螢光光密度值。橫軸為波長nm，縱軸為螢光光密度值a.u.

圖3為固定化螢光標記的細胞色素c在535nm的螢光光密度值，橫軸為時間sec，縱軸為螢光光密度值a.u.。第3.5秒的位置「1」，向檢測溶液中加入no飽和的緩衝液；第14.5秒的位置「2」，向檢測溶液中再加入超聲除氣的緩衝液進行稀釋。

具體實施方式

以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。

實施例1：光合菌細胞色素c的分離純化和鑑定

從沼澤紅假單胞菌atcc:17001中分離提取細胞色素c。將沼澤紅假單胞菌發酵液離心，收集菌體以發酵液體積1/100量的tris-hcl(0.1m，ph7.4)緩衝液重懸，置-20℃冷凍過夜，室溫融解後，4℃超聲破碎10min，15000g冷凍離心20min，取上清液。

用tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩衝液平衡deae纖維素層析柱，將上樣後先以10倍柱體積tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩衝液漂洗，再用低離子強度nacl溶液(0.02m)洗滌至無蛋白成分流出，最後加入高離子強度的nacl(0.2m)，收集並合併洗脫液，並進行濃縮。

將濃縮液上樣至sephadexg-100分子篩柱，用tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩衝液洗脫，分部收集、合併呈鐵紅色的級分，濃縮、蛋白定量，取樣進行sds-page電泳鑑定純度和大小(參見圖1)。

實施例2：細胞色素c的螢光標記

將細胞色素c用0.1mnahco3溶液稀釋至500μg/ml，將六氯螢光素琥珀酸亞胺酯用dmso溶解至20mm，取5μl加入上述細胞色素c溶液中，混勻室溫反應1h，以0.1mph7.4的tris-hcl緩衝液透析，直至透析液中不含螢光物質。

實施例3：螢光標記細胞色素c的固定化

取2g異丙醇鋁，加入44ml沸水中，80℃攪拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷卻至4℃，製備得鋁膠母液。

將螢光標記的細胞色素c與鋁膠母液按體積比1:1混合，充分混勻4℃靜置反應1h，均勻鋪布於玻璃珠上，置4℃冰箱中過夜保存備用。

實施例4：固定化螢光標記細胞色素c的螢光檢測

將實施例3製備的固定有螢光標記細胞色素c的玻璃珠分別加入超聲除氣的磷酸鹽緩衝溶液(0.01mph7.4)、以及充入no飽和的磷酸鹽緩衝溶液中，用螢光光度計檢測不同波長的激發光下產生的螢光光子的量(參見圖2)。固定化螢光標記細胞色素c在no飽和緩衝液中相對於超聲除氣緩衝液中，螢光光密度值顯著降低。

該實驗結果表明與超聲除氣的磷酸緩衝液相比，在no飽和的磷酸鹽緩衝溶液中螢光標記細胞色素c產生螢光的能力下降。本發明所述固定化螢光標記的細胞色素在530-540nm激發光下產生的螢光光子數量較高，波長超過550nm時，螢光光密度值顯著下降，並且兩種溶液中光密度差值最大的波長區間也大約位於530-540nm之間。選擇535nm作為螢光光密度檢測的最佳參數。

實施例5：固定化螢光標記細胞色素c對溶液中no的響應

將實施例3製備的固定有螢光標記細胞色素c的玻璃珠加入分別加入超聲除氣的磷酸鹽緩衝溶液(0.01mph7.4)中，檢測螢光光密度值。先加入等體積no飽和的磷酸鹽緩衝溶液立即混勻，檢測螢光光密度值的變化；再加入等體積超聲除氣的磷酸鹽緩衝液稀釋，檢測螢光光密度值的變化，結果如圖3所示。

圖3表明，加入no飽和的磷酸鹽緩衝溶液後，螢光光密度值立即斷崖式下降，進一步加入超聲除氣的磷酸鹽緩衝液後，螢光光密度值又大幅度回升。

上述結果證實：

(1)本發明所述固定化螢光標記細胞色素c對溶液中no的響應速度快、螢光光密度信號變化大，能快速靈敏的檢測no的含量。

(2)本發明所述固定化螢光標記細胞色素c響應於no產生的能量轉移和構像改變是可逆的，能夠重複使用。

實施例6：固定化螢光標記細胞色素c用於體外培養的巨噬細胞產no的檢測

體外培養巨噬細胞，向周齡balb/c小鼠腹腔內注射5ml生理鹽水，揉捏腹腔，抽出腹腔液1500rpm離心3min，細胞沉澱置於1640完全培養基(含20％fbs)中，37℃培養，隔日換液。

將體外培養的巨噬細胞均分為兩組，實驗組向細胞培養液中添加終濃度1000u/ml的ifn、10μg/ml的lps、10μg/ml的sps、60μg/ml的ltn以及200μg/mlpaa，以刺激巨噬細胞產生no；對照組不加藥物。

螢光光密度結果表明實驗組螢光光密度值約為235a.u.，而對照組螢光光密度值約為280a.u.。

上述說明並非對本發明的限制，本發明也並不限於上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質範圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬於本發明的保護範圍，本發明的保護範圍以權利要求書為準。