產生無標記物的轉基因植物的方法

2023-06-29 22:25:51

專利名稱：產生無標記物的轉基因植物的方法
技術領域：
本發明涉及植物轉化領域，以及產生轉基因植物細胞和植株的方法及產生無標記 物的轉基因植物的方法。提供了使用根癌土壤桿菌(Agrbobacterium tumefaciens)或發 根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株有效地共轉化植物細胞的方法。還提供了 適合於在這些方法中使用的土壤桿菌(Agrobacterium)菌株。
背景技術：
自20世紀80年代人們就開始開發遺傳修飾的或「轉基因的」植物以用於多種目 的，例如抵抗蟲害、除草劑或苛刻環境條件(所謂的「輸入性狀」，在作物生產中使農民受 益)，還有提高營養或健康價值(例如黃金稻、低亞麻酸大豆等)(所謂的「產出性狀」，使消 費者和加工工業受益)。雖然存在關於安全性的爭議，但新的轉基因植物正在被開發並且可 預計，在未來幾年具有價值增加的新性狀的轉基因植物產品將會投放市場。篩選標記基因的使用對於產生遺傳修飾植物是必不可少的以選擇導入了外源DNA 的植物細胞，但是在GM植物已產生後，所述篩選標記基因(一般是抗生素抗性基因或除草 劑抗性基因)變得毫無用處。由於多種原因，在GM植物中繼續存在篩選標記基因是不利 的。公眾關於遺傳修飾生物(GMO)的安全性的爭議已導致形成具有如下觀點的指導原則， 即認為抗生素抗性的篩選標記基因最好應不存在於批准的GMO中(EU directive 2001/18 EC)。對於希望以另外的目的基因(GOI)對現有GMO重新進行遺傳轉化的情況，也要求不存 在篩選標記基因(或者使用其他標記基因，但這會導致基因堆積)，因此使得可以以同一個 篩選標記物在新一輪轉化中進行新一輪選擇。使選擇標記物缺失的最直接方法是應用被稱為共轉化的方法，其中將用於選擇轉 化植物細胞的篩選標記物和目的基因(GOI)置於兩個不同的T-DNA(通常在兩個土壤桿菌 菌株中)上。將所述兩個T-DNA同時導入至植物細胞，但相互獨立地整合到所述植物核基 因組的不同位點。雜交後，兩基因隨後在下一代中分離，僅具有所述GOI的GM植物可被選 擇。然而，在該過程中，還得到了多種僅具有所述篩選標記基因的植物，這是因為在植物轉 化和再生過程中目的基因未被選擇。共轉化的難點是得到大百分比的包含這兩個基因的轉 化植物細胞(即同一植物細胞被這兩個基因「共轉化」)。用現有的共轉化方法，包含這兩 個基因的植物細胞的百分比(即共轉化效率)較低，因為許多細胞僅接受具有標記基因的 T-DNA，不接受具有GOI的T-DNA。該效率為50%或更低。亦見圖4A。共轉化的更詳細信息亦參見De Block et al. (1991)Theoretical Applied Genetics 82:257-263), Depicker et al. (1985)Molecular General Genetics 201 477-484 ；Matthews et al. (2001)Mol. Breeding 7 195-202 ；Daley et al (1998) PlantCell R印· 17 :489_496 ；McKnight et al (1987)PlantMolecular Biol. 8 :439_445 ；和 De Framond et al(1986)Mol. Gen. Genet. 202 :125_131。一些提高土壤桿菌介導的轉化的共轉化效率的方法已有描述。例如，Japan Tobacco使用「超二元(superbinary) 」載體開發了一種特殊的方法來應用共轉化原理，並且在菸草和稻中得到了 47%的共轉化植物(Komari et al. ,1996, Plant J. 10-165-174 ； US 5，731，179)。根特大學(University of Gent)的研究人員(De Buck et al.，1998， Mol. Plant. Microbe Interact 11 :449_457)報導了在中鼠耳芥屬(Arabidopsis)中的最 大50 %的共轉化，但還發現兩個T-DNA在相同座位經常共整合。在所有這些情況下，共轉化 通過同時應用兩種功能性土壤桿菌菌株進行，即其中每種菌株都可以將T-DNA轉移至植物 細胞中，並且在單獨使用時有利於轉移並整合至植物核基因組。然而，總體效率仍然較低或 者不可預測，使得該方法工作量巨大且費用很大。因此，本領域中通常使用其他轉化方法， 例如傳統方法，其中篩選標記物和GOI物理地連接於T-DNA上並在同一段T-DNA上轉移至 植物細胞。因此，選擇具有所述標記基因的所有轉化細胞還包含GOI，但除去所述標記基因 更困難。隨後使用位點特異性重組(使用例如Cre-Iox或FLP-frt體系)通過切割從植物 基因組除去所述標記基因(轉化後)。其他供選方案有例如使用轉座元件或者根本在無篩 選標記的情況下轉化(EP1279737)。亦見De Vetten et al. (2003) Nature Biotechnol. 21 439-442。因此，仍存在對具有高共轉化效率(理想地，接近100% )的共轉化方法的需求。 本申請提供了這類超高效率的共轉化方法，同時提供了合適用於所述方法中的菌株。土壤桿菌菌株包含Ti質粒，所述Ti質粒包含冠癭鹼(opine)合成區和冠癭鹼分 解代謝區、編碼Vir蛋白的毒力區和T-DNA區。在土壤桿菌介導的植物轉化中，傷口釋放化 學物質例如酚類化合物和糖被土壤桿菌的VirA跨膜蛋白識別。然後，所述VirA蛋白磷酸 化VirG蛋白，VirG蛋白可活化所述vir區的其他毒力基因的轉錄。VirDl和VirD2蛋白切割所述邊界，並且VirD2保持共價地連接至右邊界(Right Border) (RB)。VirB和VirD4蛋白可形成纖毛(pili)，用於將T_DNA/VirD2複合體轉移至 植物細胞中。VirEl結合於VirE2蛋白並被一塊轉移(獨立於所述T複合體)至植物細胞 質，所述VirEl蛋白在細胞質中釋放所述VirE2蛋白。然後，所述VirE2蛋白包被單鏈(ss) T-DNA以保護T-DNA免受核酸酶作用。這樣，完整T複合體將被轉移至核，其中VirE2在核 膜中形成通道以使所述T複合體可以進入至所述核中。在核中，VirD2參與到T-DNA整合 至植物基因組中。上述過程顯示於圖3中(Zhu et al，2000，Journal of Bacteriology 182(14) :3885-3895)。定義「轉化」和「轉化的」是指將DNA——一般是包含嵌合的目的基因(GOI)的DNA—— 轉移至植物細胞的核基因組，以形成包含轉基因的「轉基因」植物細胞和植物。由所謂的「順 式生成(cis-genesis)」——其中僅來自宿主自身的DNA序列被導入——形成所謂的「順 式基因(cis-genic)」植物也應理解為是「轉化」。導入的DNA通常但非總是整合在宿主植 物基因組中。無DNA整合的情形出現在例如有使用反向重複構建體產生用於基因沉默的雙 鏈RNA，或者使用編碼鋅指核酸酶或其他DNA修飾酶的DNA序列，所述DNA序列被臨時給予 植物細胞以獲得永久效應。「轉染」和「進行轉染」用於指T-DNA轉移至植物細胞中，即從植物細胞質轉移至核 之前的步驟。「共轉化」在本文中指以兩種不同的T-DNA——一種包含GOI且另一種包含篩選標 記基因——同時轉化植物細胞。根據本發明，所述兩種T-DNA分別存在於兩個不同的土壤
4桿菌菌株中。「共轉化效率」是指使用所述標記基因選擇的、包含整合至核基因組中的所述兩種 T-DNA的再生轉化植株(轉化體)的百分比(數目％ )。「無(篩選)標記物的植物」或「無標記物的轉基因植物」在本文中是指包含整合 至細胞核基因組的G0I、但缺少植物篩選(或可記錄的)標記基因的轉基因植物，所述轉基 因植物已經在所述轉化體後代中分離出來。「後代」、「下代」或「子代」可以是通過自交或雜 交得到並保留所述嵌合基因(即G0I)的第一代或後面的代。「T-DNA」(或「轉移-DNA」)或者「人工或嵌合T-DNA」是指在任一端包含右邊界 (RB)和左邊界(LB)序列的單鏈或雙鏈DNA，或者對於用於轉移GOI的人工T-DNA，是指至少 包含RB序列的單鏈或雙鏈DNA。出現在土壤桿菌Ti質粒中的「天然的」內源性T-DNA區也 稱為T-DNA，但在右邊界和左邊界之間包含用於腫瘤誘導的基因。為了進行植物轉化，使用 了「卸毒的(disarmed)」土壤桿菌菌株，其中這些腫瘤誘導基因(tms和tmr區)被缺失、替 換或去功能。然後將待轉移至植物細胞中的T-DNA導入所述卸毒株，通常在質粒或其他載 體上，例如在不整合到Ti質粒中的二元載體上或在通過同源重組整合到所述(卸毒的)Ti 質粒中的共整合載體上。基於Ti質粒的冠癭鹼基因可將土壤桿菌菌株和Ti質粒分成不同類型。