經修飾的擴展酶及其用途的製作方法
2023-06-30 02:13:11 1
專利名稱:經修飾的擴展酶及其用途的製作方法
發明領域本發明涉及經修飾的擴展酶(expandase)，特別是對於底物例如青黴素G具有增加的特異性的青黴素N擴展酶。
發明背景由於低毒性、高特異性和抗多種多樣的病原生物體的臨床功效，β-內醯胺抗生素佔據了抗感染領域的主要部分。細菌和真菌物種中的許多生物產生傳統的β-內醯胺抗生素例如青黴素類、頭孢菌素類、頭黴素類，和非傳統的抗生素例如克拉維酸和沙納黴素。真菌家族的產黃青黴(Penicillium chrysogenum)和頂頭孢(Cephalosporiumacremonium)分別產生青黴素G和頭孢菌素C。帶小棒鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)這種細菌產生傳統的抗生素頭黴素和非傳統的抗生素克拉維酸，它因其β-內醯胺酶抑制而被人們所熟知。可以參考綜述，例如Jensen，S.E. Demain，A.L.(1993)，Biochemistryand Genetics of Antibiotics/Biosynthesis，eds Vining，L.C Stuttard，C.，Butterworth-Heinemann，Boston，以獲得關於參與這些抗生素合成的各種酶的生物合成、基因調控和生物化學表徵。
許多傳染性生物變得對於天然出現的青黴素抗生素具有抗性，抗性機制通過經β-內醯胺酶的降解而起作用，因而需要新的且更有效的抗生素。頭孢菌素類在它們抵抗具有抗性的細菌的有效性方面是卓越的，因此重要的研究用於開發新的半合成衍生物。頭孢菌素衍生物例如頭孢氨苄、cephadoxyl和頭孢拉定通過將7-氨基去乙醯氧基頭孢烷酸(7-ADCA)與合適的側鏈偶聯來產生。目前，7-ADCA從苯基乙醯基7-ADCA生產，而苯基乙醯基7-ADCA需通過昂貴的且有汙染的化學工藝過程從青黴素G合成。因而需要生物轉化，其是本身環境友好的且能夠比化學工藝過程更便宜的過程。
也稱為去乙醯氧基頭孢菌素C合酶(DAOCS)的青黴素N擴展酶是在諸如帶小棒鏈黴菌、耐內醯胺鏈黴菌(Streptomyceslactamdurans)、Xanthomonas lactamgenus、黃桿菌屬物種(Flavobacterium sp)、Streptomyces organanensis、Streptomyceslactamgens、弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)、灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)和Streptomyces ofivaceus的物種中發現的酶，其催化青黴素的五元噻唑烷環轉化成頭孢菌素類的六元二氫噻嗪環，它正成為合成頭孢菌素衍生物的替代途徑的明顯的選擇。
已經廣泛地表徵了從帶小棒鏈黴菌分離的青黴素N擴展酶，並描述於Kovacevic S等人，J.Bacteriol.171(2)754-760，1989，Dotzlaf，J.E.等人，J.Biol.Chem.26410219-10226，1989，和Valegard，K.等人，Nature 394805-809，1998之中。青黴素N是擴展酶的一種天然底物，其不容易獲得，並且切割己二醯側鏈的效率很低。另一方面，青黴素G容易獲得，並且苯基乙醯基側鏈基團能夠用青黴素G醯胺酶高效地切割。可是，青黴素G對於青黴素N擴展酶來說是一種差的底物。因此，商業資本化要求對該擴展酶進行工程改造，這樣的經修飾的擴展酶及其用途描述在WO01/85951、US6,699,699B2和US20030186354中。
US公開號20030186354公開了突變的青黴素擴展酶，其在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第73位的甲硫氨酸、第79位的甘氨酸、第275位的纈氨酸、第277位的亮氨酸、第281位的半胱氨酸、第300位的甘氨酸、第304位的天冬醯胺、第305位的異亮氨酸、第91位的蘇氨酸、第106位的丙氨酸、第155位的半胱氨酸、第184位的酪氨酸、第188位的甲硫氨酸和第244位的組氨酸，條件是在第304位的天冬醯胺殘基位置處的胺基酸取代不是N304L，和在第155位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代是C155Y。
本發明的主要目標是提供突變的擴展酶，其對於底物例如青黴素G或青黴素V具有比野生型擴展酶高多倍的擴展活性。
附圖描述
圖1SEQ ID NO1描述了帶小棒鏈黴菌的青黴素N擴展酶的核苷酸和胺基酸序列。
