含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途的製作方法

2023-06-29 16:33:26

專利名稱：含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於工業微生物領域，涉及含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌在提高2-酮基-L-古龍酸混菌發酵性能中的應用。
背景技術：
氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵體系廣泛用於維生素C的工業生產中，用於將L-山梨糖轉化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。但該兩菌體系中，只有氧化葡糖桿菌能夠完成糖酸轉化，但其單獨培養時生長及其緩慢，產酸效率很低；而巨大芽孢桿菌作為促進氧化葡糖桿菌生長的伴生菌可以提高氧化葡糖桿菌的生長速率和產酸效率。因此提高氧化葡糖桿菌自身的糖酸轉化能力是提高混菌發酵生產效率的關鍵。分子生物學操作和代謝工程手段加快了菌株人工進化、能夠快速提高菌株特性， 可以基於基因信息有目的地高效改造菌株。專利CN1621518和專利CN1515669獲得了氧化葡糖桿菌進行糖酸轉化的關鍵酶——山梨酮脫氫酶的核酸序列。基於該信息可以對氧化葡糖桿菌進行分子水平改造，進而提高其與巨大芽孢桿菌混合發酵時的2-酮基-L-古龍酸混菌發酵性能。

發明內容
本發明的目的是通過代謝工程的手段來改造氧化葡糖桿菌，增加其山梨酮脫氫酶基因的拷貝數，提高氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌混菌發酵轉化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸的性能，提供一種含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途。本發明的技術方案概述如下含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養，獲得2-酮基-L-古龍酸。所述含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構建為(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴增採用細菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌基因組為模板；以SEQ ID No. 1所示序列為上遊引物，以SEQ ID No. 2所示序列為下遊引物，進行PCR擴增，回收如SEQ ID No. 3所示的PCR擴增產物；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構建取步驟(1)獲得的PCR擴增產物用HindIII酶和BamHI酶雙酶切；取載體pBBRl 用KpnI酶和HindIII酶雙酶切；連接，轉化入大腸桿菌DH5 α中，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體；(3)氧化葡糖桿菌的轉化取步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體在1800V條件下電擊轉化入氧化葡糖桿菌，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌。將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為4X108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108Cfu/ml，培養條件為在30°C，250rpm條件下培養120h，獲得 2-酮基-L-古龍酸；所述發酵培養基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調 pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。實驗證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養發酵，可以使L-山梨糖生產2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉化率提高。