Ti質粒可 包含冠癭鹼合成基因(在T-DNA區)和/或冠癭鹼分解代謝基因(在Ti質粒骨架)，例如 章魚鹼(octopine)、胭脂鹼(nopaline)或琥珀鹼(succinamopine)合成和/或分解代謝基 因。因此存在不同的「冠癭鹼型」 Ti質粒。「virE2輔助質粒」在本發明的上下文中是指這樣的質粒，即該質粒可導入至土壤 桿菌菌株中且包含土壤桿菌Ti質粒的至少一個virE2基因和/或至少一個完整VirE操縱 子，並且它會產生功能性virE2蛋白。「目的基因」(GOI)是指待整合到植物細胞核基因組中的嵌合基因。GOI可編碼目 的蛋白或者基因沉默構建體。「virE2供體株」是指能夠產生功能性virE2蛋白並且其中導入有或可導入包含 GOI的T-DNA的土壤桿菌菌株。"virE2突變株」是指不能產生功能性virE2蛋白並且其中導入有或者可導入包含 篩選標記基因的T-DNA的土壤桿菌菌株。該菌株在單獨使用時本身是無毒的(不能產生轉 化的植物細胞)，但在與(有毒力的)virE2供體株一起使用時能夠產生轉化的植物細胞。 因此Ti質粒上的內源性virE2基因被修飾，從而不會產生功能性virE2蛋白。「質粒」和「載體」在本文中可互換使用，是指可包含某些功能元件的DNA分子， 所述功能元件例如在用於DNA操作和複製的土壤桿菌和/或其他細菌(例如大腸桿菌 (E. coli))中起作用的複製起點(ori)、一個或多個目的基因、用於在細菌宿主或植物宿主 等中進行篩選的標記基因等。用於植物轉化中的公知的質粒有二元質粒(它不整合到Ti 質粒中且包含待轉移至植物中的T-DNA)、超二元載體、輔助質粒、Ti質粒、Ti輔助質粒等。「Ti質粒」是指出現在土壤桿菌菌種例如根癌土壤桿菌或髮根土壤桿菌中的天 然Ti質粒(在髮根土壤桿菌中它們被稱為Ri質粒，但為了簡便起見，在本文中使用Ti質 粒指這兩種質粒類型)，或者源自這些質粒且通常用於植物轉化中的Ti質粒，例如「卸毒 的」Ti質粒，它們是非致瘤的(缺乏T-DNA的功能性腫瘤誘導基因)，但包含Ti質粒的vir區。綜述參見 Hooykaas and Beijersbergen (Ann Rev Phytopathol 1994，32 157-179 或 W000/18939)。因此，天然Ti質粒是出現在土壤桿菌菌株中的環狀大DNA分子，包含毒力 (vir)區和T-DNA區(所述T-DNA區的側翼為RB和LB序列，並包含腫瘤誘導區(含有導致 生長素和細胞分裂素產生以及腫瘤發生的基因)以及鄰接所述腫瘤誘導區的冠癭鹼合成 區)，並且還含有冠癭鹼分解代謝區、複製起點和接合轉移區。內源性Ti質粒「被矯正(cured)的」土壤桿菌菌株是其中自有的Ti質粒已被除 去，並可將不同的Ti質粒導入其中的菌株。「LB」或「左邊界」以及「RB」或「右邊界」序列或者「T-DNA邊界」序列為約25bp的 短核苷酸序列，該序列在Ti質粒的T-DNA區側翼，並確定出從土壤桿菌轉移至植物細胞中 的DNA的端點。邊界序列記載於Gielen et al. (1984,EMBO J 3,835-845) 可以將RB禾口 LB序列加入至包含標記基因或GOI的人工T-DNA中，例如質粒可以包含可操作地連接的如 下DNA序列RB-基因(例如標記基因或GOI)-LB (任選)，這些序列可插入至質粒中，進而 插入至土壤桿菌菌株中，用於轉化植物細胞或植株。術語「核酸序列」(或核酸分子)是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子。「分離的核酸序列」是指脫離了分離出它的天然環境的核酸序列，例如在細菌宿主 細胞中或者在植物核基因組中的核酸序列。術語「蛋白」或「多肽」可互換使用，指由胺基酸鏈組成的分子，不涉及具體的作用 模式、大小、三維結構或來源。蛋白的「片段」或「部分」因此仍然可以稱為「蛋白」。「分離的 蛋白」用來指脫離了其天然環境的例如在體外或者在重組細菌或植物宿主細胞中的蛋白。術語「基因」意為包含這樣一個區域(轉錄區域)的DNA序列，該區域在細胞中被 轉錄成RNA分子(例如mRNA)，可操作地連接至合適的轉錄調控區域(例如啟動子)。基因 因此可以包含幾個可操作地連接的序列例如啟動子、包含例如參與翻譯起始的序列的5』非 翻譯前導序列(也被稱為5』 UTR,它對應於翻譯起始密碼子上遊的轉錄mRNA序列)、(蛋 白)編碼區(cDNA或基因組DNA)和包含例如轉錄終止位點和多腺苷酸化位點(如AAUAAA 或其變體)的3』非翻譯序列(也被稱為3』非翻譯區或3』 UTR)。「嵌合基因」(或重組基因)是指正常情況下並非天然存在於一個物種中的任何基 因，特別是核酸序列中存在在天然環境中彼此沒有關聯的一個或多個部分的基因。例如，啟 動子在天然環境中與部分或全部的轉錄區域或者與另一調節區域沒有關聯。術語「嵌合基 因」可以理解為包括表達構建體，其中的啟動子或轉錄調節序列可操作地連接至一條或多 條正義序列(例如編碼序列)或者連接至反義序列(正義鏈的反向互補序列)或反向重複 序列(正義序列和反義序列，由此所述RNA轉錄物在轉錄時形成雙鏈RNA)。「順式生成」和「順式基因」是指產生具有由轉化的植物物種的遺傳元件或密切相 關的(性別一致)物種的遺傳元件組成的基因的轉基因植物或植物細胞。順式基因包括其 內含子，並且側翼是它的正常有義方向的天然啟動子和終止子。順式基因植物可攜帶一個 或多個順式基因，但它們不包含任何嵌合基因。在本說明書通篇中清楚的是，不使用嵌合基 因而使用順式基因，或者除使用嵌合基因之外還可以使用順式基因，該實施方案囊括在本 文全文中。「反式地」是指存在於不同的DNA分子上，而「順式地」是指存在於同一 DNA分子 上。例如，土壤桿菌vir基因相對於待轉移的T-DNA可以反式地存在於土壤桿菌菌株中，而T-DNA邊界序列相對於以它們為側翼的目的基因是順式的。「3』 UTR"即「3』非翻譯序列」(也經常被稱為3，非翻譯區或3，端)是指在基因 的編碼序列的下遊存在的核酸序列，它包含例如轉錄終止位點和(在大部分但非全部的真 核mRNA中的)多腺苷酸化信號(例如AAUAAA或其變體)。在轉錄終止後，可以切除所述 mRNA轉錄物下遊的多腺苷酸化信號並且加上多腺苷酸尾，該尾參與到將mRNA轉運到細胞 質(進行翻譯的位置)。「基因的表達」是指如下的過程，即可操作地連接有合適的調節區域(特別是啟動 子)的DNA區域被轉錄成有生物活性的RNA，即所述RNA能夠被翻譯成具有生物活性的蛋 白或肽(或活性肽片段)或者它自身具有活性(例如在轉錄後的基因沉默中或RNAi中具 有活性)。活性蛋白在某些實施方案中是指由於存在阻遏域而具有負顯性功能的蛋白。編 碼序列優選為正義方向並編碼所需的、有生物活性的蛋白或肽或者活性肽片段(即由GOI 編碼的蛋白或肽)。在基因沉默方法中，DNA序列優選以反義DNA或反向重複DNA的形式存 在，包含反義方向或正義和反義方向的靶基因的短序列(正義和反義RNA可相互雜交形成 dsRNA或莖環結構)。「異位表達」是指基因在正常情況下不表達該基因的組織中表達。「轉錄調節序列」在本文中被定義為能夠調節可操作地連接於所述轉錄調節序列 的核酸序列的轉錄速度的核酸序列。本文定義的轉錄調節序列因此將包含啟動轉錄(啟動 子元件)、維持和調節轉錄(包括例如弱化子或增強子，也包括沉默子)必需的所有序列元 件。雖然提及的大部分是編碼序列上遊(5』 )的轉錄調節序列，但是在編碼序列下遊(3』 ) 存在的調節序列也囊括在該定義中。本文使用的術語「啟動子」是指起到控制一個或多個基因轉錄的作用的核酸片段， 它位於基因轉錄起始位點(轉錄起點被標示為序列的+1位置，相對於該位置的任何上遊核 苷酸使用負數標示)的轉錄方向的上遊(5』)，並且在結構上鑑定為存在DNA依賴的RNA聚 合酶結合位點、轉錄起始位點和任何其他DNA結構域(順式作用序列)，包括但不限於轉錄 因子結合位點、阻遏蛋白和激活蛋白結合位點以及本領域技術人員已知起到直接或間接調 節該啟動子的轉錄量的任何其他核苷酸序列。位於轉錄起點(+1)上遊的真核順式作用序 列的實例包括TATA盒(通常在轉錄起點的大約-20至-30的位置)、CAAT盒(通常在相對 於轉錄起點的大約-75的位置)、5』增強子或沉默子元件等。「組成型」啟動子是大多數生 理和發育條件下在大多數組織(或器官)中都有活性的啟動子。更優選地，組成型啟動子 在所有主要器官(例如至少葉、莖、根、種子、果實和花)的基本上所有的生理和發育條件下 都是有活性的。最優選地，所述啟動子在所有器官的大多數(優選所有)生理和發育條件 下都是有活性的。「誘導型」啟動子是受生理調控的啟動子(例如通過外部給予某些化合物)或受發 育調控的啟動子。「組織特異的」啟動子僅在特定類型的組織或細胞中有活性。本文使用的術語「可操作地連接」是指多核苷酸元件之間功能關係的連接。當一核 酸與另一核酸序列有功能關係時，該核酸是「可操作地連接的」。例如，若啟動子或轉錄調節 序列影響編碼序列的轉錄，則它們可操作地連接至該編碼序列。可操作地連接意思是被連 接的DNA序列通常是鄰接的，並且在需要把兩個蛋白編碼區域連接在一起時，是鄰接的且 在閱讀框內，從而產生「嵌合蛋白」。「嵌合蛋白」或「雜合蛋白」是由多個蛋白「結構域」(或 基序)構成的蛋白，這類蛋白自身在自然界中並不存在，而是被連接形成的功能蛋白，它展