發明簡述因此，本發明提供了具有修飾的或改進的環擴展活性的突變型青黴素擴展酶。優選地，該擴展酶是青黴素N擴展酶，其經過修飾從而與野生型擴展酶相比具有增加的對於作為底物的青黴素G或青黴素V的活性。
在本發明的另一個實施方案中，提供了編碼所述擴展酶突變的經修飾的擴展酶基因。
在本發明的另一個實施方案中，提供了具有經修飾的擴展酶活性的蛋白質。
在本發明的另一個實施方案中，提供了包含經修飾的擴展酶基因的表達載體。
在本發明的另一個實施方案中，提供了用表達載體轉化的宿主株系。
在另一方面，本發明提供了突變型青黴素擴展酶，其在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代不是酪氨酸。特別地，本發明提供了突變的青黴素擴展酶，其包含選自下列的一個或多個特殊的胺基酸取代T42A，I50V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，F152L，P196S，A240T，C281R，S309P，V133I和P196S；F152L和C281R；T42A，F152L和S309P；V133I，T143S，P196S和S309P，其中胺基酸取代的殘基位置相應於野生型擴展酶的殘基位置。
在另一方面，本發明提供了在生物體中見到的天然或非天然出現的擴展酶變體，所述生物體例如為耐內醯胺鏈黴菌、Xanthomonaslactamgenus、黃桿菌屬物種(Flavobacterium sp.)、Flavobacieriumchitinovoruna、Streptomyces organanensis、耐內醯胺諾卡氏菌(Nocardia lactamdurans)、利波曼鏈黴菌(Streptomyces limanii)、Streptomyces jumonjinensis、和田山鏈黴菌(Streptomyceswadayamensi)、卡特利鏈黴菌(Streptomyces cattleya)、Streptomyceslactamgens、弗氏鏈黴菌、灰色鏈黴菌、橄欖鏈黴菌(Streptomycesolivaceus)、鏈黴菌屬物種(Streptomyces sp.)和產黃支頂孢(Acremonium chrysogenun)，所述擴展酶變體於在本發明中公開的類似位置處具有取代。
在另一方面，本發明提供了擴展酶例如也稱為去乙醯氧基/去乙醯基頭孢菌素C合酶的擴展酶/羥化酶的變體，其具有顯著的擴展活性，並來自諸如產黃支頂孢的生物。所述變體可以由本領域技術人員通過將變體與SEQ ID NO1的序列進行比對而得到鑑定。例如，通過將變體與SEQ ID NO1的序列進行比對，本領域技術人員可以鑑定與SEQ ID NO1的第304位的天冬醯胺等價的胺基酸，從而鑑定出對於SEQ ID NO1的第304位來說等價的殘基。
含有經修飾的擴展酶基因的經修飾的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株根據布達佩斯條約保藏在印度昌迪加爾(Chandigarh)的微生物模式培養物保藏中心(Microbial Type Culture CollectionCenter)，登錄號如下於2004年3月23日保藏的MTCC5133、MTCC5134、MTCC5135、MTCC5136、MTCC5137、MTCC5138、MTCC5139、MTCC5140、MTCC5141、MTCC5142、MTCC5143，和於2004年7月20日保藏的MTCC5160、MTCC5161、MTCC5162、MTCC5163、MTCC5164、MTCC5165和MTCC5166。
發明詳述本發明提供了突變型青黴素擴展酶，其與野生型擴展酶相比顯示出優選對於作為底物的青黴素G或青黴素V的增加的或修飾的環擴展活性。
根據本發明的突變型青黴素擴展酶包括源自帶小棒鏈黴菌的擴展酶或源自其他生物的擴展酶。
來自帶小棒鏈黴菌的青黴素N擴展酶的核苷酸和胺基酸序列顯示在SEQ ID NO1(圖1)中。
本發明的首要方面是提供對於青黴素G或青黴素V具有更好的底物特異性的突變的青黴素擴展酶，其中突變的青黴素擴展酶在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代不是酪氨酸。
在SEQ ID NO1的序列中的變化如下第50位的異亮氨酸被纈氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代；第145位的脯氨酸被亮氨酸取代；第148位的甘氨酸被穀氨酸取代；