圖1為含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。下面的內容及實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但並不用於限制本發明。本發明所使用的氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)保藏編號為CGMCC No. 1. 110，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)保藏編號為CGMCC No 1. 459，從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)購得。實施例1含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構建(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴增採用細菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)保藏編號為CGMCC No. 1. 110基因組為模板，取該基因組溶液1 μ 1,5XFastPfu buffer 4 μ l,20mM 的dNTP2 μ 1，20nM的以SEQ ID No. 1所示序列為上遊引物0. 4 μ 1，20ηΜ的以SEQ ID No. 2 所示序列為下遊引物0.4 μ 1，無菌水11. 8 μ 1，FastPfu酶0.4 μ 1，在PCR管中混合均勻； 將PCR管放入PCR儀中進行擴增循環，擴增程序為95°C 2min ；95°C 20s, 55°C 35s，72°C 2min，共25個循環；72°C 5min ；4°C 30min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產物條帶切下，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR擴增產物如SEQ ID No. 3所示；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構建取步驟(1)獲得的PCR 擴增產物溶液 8 μ 1，與 1μ 1 IOXdigest buffer,0. 5μ 1 HindIII酶，0. 5 μ 1 BamHI酶混合均勻，在37°C條件下進行酶切反應2小時；反應後產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將酶切產物條帶切下，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切PCR產物。取載體 pBBRlMCS溶液 8μ 1，與 1 μ IlOXdigest buffer, 0. 5 μ 1 KpnI 酶，0. 5μ1 HindIII 酶混合均勻，在37°C條件下進行酶切反應2小時；反應後產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將酶切產物條帶切下，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切載體產物。取酶切PCR產物5. 5 μ 1，酶切載體產物 3 μ 1，IOXligase buffer 1 μ 1, DNA ligase 0· 5 μ 1，混合均勻，在 22°C條件下進行連接反應30min。將連接產物用化學轉化法轉化入大腸桿菌DH5 α中，塗布於含抗生素的 LB固體培養基上，在37°C條件下培養12h。培養後獲得的單菌落在LB液體培養基中37°C培養12h，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體；(3)編碼山梨酮脫氫酶基因載體轉化入氧化葡糖桿菌將氧化葡糖桿菌塗布在固體培養基上，在30°C條件下培養48小時；用2ml無菌水將菌體洗下，冰浴lOmin，4°C，4000rpm離心5min後收集細胞，用預冷的無菌水洗一次，10% 甘油洗兩次後，100 μ 1 10%甘油重懸細胞；與步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體的水溶液10 μ 1混合均勻置於電轉杯中，冰浴5min，將電轉杯置於電轉儀中1800V電擊；電擊產物與900 μ 1種子培養基混合均勻，在30°C，140rpm條件下培養2小時，將培養物塗布於固體培養基上，在30°C條件下培養4天，獲得的單菌落轉入種子培養基中，在30°C，250rpm 條件下培養，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌；所述固體培養基為L_山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白腖 IOg,瓊脂 20g, KH2PO4Ig,MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，調 pH 為 6. 8，121°C滅菌 20min。所述種子培養基為L_山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白腖 IOg, KH2PO4Ig, MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，調 pH 為 6. 8，121°C滅菌 20min。實施例2混菌發酵將實施例1獲得的含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為 4X 108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108cfu/ml，發酵條件為在30°C，250rpm下培養120h，獲得2-酮基-L-古龍酸。所述發酵培養基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調 pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。實施例32-酮基-L-古龍酸和L-山梨糖含量測定採用高效液相色譜法(HPLC)。樣品製備取發酵培養不同時間的發酵液ImL於1. 5mL離心管中，lOOOOr/min轉速離心3min，取上清100 μ L於1. 5mL離心管中，並加入900 μ L流動相(5mM H2SO4)得到稀釋十倍的樣品。振蕩混勻後，用0. 22μπι的纖維素微孔濾膜過濾樣品，得到待測樣品。高效液相色譜條件色譜柱bio-rad HPX-87H，流動相5mM H2SO4,流速0. 6mL/ min,柱溫65°C，示差檢測器。檢測結果見圖1。圖例O 原始氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵；Δ 含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵。原始氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌利用實施例2的發酵條件進行搭配混菌發酵的2-酮基-L-古龍酸產率達到87%;用實施例1的方法獲得的含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵的2-酮基-L-古龍酸產率達到98% ；2-酮基-L-古龍酸產率提高了 12.6%。實驗證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養發酵，可以使L-山梨糖生產2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉化率提高。
權利要求
1.含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，其特徵是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養，獲得2-酮基-L-古龍酸。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵是所述含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構建為(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴增採用細菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌基因組為模板；以SEQ ID No. 1所示序列為上遊引物，以SEQ ID No. 2所示序列為下遊引物，進行PCR擴增，回收如SEQ ID No. 3 所示的PCR擴增產物；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構建取步驟(1)獲得的PCR擴增產物用HindIII酶和BamHI酶雙酶切；取載體pBBRl用KpnI 酶和HindIII酶雙酶切；連接，轉化入大腸桿菌DH5 α中，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體； (3)氧化葡糖桿菌的轉化取步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體在1800V條件下電擊轉化入氧化葡糖桿菌，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌。
3.根據權利要求1所述的用途，其特徵是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為4X108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108CfU/ml，培養條件為在 300C，250rpm條件下培養120h，獲得2-酮基-L-古龍酸；所述發酵培養基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調 pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。
全文摘要
本發明公開了一種含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養，獲得2-酮基-L-古龍酸。實驗證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發酵培養基中，培養發酵，可以使L-山梨糖生產2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉化率提高。
文檔編號C12P7/60GK102492762SQ201110407078
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者元英進, 杜瑾 申請人:天津大學