7現出被連接的結構域(例如DNA結合域或引起負顯性功能的功能阻遏域)的功能性。嵌合 蛋白還可以是天然存在的兩種或多種蛋白的融合蛋白。本文使用的術語「結構域」意思是 具有特定結構或功能的蛋白的任何部分或結構域，該蛋白的所述部分或結構域可以被轉移 至另一種蛋白，用於提供至少具有所述結構域的功能特徵的新的雜合蛋白。術語「靶向肽」指把蛋白靶向至胞內細胞器例如質體(優選葉綠體、線粒體)或者 靶向至細胞外間隙(分泌信號肽)的胺基酸序列。編碼靶向肽的核酸序列可以與編碼蛋白 氨基末端(N-末端)的核酸序列(在閱讀框內)融合。「核酸構建體」、「載體」或「質粒」在本文可理解為使用重組DNA技術產生並用於把 外源DNA送遞至宿主細胞的人造(通常為環狀)核酸分子。載體骨架可以是例如二元或超 二元載體(例如參見US 5，591，616、US2002138879和WO 95/06722)、共整合載體(它整合 至Ti質粒中)或T-DNA載體(這是本領域已知的並且如本文其他部分所述)，其中整合有 嵌合基因，或者，若已存在合適的轉錄調節序列/啟動子，則僅所需的核酸序列(如編碼序 列、反義序列或反向重複序列)被整合於該轉錄調節序列/啟動子的下遊。載體通常包含有 利於將其用於分子克隆的另外的遺傳元件，例如篩選標記物、多克隆位點等等(見下文)。「宿主細胞」、「重組宿主細胞」或「轉化的細胞」是指將至少一種核酸分子引入細 胞後產生的新個體細胞(或生物體)的術語，所述至少一種核酸分子尤其包含編碼所需蛋 白的嵌合基因或者包含編碼在轉錄時產生沉默靶基因/基因家族的反義RNA或反向重複 RNA (或髮夾RNA)的核酸序列。所述宿主細胞優選是植物細胞，但也可以是細菌細胞(例如 土壤桿菌菌株)、真菌細胞(包括酵母細胞)等等。所述宿主細胞可以包含作為染色體外 (附加型)複製分子的核酸構建體，或者包含整合進入宿主細胞核的嵌合基因。術語「篩選標記物」或「可記錄標記物」是本領域普通技術人員熟悉的術語，並且 在本文用來描述當其被表達的時候可以用於選出包含所述篩選標記物的細胞的任何遺傳 實體，例如，「植物篩選標記基因」可用於選出包含該基因的植物細胞。篩選標記基因產物 賦予例如抗生素抗性或者更優選除草劑抗性或其他可選擇的性狀，例如表型特徵(例如色 素沉著的變化)或營養需求。術語「報告物」主要用於指可見的標記物，例如綠色螢光蛋白 (GFP)、eGFP、螢光素酶、GUS等等。術語「同源的」和「異源的」是指核酸或胺基酸序列與其宿主細胞或生物體之間的 關係，特別是在轉基因生物體的情況下。因此，同源序列在宿主物種中天然存在(例如用番 茄基因轉化的番茄植株)，而異源序列不會在宿主細胞中天然存在(例如用馬鈴薯植物的 序列轉化的番茄植株)。在本文及權利要求書中，動詞「包含」及其變化形式使用其非限制含義，意為包括 該詞之後接著的項目，但是並不排除沒有明確指出的項目。另外，用不定冠詞「a ( —)」或 "an ( 一種)」提及要素時並不排除存在超過一種/個所述要素的可能性，除非文中清楚地要 求有且僅有一種/個該要素。不定冠詞「a( — ) 」或「an (—種)，，因此通常指「至少一種/ 個」。還需要理解，如果在本文中提及「序列」，其通常是指具有亞單位(例如核酸或胺基酸) 的某個序列的現存的實體分子。每當提及製備本發明的一種「植物」或「多種植物」(或數種植物)的時候，需要 理解的是，除非另外指出，否者在本文中還包括植物部分(細胞、組織或器官、種子、切除或 收穫的部分、葉、幼苗、花、花粉、果實、莖、根、愈傷組織、原生質體等等)、保留親本區別特徵(例如存在轉基因)的植物的子代或克隆繁殖物，例如通過自交或雜交獲得的種子(例如雜 種種子(通過兩個近交的親本系雜交獲得))、雜交植株及來源於它們的植物部分。術語「大體同一 」、「大體同一性」、「基本相似」、「基本相似性，，或「變體，，是指兩條 肽序列或兩條核苷酸序列在例如通過使用默認參數的程序GAP或BESTFIT進行最佳比對 時，共享至少某百分數的序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比對算法在其整 個長度上比對兩條序列，它使匹配的數目最大化並使空位的數目最小化。通常使用GAP的 默認參數，其空位產生罰分=50 (核苷酸)/8 (蛋白)，空位擴展罰分=3 (核苷酸)/2 (蛋 白)。對核苷酸而言，使用的默認打分矩陣是nwsgapdna，而對蛋白而言，默認打分矩陣是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。很清楚的是，當稱 RNA 序列與 DNA序列基本相似或者具有某一程度的序列同一性時，所述DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被認 為等同於所述RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比對和序列同一性百分數得分的確定可通過 以下方法實現使用電腦程式例如軟體包GCG Wisconsin (10. 3版，可從Accelrys Inc.， 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752USA 獲得)，或者使用 EmbossWIN(2. 10.0 版)中的程序「needle」，使用與上文所述相同的GAP參數，或者使用空位開放罰分10. O和 空位擴展罰分0. 5，使用DNAFULL作為矩陣。為了比較長度不近似序列之間的序列同一性， 優選使用局部比對算法，例如，在例如EmbossWIN的程序「water」中使用的Smith Waterman 算法(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1) ； 195-7)。默認參數是空位開放罰 分10. O和空位擴展罰分0. 5，對於蛋白使用矩陣BloSSum62，對於核酸使用矩陣DNAFULL。
具體實施例方式本發明提供了一種超高效的共轉化方法，其具有超過50%的共轉化效率，特別是 等於或大於60%、70%、80%或90%的共轉化效率，尤其是有約100%的共轉化效率。本發明人發現，兩株土壤桿菌——一株包含功能性virE2蛋白基因(virE2供體 株)，而一株不能產生功能性virE2蛋白(virE2突變株)——可用於實現很高的共轉化效 率。所述virE2突變株單獨使用能夠將它自己的含篩選標記基因的T-DNA鏈運輸至植物細 胞中(即轉染該細胞)，但它不能進一步處理所述T-DNA，因此不能將所述T-DNA整合至所 述植物細胞的核基因組中，即不能製備含所述篩選標記基因的轉化植物細胞和植株。如果使用virE2供體株與所述virE2突變株一起共接種，那麼所述供體株的virE2 蛋白和T-DNA(包含G0I)就被轉移至所述植物細胞中。由所述供體株產生的virE2蛋白進 入所述植物細胞，並關聯於包含所述GOI的T-DNA和包含所述篩選標記基因的T-DNA (從所 述virE2突變株導入)，從而能夠使此兩種T-DNA整合至同一植物細胞的核基因組中。因 此，僅那些由所述virE2供體株和所述virE2突變株二者共接種的植物細胞能夠將此兩種 T-DNA整合至所述核基因組中。對基於所表達的篩選標記基因賦予的表型的選擇使得可選 擇出至少約60%或更高(最高至100%)的包含被同時整合至轉化體核基因組中的標記基 因和GOI的轉化體。因為不同的T-DNA整合至基因組中的隨機位置，所以它們是遺傳獨立 的，並且隨後在所述轉化體的後代中會出現所述GOI和所述標記基因的分離，從而使得標 記基因與所述GOI能夠被篩選開(產生僅包含目的基因、不包含所述篩選標記基因的無標 記物植株)。因此，在一個實施方案中提供了一種製備包含目的基因的(無標記物)轉基因植物的方法，所述方法包括如下步驟a)提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基因的virE2供體株，以 及不能產生功能性virE2蛋白的virE2突變株，b)將包含目的基因的T-DNA導入所述virE2供體株，c)將包含篩選標記基因的T-DNA導入所述virE2突變株，d)將植物細胞與兩菌株接觸(例如共接種或共感染)，以及e)利用由所述篩選標記基因產物賦予的表型選擇植物細胞和/或再生的植株(或 小植株)，以及任選f)使所選的植株(或者來自所選的植物細胞的植株或小植株)雜交和/或自交以 產生後代，以及任選g)丟棄那些包含所述篩選標記基因的後代並保留那些包含目的基因但缺少所述 篩選標記基因的後代(即使所述標記基因與目的基因分離開，以產生包含目的基因的無 標記物的植株)。