第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代；第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代；第133位的纈氨酸被異亮氨酸取代，和第196位的脯氨酸被絲氨酸取代；第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸而非酪氨酸取代；第42位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，和第309位的絲氨酸被脯氨酸取代；第133位的纈氨酸被異亮氨酸取代，第143位的蘇氨酸被絲氨酸取代，第196位的脯氨酸被絲氨酸取代，和第309位的絲氨酸被脯氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第50位的異亮氨酸被纈氨酸取代，第152位的苯丙氨酸被亮氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第57位的組氨酸被精氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代；第67位的蘇氨酸被丙氨酸取代，第240位的丙氨酸被蘇氨酸取代，和第281位的半胱氨酸被精氨酸取代，和第305位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代。
根據本發明的經修飾的肽可整合入所述的修飾，例如第50位的異亮氨酸的修飾。
如上所述，根據本發明可以修飾具有不同於SEQ ID NO1的胺基酸序列的變體多肽。根據本發明進行使用的變體是具有擴展酶活性的變體。根據本發明的經修飾的變體是這樣的變體，即當與未經如此修飾的變體序列進行比較時，其顯示出提高的擴展環底物例如青黴素G或青黴素V的能力。
可以對胺基酸序列進行胺基酸取代。SEQ ID NO1的胺基酸序列的一個或多個胺基酸殘基可以可選擇地或附加地被刪除。本發明的多肽還包括上述序列的片段。這樣的片段保持了擴展酶活性。
這樣的片段可用於通過使用源自其他擴展酶多肽的酶的部分來產生嵌合型酶。
本發明的多肽可以是基本上分離的形式。可以理解，多肽可以和不會干擾所希望的該多肽的目的的載體或稀釋劑混合，而仍然被認為是基本上分離的。本發明的多肽還可以是基本上純的形式，在此情況下，將會通常在製劑中包含多肽，在所述製劑之中超過90％，例如95％、98％或99％(重量)的製劑中的多肽是本發明的多肽。
本發明的多肽可以通過從重組表達載體原位表達該多肽而被引入細胞中。表達載體可選地攜帶有可誘導的啟動子以控制該多肽的表達。
其中表達本發明多肽的這樣的細胞表達系統可以用於產生苯基乙醯基7-ADCA。
本發明將用下面的實施例進行舉例說明，這些實施例不應當解釋為限制了本發明的範圍。
所有的生化藥劑、試劑和寡核苷酸從Sigma-Aldrich ChemicalsPvt.Ltd或USB，USA獲得。限制酶和株系從New England Biolabs Inc，USA購買。pET24a(+)載體和BugBuster試劑從Novagen，USA購買。帶小棒鏈黴菌和產黃青黴菌株從ATCC獲得。
擴展酶基因的克隆在具有180rpm的轉速的旋轉搖動器中，讓帶小棒鏈黴菌(ATCC27064)培養物於26℃在處於250ml錐形瓶中的50ml YMG培養基(每升含有酵母提取物4g，麥芽提取物10g，葡萄糖4g(pH7.0))之中生長，直至在600nm的O.D.達到3.00。將培養物於20℃在13000rpm下離心10分鐘以收穫細胞沉澱。將細胞沉澱重懸在含有10mg溶菌酶(200μl的50mg/ml原液)TE緩衝液pH8.0(培養物體積的1/10)中，並將混合物在30℃溫育30分鐘，隨後加入1ml 10％SDS、5ml用Tris-HCl(pH8.0)飽和的苯酚(phenol)和750μl 5M NaCl。將含有混合物的管輕輕地顛倒幾次，並在室溫下保持20分鐘。將懸浮液於20℃在16,000rpm下離心10分鐘以分離相。在將含水層轉移至新的離心管中之後，加入兩倍體積的異丙醇和將管輕輕地顛倒幾次，並將得到的混合物在室溫下保持10分鐘。再次於20℃在16,000rpm下離心10分鐘，並將沉澱重懸在TE緩衝液pH8.0中。在溶解了DNA之後，加入RNA酶A至終濃度為20μg/ml，並將懸浮液於50℃溫育1小時。然後，加入蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，隨後加入100mMNaCl和0.4％SDS，並將混合物在37℃下溫育1小時。再次用相同體積的苯酚萃取懸浮液，於20℃在16000rpm下離心10分鐘，和將含水層轉移至新的管中。類似地用氯仿萃取混合物，用異丙醇處理含水層並在-20℃保持1小時。通過於20℃在13,000rpm下離心10分鐘來沉澱出DNA，並將沉澱重懸在50μl TE(pH8)中。
使用寡核苷酸(5』GAGCATATGGACACGACGGTGCCC3』，5』GATTGCTGCTGTGACCATGACGGT3』)，從如上所述分離的帶小棒鏈黴菌(ATCC27064)基因組DNA中擴增出擴展酶基因，反應體積為100μl，其中含有1X Vent DNA聚合酶緩衝液、10％DMSO、1mM MgSO4、2.5個單位的Deep Vent DNA聚合酶，並具有50μl的油覆蓋層。擴增過程的組成為1個循環，95℃，5分鐘；25個循環，95℃，40秒用於變性，60℃，30秒用於退火，和72℃，5分鐘用於延伸；最後1個循環，72℃，15分鐘以進行延伸。純化從擴增產生的片段，並克隆入用SmaI進行限制性消化的pUC19載體中。通過測序進一步檢驗基因的序列。
突變體的產生使用易錯聚合酶鏈式反應，通過偏置核苷酸濃度來誘變擴展酶基因，其使用寡核苷酸(5』ATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATT3』，5』CTCACTCATTAGGCACCCCAGGCT3』)，反應體積為100μl，其中含有1X Taq DNA聚合酶緩衝液、10％DMSO、10ng模板和3個單位的Taq DNA聚合酶。如對於擴展酶基因的克隆所描述的，實施擴增過程。進一步純化片段，並用NdeI和BamHI進行消化。將其以3∶1的摩爾比加入經類似消化的pET24a中，並使用0.5mM ATP、10x T4DNA連接酶緩衝液和3個單位的T4 DNA連接酶通過在12℃溫育過夜而進行連接。然後，將1μl連接混合物用於轉化用CaCl2製備的感受態大腸桿菌BL21(DE3)。在卡那黴素下挑選出重組子。在一些情況下，將突變型模板用於產生附加的突變。
定位誘變單獨地或以多個組合，將整合有錯配以引起希望的突變的寡核苷酸與單鏈模板退火，所述單鏈模板是在M13KO7輔助噬菌體的幫助下從大腸桿菌CJ236中產生的。通過如在Sambrook等人的「MolecularCloning，A laboratory Manual」，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989中所述的標準程序，分離天然或突變型擴展酶基因模板的單鏈。然後，在存在200μM每種dNTPs、0.2mg/ml BSA、0.5mM ATP、2個單位的T4 DNA連接酶、3個單位的T4 DNA聚合酶和10mM MgCl2的情況下，以20μl的反應體積，於42℃進行體外第二條鏈合成20分鐘。在用EDTA終止反應之後，將1μl用於轉化大腸桿菌DH5α。用限制酶切分析，並隨後用DNA測序來確認突變體。
擴展酶突變體的表達將擁有推定的突變型構建體的大腸桿菌BL21(DE3)的單個菌落接種在含有補充了抗生素的LB的96孔培養板中，並在37℃和220rpm下生長。當光密度達到0.6-0.8時，加入IPTG以誘導表達，並在25℃下再培養3小時。然後，將板在微量培養板離心機中以4000rpm進行離心，並將沉澱重懸在含有50mM Tris.HCl(pH7.5)、1mM二硫蘇糖醇、0.01mM EDTA、10％甘油和50mM葡萄糖的緩衝液中，然後貯存於-80℃。
擴展酶突變體的測定將表達分離物在冰上融化，並用100μl BugBuster試劑在25℃處理10分鐘以促進細菌的裂解。通過如下步驟來開始擴展酶測定向孔中加入30μl新制的10X混合物和30μl 100mM青黴素G底物，混合，用密封材料(breathseal)覆蓋，並在搖動器中於25℃溫育30分鐘。混合物中的組分的終濃度為50mM硫酸胺、1mMα-酮戊二酸、50μM抗壞血酸鹽、2mM二硫蘇糖醇、2mM FeSO4和10mM青黴素G。通過加入150μlCH3OH和150μl H2O而淬滅反應。
擴展酶突變體的初級篩選將25μl測定混合物加載至空白的圓形紙片上，讓其乾燥，並置於塗布有大腸桿菌ESS(由S.E.Jensen教授，University of Alberta，Canada友情提供)並含有青黴素酶的LB平板上。將平板在37℃溫育過夜，並將具有比天然擴展酶大的抑制區域的克隆列入候選名單中以用於進一步的定量和通過測序的確認。
使用HPLC的擴展酶活性的定量將測定樣品於4℃離心30分鐘，取20μl進行注射，並在C18柱中使用甲醇和磷酸鹽緩衝液的混合物，通過HPLC監測洗脫特性。青黴素G向頭孢菌素G的轉化通過使用頭孢菌素G作為標準來進行定量，少數幾個擴展酶突變體的相對活性水平顯示在表1中。
表1擴展酶突變體的相對比活性
權利要求
書(按照條約第19條的修改)1.突變的青黴素擴展酶，其在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代不是酪氨酸。
2.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其中所述野生型擴展酶獲自帶小棒鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)。