使用本領域中已知的方法，並與本發明的2株土壤桿菌相結合，任何可以以土壤 桿菌菌株轉化的植物宿主——即單子葉植物物種或雙子葉植物物種——均可依照本發明 進行轉化。例如，參見 Fraley et al. (1983, Proc Natl Acad Sci USA 80 4803 ；Comai et al. (1994，Nature317 :741)，Shah et al. (1986，Science 233:478)以及有關土壤桿菌介導 的基因轉移的其他文獻。使用土壤桿菌來轉化植物細胞，然後從所述轉化的植物細胞再生 轉化植株，這可使用例如記載於EP O 116 718、EP O 270 822、PCT公開文本WO 84/02913 和公布的歐洲專利申請EP 0 242 246以及記載於Gould et al. (1991,Plant Physiol. 95， 426-434)中的步驟。用於土壤桿菌介導的植物轉化的T-DNA載體的構建是本領域中公知 的。所述T-DNA載體可以是如EP O 120 561和EP O 120 515中所述的二元載體，也可以 是如EP 0 116 718中所述的可通過同源重組整合至土壤桿菌Ti質粒中的共整合載體。所述方法的步驟(a)涉及提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基 因的virE2供體株(virE2+株)，以及不能產生功能性virE2蛋白的virE2突變株(virE2° 株)。當以此兩菌株共感染植物細胞時，所述virE2+株能夠補充所述virE2°株，並且所述 一個菌株提供的virE2蛋白會導致兩T-DNA(所述第一菌株和所述第二菌株轉染的T-DNA) 整合至所述轉染植物細胞的核基因組中。所述virE2蛋白可以不依賴於T-DNA鏈進入植 物細胞這一事實本領域中已通過互補實驗進行了證明，其中以2株土壤桿菌一一一株缺乏 T-DNA但包含功能性virE2，另一株缺乏virE2但包含T-DNA——共感染得到了包含整合於 基因組中的 T-DNA 的植物細胞(Otten et al. 1984 Mol Gen Genet 175,159-163 ；Dombek and Ream J of Bacteriol 1997，Vol. 79，1165-1173)。然而，迄今為止還不知道該發現結 果能夠被開發用於顯著地提高植物細胞的共轉化效率，並且尚無人將包含植物篩選標記基 因的T-DNA導入virE2°株且將包含GOI的T-DNA導入virE2+株，並且將這兩菌株一起用於 植物細胞的共感染以產生無標記物的植株。在Dombek and Ream(1997，見上文)中，提供所 述功能性virE2蛋白的菌株不含T-DNA並且也不包含目的基因，因為該文獻中的想法是在 另一無效株中測試所述virE2蛋白是否在功能上補充所述virE2突變，以研究virE2的天 然功能。同時，所使用的突變株/無效株是致瘤的和非卸毒的，這會導致在功能性互補的情 況下的腫瘤發生。在本發明中優選使用卸毒Ti質粒，並因此使用卸毒土壤桿菌菌株。
此外，本發明人驚奇地發現，在所述供體株中使用至少一個另外的virE2基因似 乎可提供這樣的virE2蛋白量，即該量足以用於使此兩種不同的T-DNA關聯起來，並足以 用於將它們轉移至同一植物細胞的核基因組中。因此，在本發明的優選實施方案中，所述 virE2供體株包含至少兩個virE2基因，每個基因均編碼功能性virE2蛋白。所述virE2基 因可整合至所述菌株內基因組DNA、Ti質粒和/或另外的質粒中，並且無需(雖然它們可 以)存在於同一遺傳元件上。任選地，所述virE2供體株還可包含另外的virG基因，該基因編碼功能性virG 蛋白。因此，在一個實施方案中，所述菌株包含至少2個virE2基因和至少2個virG基 因，它們都編碼功能性蛋白。所述基因可以通過如下啟動子轉錄天然啟動子(即天然 virE2和virG啟動子)或在土壤桿菌中有功能的不同啟動子，例如誘導型啟動子、組成型 啟動子、來自其他土壤桿菌菌株的virE2或virG的啟動子，等等。來自多種菌株的根癌 土壤桿菌VirG核酸和蛋白序列在本領域中是可獲得的，參見例如Schrammeijer (Journal of Experimental Botany, Vol.51, No. 347, pp. 1167-1169，June 2000)或者 GenBank 登記號 X62885(SEQ ID NO :4)、NP 059810、AAA91602 等。VirG 蛋白因此在與例如 SEQ ID NO :4(X62885)的蛋白或 EHA105 (pTiBo542)的 VirG (Chen，C. Y. et al. Mol. Gen. Genet. 230 (1-2)，302-309 (1991))比對時有例如至少 80 %、90 %、95 %、98 %、99 % 或更高 的胺基酸同一性。virE2 供體株合適的virE2供體株包括能夠天然感染植物細胞的任何土壤桿菌菌株，例如根癌 土壤桿菌菌株和髮根土壤桿菌菌株。該菌株優選包含攜帶天然(野生型)VirE操縱子，並 因此包含天然virE2基因的Ti質粒(優選卸毒的)。通常用於植物轉化方法中的任何土壤 桿菌菌株均是合適的，條件是所述菌株是有毒力的。所述菌株優選是卸毒的，即出現於根癌 土壤桿菌的天然T-DNA區上的tmr和tms基因被除去或者去功能，使得在T-DNA轉移後不 形成植物腫瘤。可以將天然Ti質粒的整個天然T-DNA區除去，以將所述菌株卸毒。所述Ti 質粒和/或土壤桿菌菌株可以為任何冠癭鹼類型，但在一個優選的實施方案中使用了琥珀 鹼Ti質粒，它包含用於琥珀鹼分解代謝的基因。琥珀鹼Ti質粒在本領域中是可獲得的(例 如菌株EHA105)。應理解，(卸毒的)Ti質粒可以在土壤桿菌之內及之外操作，並且可導入 或轉移至任何土壤桿菌菌株中，例如矯正了其天然Ti質粒的菌株。同樣，可將其他質粒導 入土壤桿菌菌株，提供另外的功能，例如待導入所述植物細胞中的T-DNA、額外的virE2和/ 或virG基因等。另外，可將遺傳元件可導入至所述菌株的基因組DNA。因此，根據本發明， 可將本文中提到的遺傳元件導入至土壤桿菌菌株的一個或多個不同部分，例如一種或多種 Ti質粒，一種或多種另外的質粒，基因組DNA等。縱使這一點在本說明書中未被明確提及， 也應理解它涵蓋在本文中。替代存在於所述(優選卸毒的)Ti質粒上的virE2基因的是，可將一個或多個另 外的virE2基因相對於如下所述的其他vir基因順式地或反式地提供，或者，除了存在於所 述(優選卸毒的)Ti質粒上的virE2基因之外，還可將一個或多個另外的virE2基因相對 於如下的其他vir基因順式地或反式地提供，所述其他vir基因天然出現於土壤桿菌菌株 的Ti質粒上且是毒力所需的。因此，在一個實施方案中，所述土壤桿菌菌株在Ti質粒、基 因組DNA和/或另外的質粒上包含一個或多個virE2基因。
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例如，將包含編碼功能性virE2蛋白的virE2基因的一種或多種質粒(例如所述 Ti質粒和/或其他質粒)導入所述菌株，所述virE2基因可操作地連接於在所述菌株中具 有活性或可誘導的合適轉錄調節區。所述質粒還可包含出現在土壤桿菌Ti質粒中的完整 virE操縱子。優選至少2個編碼功能性virE2蛋白的基因存在於所述菌株中，但也可以存 在更多個，例如3個、4個、5個或更多。包含Ti質粒和至少一個編碼功能性virE2蛋白的 virE2基因的卸毒土壤桿菌菌株在領域中可廣泛獲得。可以使用已知方法導入另外的virE2基因，例如通過將virE2基因的編碼序列可 操作地連接於土壤桿菌中的活性啟動子(例如天然virE2啟動子)，並將所述基因插入合適 的質粒和/或插入所述菌株的Ti質粒和/或插入基因組DNA中。另外的virE2基因例如可 插入至所述Ti質粒的vir區中，或者插入至所述Ti質粒的另一位置。在一個實施方案中， 至少2個virE2基因反式地存在於同一個遺傳元件例如所述Ti質粒或另一質粒上。在另 一個實施方案中，至少2個virE2基因以順式地存在於不同遺傳元件上。例如，一個virE2 基因在Ti質粒上，而一個virE2基因在輔助質粒上。所述virE2基因編碼功能性VirE2蛋 白。此外，所述virE2供體株還包含至少一個，任選至少2個、3個、4個或更多個編碼 功能性virEl蛋白的virEl基因，virEl蛋白負責將所述virE2蛋白運輸至植物細胞。所述 virEl基因可存在於土壤桿菌基因組、Ti質粒(即，所述Ti質粒可包含天然virEl基因和啟 動子，並且/或者可插入一個或多個其他virEl基因和啟動子)和/或另一質粒上。因此， 在一個實施方案中，用於導入所述virE2基因的所述Ti質粒或其他質粒還可包含至少一個 virEl基因，所述virEl基因優選可操作地連接於土壤桿菌中有活性的啟動子，例如virE操 縱子啟動子。編碼土壤桿菌virE蛋白的基因在本領域中是可獲得的，參見例如GenBank登 記號 AAZ50537 (SEQ ID NO :5 ;pTiBol52 的 virEl)。「VirEl 」 包括變體，例如與 SEQ IDNO 5有至少80%、90%、95%、98%、99%或更高胺基酸序列同一性的virE2蛋白。優選所述菌株在與virE2突變株共接種時能夠產生足夠的virE2蛋白，以關聯於 所述virE2突變株提供的單鏈T-DNA(包含標記基因的T-DNA)和所述virE2供體株提供的 單鏈T-DNA(包含GOI的T-DNA)。是否產生了「足夠的」virE2蛋白可由本領域技術人員使 用常規實驗進行確定，例如如果共轉化效率低於50%，那麼產生的virE2蛋白可能不足，需 要通過例如加入一個或多個另外的virE2基因(例如在輔助質粒上)增加該水平。所述virE2基因已被克隆並且可根據需要導入至任何質粒和/或土壤桿菌菌 株中。SEQ ID NO =KcDNA)和 SEQ ID NO :2(SEQ ID NO :1 編碼的蛋白)提供了 Ti 質 粒PTiBo542的virE2基因/蛋白。VirE2基因和蛋白也可在公共資料庫中獲得，參見 AAZ50538 (來自 pTiBo542 的 virE2)、NP 059819 等。SEQ ID NO 3提供了在其開放閱讀框中有插入物的virE2基因。所述插入通過如 下方式產生將包含部分的所述virE2開放閱讀框(ORF)的質粒整合(同源重組)至天然 virE20RF中。所述插入物可出現在所述virE20RF的任意位置，在本申請中出現在SEQ ID NO 1的第203號核苷酸之後。因此，在本申請中作為CBS121809保藏的所述virE2突變株 包含具有SEQ ID NO :3的Ti質粒(包含SEQ ID NO 1的中斷形式)，導致在體內無virE2 蛋白產生(見下文)。明顯地，使用本領域中已知的方法可以製備或鑑定(例如通過計算機)或者從土壤桿菌菌株分離編碼功能性virE2蛋白的其他virE2序列。本發明的virE2基因涵蓋編碼 基本相似的胺基酸序列的基因(也稱為「變體」)，例如編碼與SEQ ID NO 2有至少70%， 優選至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或更高胺基酸序列同一性(在全長上使用兩兩 比對，例如使用EmbossWin的程序「needle」，空位產生罰分10. 0且空位擴展罰分0. 5，使用 BloSum62作為矩陣)的核苷酸序列。因此，編碼功能性virE2蛋白或其變體(例如同源物) 的virE2基因可分離自其他生物體，特別是其他土壤桿菌菌株，並且可以用於在所述virE2 供體株中產生功能性virE2蛋白。其他的virE2核酸和/或胺基酸序列還可在DNA和/或 蛋白資料庫中用計算機進行鑑定，或者通過核酸雜交或PCR使用所述virE2序列或其部分 作為探針或引物進行鑑定。這同樣適用於上文進一步描述的virG和VirEl基因和蛋白(以 及它們的變體)。使用例如實施例中描述的互補測定，可容易地測試所編碼的virE2蛋白和/或變 體的功能。明顯地，本發明的virE2核酸序列還涵蓋變體，例如與SEQ ID NO :1有至少70%， 優選至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高核酸序列同一性(在全長上使用兩兩比 對，例如使用EmbossWin的程序「needle」，空位產生罰分10. 0且空位擴展罰分0. 5，使用 DNAfull作為矩陣)的核酸序列。virE2 突變株用於本發明方法的第二菌株是不能產生功能性virE2蛋白的virE2突變株。當提 及「無功能性virE2被製造」時包括這樣的可能性，即根本無virE2蛋白被所述菌株製造/ 可以被其製造，或者無功能的蛋白被製造/可以被製造。同時，可以使用任何土壤桿菌菌株和任何Ti質粒，條件是出現於所述(優選卸 毒的)Ti質粒上的內源性virE2基因被修飾，使得沒有功能性蛋白被製造/可以被製造。 VirE2突變株可通過類似於實施例中對EHA105-dE2(CBS121809)描述的方式進行製備，通 過例如以同源重組方式將質粒插入至所述virE20RF中。明顯地，在本領域中有許多其他方 法可獲得相同的結果。所述Ti質粒上的virE2基因(例如SEQ ID NO=I或其變體)的整 體或部分的插入、缺失和/或替換會形成virE2突變株，以及包含突變體virE2基因或缺少 virE2基因的Ti質粒。在提及「突變體」 virE2基因時，涵蓋導致基本沒有功能性virE2蛋 白被製造的任何遺傳修飾，即編碼virE2蛋白的DNA的整體或部分的插入、替換或缺失的突 變/遺傳修飾。突變體virE2基因還可以是分離的，或者通過合成或使用分子生物學技術 製備；然後可以用於替換Ti質粒上的功能性virE2基因，以用於所述菌株中。virE2活性的缺失可以如實施例中所述進行確定。或者，可以如已知使用其他的測 定法。在本發明的一個實施方案中，所述virE2突變體為以登記號CBS121809保藏的菌 株(或其衍生菌株)，或者其中包含所述Ti質粒的或其中包含所述突變體virE2基因的土 壤桿菌菌株。可以將包含所述virE2突變體基因的Ti質粒轉移至另一菌株例如經矯正的 菌株中。或者，所述突變體基因可以從所述保藏株分離，並轉移至另一菌株和/或另一 Ti 質粒中。另一些VirE2突變體土壤桿菌菌株在本領域中也已被記載，但這些菌株還未曾用 於共轉化方法中，而是僅用於研究virE2的功能。例如，Simone et al. 2001 (Mol MicrobiolVol 41 1283-1293), Dombek and Ream(1997, J of Bacteriology Vol 179 :1165_1173)， Binns et al. (1995，J of Bacteriol. Vol 177 :4890_4899)和 Stachel and Nester (1986 ； EMBO J Vol. 5 :1445-1454)描述了 virE2突變體和virE2突變株的產生。然而，該菌株不 是卸毒的並且它們未用於共轉化中，即互補測定利用了野生型菌株提供功能性virE2，然而 其不包含具有GOI的T-DNA。另外，所有這些virE2突變株都是章魚鹼型菌株。上述參考文獻中描述的virE2突變株也可用於本發明中，但優選在使用前對這些 菌株進行卸毒。所述菌株包括包含其中virE2被nptll替換的pTiA6NC的根癌土壤桿菌 菌株WR5000 (Dombek and Ream，見上文，參見其中的圖1)或通過突變(例如出現於菌株 A348中的)所述Ti質粒pTiA6NC上的virE2基因得到的另一 virE2突變體；Binnes et al.(見上文)的表1中列出的根癌土壤桿菌菌株，例如其中質粒被整合至virE2的ORF中的 A348: :virE2 ；Stachel and Nester (見上文)中描述的土壤桿菌菌株358mx，在所述virE2 基因中包含轉座子插入。基本而言，任何土壤桿菌菌株均可被修飾以在所述virE2基因中包含突變或者以 缺失所述virE2基因。在本發明的一個實施方案中，提供了所述virE2突變株和/或virE2 突變體Ti質粒，其中所述突變株和/或Ti質粒為琥珀鹼Ti質粒，以及/或者包含這類質 粒的菌株。因此，在一個實施方案中，本發明的virE2突變株優選為琥珀鹼菌株，例如攜帶 來自pTiBo542(EHA101，EHA105)的Ti質粒。這些菌株具有寬泛的宿主範圍；這意味著它們 能夠轉化許多不同的植物宿主物種。所述virE2基因包含所述virE2基因的整體或部分的插入、缺失或替換，從而使 得無法製得所述virE2蛋白，或者所述virE2蛋白沒有功能(例如被截短或者未正確地折 疊)。在一個實施方案中，所述virE2突變株為以登記號CBS 121809保藏的EHA105_dE2，並 且所述Ti質粒為位於該菌株中的質粒，或者它們中任一個的衍生物。同時，提供了如SEQID NO 3中所示的分離的突變體virE2DNA，包含在SEQ ID NO 1的virE2 cDNA中的插入(敲 除)。SEQ ID NO :3示出了所述突變株的整個VirE操縱子區，所述突變株包含插入至所述 virE2 ORF中並且在加工中使其中斷的質粒。因此，在本發明的一個實施方案中，所述virE2突變株在所述virE2基因中包含一 個或多個插入、缺失和/或替換，其中所述virE2基因的部分或全部被缺失和/或替換，並 且/或者其中DNA被插入，由此所述變化會導致無法製造任何virE2蛋白或者導致製造出 無功能的virE2蛋白(例如截短的無功能蛋白)。在該方法的步驟(b)中，將包含目的基因的T-DNA導入所述virE2供體株，並且在 所述步驟中(c)，將包含篩選標記基因的T-DNA導入至所述virE2突變株中。因此，提供了 合適的T-DNA，包含例如可操作地連接的元件例如RB和(任選的)LB、G0I或標記物。可以 使用標準的分子生物學方法製備所述T-DNA。優選地，所述T-DNA在質粒載體上，例如二元 載體或共整合載體。所述T-DNA或包含所述T-DNA的載體導入至所述土壤桿菌菌株可通過 例如電穿孔實現。因此，在所述方法的一個實施方案中，所述T-DNA被導入至DNA載體或質粒上，並 且所述T-DNA至少包含右邊界序列。GOI可以為任意基因，不管是否編碼蛋白或具有不同的功能，例如(但不限於)選 自用於生物應激耐受和/或非生物應激耐受、疾病抗性、除草劑抗性、農藝性狀、產出性狀等的基因(編碼序列，例如cDNA或基因組DNA)。所述GOI可以為植物基因或來自植物的基 因，或者天然存在於細菌、真菌、動物(包括人)等中的基因。在一個實施方案中，所述基因 為順式基因。合適的編碼序列的基因組DNA和cDNA在本領域中是可以獲得的，例如從核酸 資料庫中獲得。標記基因包括植物篩選標記物，例如(但不限於)抗性基因(例如抗生素抗性、除 草劑抗性等)，或者賦予可用於選擇轉化體的性狀的其他基因，例如賦予表型性狀的基因。在步驟(d)中，將待轉化的植物、植物部分、植物細胞或組織在合適的條件下與合 適量和/或合適比例的兩菌株(即至少1株virE2供體株和至少1株virE2突變株)接觸 (例如共接種或共感染)合適的時長，這例如如成熟的土壤桿菌轉化方案或其修改方案中 所述。番茄轉化參照和步驟概要參見實施例2。共接種或共感染在本文中是指兩者在物理 上一起(作為混合物或同時)加入至細胞/組織，或者指所述菌株被先後加入。在先後接 觸的情況下，優選首先加入包含所述GOI的菌株，這是因為所述GOI (通常)不能被選擇；然 後在短時間間隔內加入包含所述的篩選標記基因的菌株。例如，所述植物細胞或組織可以是子葉的外植體，或本領域中已知的其他組織，例 如根培養物、葉盤等。或者，可以接觸植株的部分或全部，例如通過浸潤。用於土壤桿菌 轉化的方法是本領域中已知的，並且可根據本發明使用。所述植物細胞、組織或植株可以 是適應土壤桿菌轉化的任何物種。因此，任何植物例如單子葉植物或雙子葉植物都可能 是合適的，所述植物例如，玉米(maize/corn)(玉蜀黍屬(Zea)的種例如玉米(Z. mays)、 大當草(Z. diploperennis) (chapule)、繁茂大當草(Zea luxurians)(瓜地馬拉大當 草)、玉米亞種 huehuetenangensis(San Antonio Huista 大芻草)、墨西哥玉米(Z. mays subsp. mexicana)(墨西哥大芻草)、玉米亞種parviglumis(巴爾薩斯大芻草(Balsas teosinte))、Ζ· perennis (多年生大芻草)和Z. ramosa、小麥(小麥屬的種)、大麥(barley) (例如大麥(Hordeum vulgare))、燕麥(oat)(例如燕麥(Avena sativa))、高梁(sorghum) (高粱(Sorghum bicolor))、黑麥(rye)(黑麥(Secale cereale))、大豆(soybean)(大豆 屬(Glycine)的多個種例如大豆(G. max))、棉花(棉屬的種例如陸地棉(G. hirsutum)、海 島棉(G. barbadense))、芸苔屬的多個種(例如甘藍型油菜(B. napus)、芥菜(B. juncea)、甘 藍(B. oleracea)、蕪青(B. rapa)等)、向日葵(sunflower)(向日葵(Helianthus annus))、 菸草(菸草屬(Nicotiana)的種)、苜蓿(alfalfa)(紫花苜蓿(Medicago sativa)), 稻(稻屬(Oryza)的種例如印度稻(0. sativa indica)栽培種或日本稻(0. sativa japonica)栽培種)、牧草、珍珠粟(pearl millet)(狼尾草屬(Permisetum)的種例如 珍珠粟(Pennisetum glaucum))、樹類物種、蔬菜類物種例如番茄屬(Lycopersicon)的 亞種(最近被重新分為茄屬(Solanum))，如番茄(tomato)(普通番茄(L. esculentum)， 異名番茄(Solanum Iycopersicum))例如櫻桃番茄(變種cerasiforme)或現代番茄 (current tomato)(變禾中 pimpinellifolium))或樹番爺(tree tomato) (S. betaceum，異 名樹番爺(Cyphomandra betaceae))、馬鈴薯(potato)(馬鈴薯(Solanum tuberosum)) 和其他茄屬物種例如茄子(eggplant)(茄子(Solanum melongena))、人參果(ρ印ino) (人參果(S. muricatum)) > cocona(S. sessilif lorum)禾口 naranjilla (S. quitoense)；古月 椒類(peppers)(辣椒(Capsicum annuum)、/J、米椒(Capsicum frutescens)) >i^isi (pea) (例如豌豆(Pisum sativum))、菜豆(bean)(例如菜豆屬(Phaseolus)的種)、胡蘿蔔(carrot)(胡蘿蔔(Daucus carota))、萬宦屬的種(例如萬宦(Lactuca sativa)、山萬 H (Lactuca indica)、宿f艮萬H (Lactuca perennis)) > (cucumber) ( (Cucumis sativus))、舌甘瓜(melon)(舌甘瓜(Cucumis melo))、西葫聲(zucchini)(西葫聲(Cucurbita pepo))、胃 /R (squash)(胃 /R (Cucurbita maxima) > M(Cucurbita pepo) > Hf /R
(watermelon) (M/R (Citrullus lanatus), ^^M/R (Citrullus vulgaris))、I^MIt白勺 物種(葡萄、桃、李、草莓、芒果、甜瓜)、觀賞植物的物種(例如玫瑰、碧冬茄屬(Petunia)、 菊屬(Chrysanthemum)、百合、鬱金香、大丁草屬(Gerbera)的種)、木本樹(例如楊屬 (Populus)、柳屬(Salix)、櫟屬(Quercus)、桉屬(Eucalyptus)的種)、纖維植物的物種例如 亞麻(flax)(亞麻(Linum usitatissimum))禾口大麻(hemp)(大麻(Cannabis sativa))。 在一個實施方案中優選蔬菜類物種，特別是茄屬的種(包括番茄屬的種)。因此，可以轉化例如以下屬的種南瓜屬(Cucurbita)、玫瑰屬(Rosa)、葡萄屬 (Vitis)JJ^US (Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicag0)Jji 食草屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(trigonella)、豇豆屬(Vigna)、 柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿蔔 屬(Daucus)、鼠耳芥屬(Arabidopsis)、芸苔屬(Brassica)、蘿卡屬(Raphanus)、白芥屬 (Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、黃瓜屬(Cucumis)、 直菪屬(Hyoscyamus)、番爺屬(Lycopersicon)、爺屬(Solanum)、菸草屬(Nicotiana)、蘋果 屬(Malus)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、 ( ι] H ^M (Helianthus)、豸■ M (Lactuca)、雀麥屬(Bromus) > M /R M (Citrullus)、 天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬 (Pelargonium)、黍屬(Panieum) > ^illlliptM (Pennisetum)、毛直屬(Ranunculus)、千裡光 屬(Senecio)、智利喇叭花屬(Salpiglossis)、紫水晶屬(Browaalia)、大豆屬(Glycine)、 豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、棉屬(Gossypium)、大豆屬(Glycine)、黑麥草屬 (Lolium)、羊茅屬(Festuca)、剪股穎屬(Agrostis)。在一個實施方案中，所述virE2突變體(包含所述篩選標記基因)與所述virE2供 體株(包含所述GOI)的比例為約1 3。其他合適的比例包括任意比例，其中相對於所述 virE2突變株優選使用更多供體株，例如超過1 1的比例，例如1 2、1 4、1 5等。 然而，例如對於菸草，1 1的比例被發現比超過1 1的比例更合適。所述兩菌株優選是新鮮培養的。所述菌株可以在與所述植株或植物組織接觸之前 混合，或者可以使它們在不同的步驟中(例如先後地或同時地)與所述細胞接觸。每種菌株的量包括例如在液體MS20培養基中於600nm的OD為約0. 100-約0. 300， 或者與之相當的量。在步驟(e)中，基於所述標記基因及其表達產物，將植物細胞、組織、器官或植株 (或小植株)以及/或者再生的植株或小植株經過選擇步驟。因此，步驟(e)包括步驟利 用所述篩選標記基因產物賦予的表型選擇植物細胞和/或再生植株(或小植株)。該步驟 的目的是為了選擇所述共轉化體。在該步驟中可使用標準的方法。例如，可以再生根和/或芽，並且基於所述標記基 因以及/或者其表達產物或其賦予的表型，可篩選和選擇(部分的)所述再生組織。如上 文已述，用於從轉化的植物細胞再生整個植株的方法是本領域中已知的，並且可應用於所
16述轉化的和/或選出的細胞。根據使用的標記基因的類型，選擇方法可以不同。如果所述 標記基因為除草劑抗性基因，那麼小植株或葉的部分可以與所述除草劑接觸，然後選擇那 些對所述除草劑有抗性的小植株。所選擇的植株可以是原始轉化體(Tl代)，但選擇也可發 生在更晚階段或者進一步發生在更晚階段，例如在通過自交或雜交得到的較後的代中。因 此，任選地可使所述植株進一步雜交和/或自交，以產生在基因組中包含所述標記基因DNA 的全植株和後代。由於本發明的共轉化方法的高效性，高百分比的包含所述標記基因的原始轉化體 還包含所述G0I。因此，超過50%，例如至少60%、70%、80%、90%或更多(95%、99%、 100% )的所選轉化體除了包含所述標記基因之外還包含所述G0I。可以將未被選擇的植株 丟棄。轉化效率越高越好，這是因為隨後需要更少的轉化體來使用費力的分子方法(例如 針對所述GOI的PCR或者針對所述GOI的核酸雜交(例如DNA印跡分析))分析所述GOI 的存在情況。在本文的實施例中，100%的所選植株包含兩種T-DNA，這通過PCR分析得到確 認。因此，與傳統的共轉化方法相比。只需要少得多的總轉化體數目。然後，所述方法任選還包含步驟(f):使所選的植株(或者來自所選的植物細胞或 小植株的植株)雜交和/或自交以產生後代，以及(g)任選丟棄那些包含所述篩選標記基 因的後代並保留那些包含目的基因但缺少所述篩選標記基因的後代(即所述標記基因與 目的基因分離產生包含目的基因的無標記物的植株)。由於所述標記基因和GOI將能夠相互分離，任選可以丟棄那些包含所述篩選標記 基因的植株或後代，並且可以保留那些包含所述GOI但缺少所述篩選標記基因的植株和後 代供進一步使用。因此，可以形成僅包含整合於基因組中的GOI的植株(不含標記物的植 株)，所述標記基因已從中分離出去。這類植株的選擇可以使用已知的方法進行，例如PCR 篩選、基於雜交的方法以及/或者使用表型篩選。本發明的實施方案還提供了用於上述方法的土壤桿菌菌株和成對的土壤桿菌菌 株(至少一株virE2供體株和至少一株virE2突變株)。所述virE2供體株優選在細胞內(例如在質粒上)還包含含有GOI的T-DNA，而所 述virE突變株優選在細胞內(例如在質粒上)還包含含有標記基因的T-DNA。在一個實施方案中，所述virE2突變株包含在所述virE2基因中有突變(優選DNA 插入)的Ti質粒，所述突變導致所述菌株無法製造功能性virE2蛋白。在一個優選的實施 方案中，所述virE2突變株為以登記號CBS 121809保藏的菌株或其保留有存在於其中的Ti 質粒的衍生物。在另一實施方案中，提供了包含CBS121809的Ti質粒的菌株，該菌株包含 菌株CBS121809的Ti質粒中存在的突變體virE2基因。本發明的用途根據上文的描述所述用途已經明晰。在一個實施方案中，本發明提供了如下2株 土壤桿菌用於以其中所含的兩種T-DNA共轉化植株、植物細胞或植物組織的用途，其中所 述2株土壤桿菌一株為不能產生功能性virE2蛋白並包含含有篩選標記基因的T-DNA的第 一土壤桿菌菌株，另一株為包含編碼功能性virE2蛋白的基因和含有目的基因的T-DNA的 第二土壤桿菌菌株。所述第一土壤桿菌菌株的virE2基因優選包含所述virE2基因的整體或部分的插入、缺失或替換。本發明的試劑念還提供了共轉化試劑盒，所述試劑盒包含第一土壤桿菌菌株和第二土壤桿菌菌 株，所述第一菌株由於存在於該菌株中的Ti質粒的virE2基因中的整體或部分的插入、缺 失或替換而不能產生功能性virE2蛋白，所述第二菌株包含編碼功能性virE2蛋白的基因。如所述，所述第二菌株優選包含至少2個編碼功能性virE2蛋白的virE2基因。所述菌株可以以冷凍或凍幹的能存活培養物形式提供，或者作為活培養物(例如 在平板上)提供。同時，所述菌株可分開提供或者作為混合物提供，例如以用於共轉化的 合適比例和/或濃度。在所述試劑盒中可以提供其他材料，例如操作方案、對照物、virE2 DNA(例如探針和/或引物)、緩衝劑等。同時，本文涵蓋使用上述方法製備的轉化的和/或再生的轉基因植物細胞和植株 (和/或植物部分)。序列SEQ ID NO 1 :virE2 cDNASEQ ID NO 2 :SEQ ID NO 1 編碼的 virE2 蛋白SEQ ID NO 3 :virE操縱子，包含因插入而產生的(敲除的)突變virE2 cDNASEQ ID NO 4:virG 蛋白(X62885)SEQ ID NO 5 :virEl 蛋白(AA250537)


圖1-質粒pKG6305的圖譜圖2-質粒pKG6330的圖譜圖3-T-DNA從土壤桿菌(下)轉移至植物細胞(上)中的總示意4A-使用非突變體菌株的共轉化，其中共轉化效率低於50% (黑點指示virE2 蛋白)圖4B-本發明的方法，其得到高共轉化效率(黑點指示virE2蛋白)。如下的非限制性實施例描述了本發明的共轉化方法和菌株。在這些實施例中除 非另外聲明，否則所有重組DNA技術依照以下文獻中描述的標準操作方案進行=Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 禾口 Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY ；以及Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA 的第 1 禾口第 2 卷。 用於植物分子研究的標準材料和方法記載於R. D. D. Croy的Plant Molecular Biology Labfax (1993)，其由 BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和 Blackwell Scientific Publications, UK 聯合出版。實施例實施例1 :EHA105-dE2的構建和確認根癌土壤桿菌菌株EHA105_dE2( 「d」代表被中斷)通過如下方式製備通過同源 重組將不能在根癌土壤桿菌中複製的中斷質粒(名稱為PKG6328)整合至EHA105 VirE2基因中。EHA105的Ti質粒是Ti質粒pTiBo542的衍生物。pKG6328是否插入至VirE2開放 閱讀框(ORF)通過如下方式確認將pKG6328的邊界部分擴增至所述Ti質粒並將其測序。 為了測試(無)功能性，進行了轉化實驗，包括用作對照的敲除互補，所述敲除互補通過加 入能夠在根癌土壤桿菌中複製並由VirE操縱子啟動子驅動表達PTiBo542VirEl和VirE2 基因的質粒(質粒pKG6330)實現。菌株EHA105_dE2已經由本申請人根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)於 2007年8月30日以登記號CBS 121809保藏於荷蘭真菌保藏所(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS), P. 0. Box 85167，3508AD Utrecht, The Netherlands)或"Fungal Biodiversity Centre，，(Utrecht, The Netherlands)。中斷載體pKG6328的構建以包括一個在3個開放閱讀框中具有終止密碼子的特定部分的VirE2基因特異性 引物，在EHA105細菌上直接擴增部分的pTiBo5420RF(正向5，-TGAATGAATGATGATGACACTGAC-3，禾口反向5，-TTAGTCAATTAGTCGCCGGCAAACCTGT-3，)。使用如下的PCR 譜80°C 3 分鐘 _94°C 2 分鐘 _(94°C 30 秒 _55°C 1 分鐘 _72°C 1 分鐘)30次-4°C保持。將所形成的PCR產物連結至使用R6K複製起點的來自Invitrogen 的PCR克隆載體。將所形成的質粒測序，以確認終止密碼子整合於所述部分VirE2 ORF的 每一側。該質粒稱為PKG6328。根癌土壤桿菌菌株EHA105 VirE2基因的中斷將質粒pKG6328通過電穿孔轉移至從EHA105製得的感受態細胞中。由於該質粒 不能在根癌土壤桿菌內複製，因此其需要使用所述VirE20RF部分通過同源重組整合，在該 過程中中斷了所述內源性VirE2基因。用卡那黴素選擇轉化體，卡那黴素是存在於pKG6328 載體骨架上的篩選標記。所述VirE2基因的中斷通過擴增所述整合位點並將其測序(SEQ IDNO 3)來進行確認。將此新菌株命名為EHA105-dE2，並作為CBS 121809保藏。pKG6305 的構建質粒pBBRlMCS (GENBANK NR. U02374, Kovach et al. 1994，BioTechniques 16(5)， 800-802)是pKG6305和pKG6330 二者的骨架載體。使用如下的引物擴增VirG基因反向 5，-CTCGCGTCATTCTTTGCTGGAG-3，和正向5，-TCCGGGATCGATTTCAACAATAC-3，。將來自根 癌土壤桿菌菌株EHA105的50ng總DNA作為模板用於如下PCR譜94°C 2分鐘_(94°C 30 秒-58°C 1分鐘-68°C 2分鐘)X30-72°C 10分鐘_4°C保持。將有校正功能的DNA聚合酶 用於降低PCR錯誤的風險(來自Perkin Elmer的rTth聚合酶)。使用來自Perkin Elmer 的AmpliTaq red，通過將1個單位的該聚合酶加入至PCR反應中並且在72°C下孵育10分 鍾生成「A突出物(A-overhang) 」。將該PCR產物連接至來自Invitrogen的pCR2. IPCR克 隆載體並測序。通過以PstI和SacI切割所述質粒並從凝膠分離含所述基因的1393bp片段，從該 載體得到所述VirG基因。將所述片段連接至pBBRlMCS的相應位點。該新質粒被給予用於 後續的克隆步驟的新多克隆位點(MSC)。該MCS由2條寡核苷酸組成5』 -TTCTAGAACTAGT GGGCCCCTGCAGGTTAACATGCA-3，和 5，-TGTTAACCTGCAGGGGCCCACTAGTTCTAGAAGGCC-3，。當這 2條寡核苷酸在磷酸化後形成DNA雙鏈片段時，它將具有單鏈的DNA突出物，該突出物與由
19ApaI和PstI形成的突出物相適配。使用這2種酶，將該適配物連接於這些位點。該終產物 為pKG6305。質粒pKG6305的圖譜可見於圖1。pKG6330 的構建使用基因特異性引物從EHA105擴增VirE操縱子啟動子、VirEl基因和VirE2基 因，並將它們克隆至攜帶PBBR複製起點和氯黴素抗性基因(用於細菌篩選)的質粒骨架 中。為了擴增該VirE操縱子部分，使用了如下的引物正向5，-ACTAGTTGCCCGCGAAACAGCATTGACT-3『禾口反向5，-GGGTACCATGACGCGGCAGCAGGAAC-3，。正向引物中嵌入了 SpeI限制酶位點，反向引物嵌入了 KpnI位點。位點在所述引物序列中以下劃 線示出。將來自根癌土壤桿菌菌株EHA105的50ng總DNA作為模板用於如下PCR譜94°C 2分鐘_(94°C 30秒-58°C 1分鐘_68°C 3分鐘)X30_72°C 10分鐘-4°C保持。將有校 正功能的DNA聚合酶用於降低PCR錯誤的風險(來自Perkin Elmer的rTth聚合酶)。隨 後以SpeI和KpnI切割所述PCR產物，並連接至pKG6305相應的位點。該質粒在大腸桿菌 和根癌土壤桿菌中都可複製。在證實序列後，通過電穿孔將該質粒轉移至土壤桿菌。質粒 PKG6330的圖譜可見於圖2。毒力和互補測試當將用於gusA表達的補充有T-DNA的EHA105_dE2用於植株轉化時，所產生的轉 化細胞的數目由於所述VirE2基因的中斷應接近於0。同時，當將完整拷貝的VirE操縱子 加入該菌株時，所述表型應得以補充且所述毒力恢復至VirE2未被中斷的菌株(VirE2基因 未被中斷的EHA105)的水平。進行了本生菸草(Nicotiana benthamiana)轉化(葉盤轉化 和土壤桿菌浸潤)，以評估EHA105-dE2的毒力。使用了如下的菌株-質粒組合1.含 T-DNA 的 EHA105 (陽性對照)；2.含 T-DNA 的 EHA105_dE2 (應接近於 0)；3.含 T-DNA 和 pKG6330 的 EHA105-dE2 (互補測試)。對於葉盤轉化，從菸草葉切下直徑Icm的葉盤。用於菸草葉盤轉化的方案已記載 於 Horsch et al (1988, Plant molecular biology manual A5:l_9)0 對於每一土壤桿菌 處理，都轉化了 40個葉盤。在共栽培開始10天後，使用Xgluc作為底物將葉盤用於⑶S染 色(Jefferson et al. 1987EMB0 J. December 20 ；6(13) :3901_3907)。對於每個葉盤，計算 藍斑的數目。葉盤轉化的結果在如下表1中給出。表1:在使用不同菌株-質粒組合轉化後獲得的每個葉盤的gus斑平均(AVG)數 目。對於每種組合，還計算了標準差(SD)、最大數目(MAX)和最小數目(MIN)。
權利要求
一種製備包含目的基因的無篩選標記基因的轉基因植物的方法，所述方法包括如下步驟a)提供2株土壤桿菌——包含編碼功能性virE2蛋白的基因的virE2供體株，以及不能產生功能性virE2蛋白的virE2突變株，b)將包含目的基因的T DNA導入所述virE2供體株，c)將包含篩選標記基因的T DNA導入所述virE2突變株，d)將植物細胞與兩菌株接觸，以及e)利用由所述篩選標記基因產物賦予的表型選擇植物細胞或再生的植株，以及任選f)使所選的植株雜交或自交以產生後代，以及任選g)丟棄那些包含所述篩選標記基因的後代並保留那些包含目的基因但缺少所述篩選標記基因的後代。
2.權利要求1的方法，其中所述virE2供體株包含至少2個virE2基因，所述virE2基 因每個均編碼功能性virE2蛋白。
3.權利要求1或2的方法，其中所述virE2突變株在所述virE2基因中包含插入物，並 且/或者其中所述virE2基因的部分或整體被缺失和/或被替換。
4.權利要求3的方法，其中所述virE2突變株為以登記號CBS121809保藏的菌株或其 衍生菌株。
5.權利要求2的方法，其中一個virE2基因在Ti質粒上，而一個virE2基因在輔助質 粒上。
6.前述權利要求任一項的方法，其中所述T-DNA被導入至DNA載體或質粒上，並且其中 所述T-DNA至少包含右邊界序列。
7.前述權利要求任一項的方法，其中所述virE2突變株和所述virE2供體株的比例為 1 1、1 2、1 3、1 4、1 5 或者更大。
8.前述權利要求任一項的方法，其中共轉化效率為至少60%，優選至少80%、90%或 100%。 一種土壤桿菌菌株，在virE2基因中包含有DNA插入物，藉此所述菌株不能製造功能 性virE2蛋白。
9.權利要求8的菌株，其中所述菌株為以登記號CBS121809保藏的菌株或其衍生菌株。
10.如下2株土壤桿菌用於以其中所含的兩種T-DNA共轉化植物細胞的用途，其中所述 2株土壤桿菌一株為不能產生功能性virE2蛋白並包含含有篩選標記基因的T-DNA的土壤 桿菌菌株，另一株為包含編碼功能性virE2蛋白的基因和含有目的基因的T-DNA的土壤杆 菌菌株。
11.權利要求10的用途，其中所述內源性virE2基因包含所述virE2基因的整體或部 分的插入、缺失或替換。
12.—種共轉化試劑盒，所述試劑盒包含第一土壤桿菌菌株和第二土壤桿菌菌株，所述 第一菌株由於Ti質粒的virE2基因中的插入、缺失和/或替換而不能產生功能性virE2蛋 白，所述第二菌株包含編碼功能性virE2蛋白的基因。
13.根據權利要求12的試劑盒，其中所述第二菌株包含至少2個編碼功能性virE2蛋 白的virE2基因。全文摘要
本發明涉及使用土壤桿菌的植物轉化領域。本文中提供了超高效的共轉化方法。
文檔編號C07K14/195GK101983206SQ200880126210
公開日2011年3月2日 申請日期2008年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者I·M·布魯吉曼, M·T·J·德博特 申請人:關鍵基因公司