3.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其在一個或多個殘基位置處包含選自下列的胺基酸取代T42A，I50V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，P196S，A240T，C281R和S309P。
4.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其包含下列的胺基酸取代V133I/P196S，F152L/C281R，T42A/F152L/S309P，V133I/T143S/P196S/S309P，H57R/A240T，H57R/A240T/C281R，T67A/A240T/C281R，I50V/F152L/A240T/C281R，H57R/A240T/I305M，H57R/I305M，H57R/A240T/C281R/I305M和T67A/A240T/C281R/I305M。
5.經修飾的擴展酶基因，其編碼權利要求
1所述的擴展酶突變。
6.經修飾的來自產黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)的去乙醯氧基/去乙醯基頭孢菌素C合酶，其在類似的權利要求
1所述位置處具有取代。
7.具有權利要求
1所述的突變的青黴素擴展酶的宿主株系。
8.具有權利要求
1所述的突變的青黴素擴展酶的表達載體。
權利要求
1.突變的青黴素擴展酶，其在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代不是酪氨酸。
2.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其中所述野生型擴展酶獲自帶小棒鏈黴菌(Streptomyces clavuligerus)。
3.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其在一個或多個殘基位置處包含選自下列的胺基酸取代T42A，150V，H57R，T67A，V133I，T143S，P145L，G148E，F152L，P196S，A240T，C281R和S309P。
4.權利要求
1的突變的青黴素擴展酶，其包含下列的胺基酸取代V1331/P196S，F152L/C281R，T42A/F152L/S309P，V133I/T143S/P196S/S309P，H57R/A240T，H57R/A240T/C281R，T67A/A240T/C281R，I50V/F152L/A240T/C281R，H57R/A240T/I305M，H57R/I305M，H57R/A240T/C281R/I305M和T67A/A240T/C281R/I305M。
5.經修飾的擴展酶基因，其編碼權利要求
1所述的擴展酶突變。
6.經修飾的來自產黃支頂孢(Acremonium chrysogenum)的去乙醯氧基/去乙醯基頭孢菌素C合酶，其在類似的權利要求
1所述位置處具有取代。
7.具有權利要求
1所述的突變的青黴素擴展酶的宿主株系，於2004年3月23日保藏的MTCC 5133、MTCC 5134、MTCC 5135、MTCC 5136、MTCC 5137、MTCC 5138、MTCC 5139、MTCC 5140、MTCC 5141、MTCC 5142、MTCC 5143，和於2004年7月20日保藏的MTCC 5160、MTCC 5161、MTCC 5162、MTCC 5163、MTCC5164、MTCC 5165和MTCC 5166。
8.具有權利要求
1所述的突變的青黴素擴展酶的表達載體。
專利摘要
本發明涉及突變型青黴素擴展酶(expandase)，其在相應於野生型擴展酶的殘基位置的一個或多個殘基位置處包含胺基酸取代，所述殘基位置選自第42位的蘇氨酸、第50位的異亮氨酸、第57位的組氨酸、第67位的蘇氨酸、第133位的纈氨酸、第143位的蘇氨酸、第145位的脯氨酸、第148位的甘氨酸、第152位的苯丙氨酸、第196位的脯氨酸、第240位的丙氨酸、第281位的半胱氨酸、第309位的絲氨酸，條件是在第281位的半胱氨酸殘基位置處的胺基酸取代不是酪氨酸。
文檔編號C12N1/21GKCN1965083SQ200580018407
公開日2007年5月16日 申請日期2005年4月20日
發明者M·杜賴拉傑, V·維納亞加姆, V·蒂瓦裡, B·阿西爾, T·J·馬西拉馬尼, M·拉溫德拉納塞恩 申請人:幽蘭化學醫藥有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan