用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光pcr引物、探針及方法
2023-06-07 15:32:46 1
專利名稱：用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光pcr引物、探針及方法
技術領域：
本發明屬於檢驗檢疫領域，尤其涉及用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物、探針及方法。
背景技術：
溶血性鏈球菌是重要的食源性致病菌，能導致化膿、敗血等症狀。在日常檢驗中的溶血性鏈球菌屬於常規檢驗項目，檢測任務繁重。在溶血性鏈球菌引起的食品安全事件中， 大部分是由A群溶血性鏈球菌感染引起的，但是近年來C、G群溶血性鏈球菌所引起的感染案例呈遞增趨勢。目前，溶血性鏈球菌的檢測方法主要依據國家標準《GB/T 4789. 11-2003食品衛生微生物學檢驗溶血性鏈球菌檢驗》，以下簡稱為國標方法。國標方法通過革蘭氏染色、觀察溶血、桿菌肽敏感試驗及鏈激酶試驗對溶血性鏈球菌進行微生物學檢驗。國標方法進行溶血性鏈球菌的檢測需經選擇性增菌、分離純化、生化鑑定等步驟， 檢測周期通常需要5 7天。對於汙染嚴重的樣品，混雜了大量環境細菌，而在培養過程中， 由於目前的增菌液並非很好的選擇性培養基，導致一些非目標菌的大量繁殖，增加了目標菌的分離純化難度，若是檢驗人員沒有足夠豐富的工作經驗則容易導致漏檢。對於一些複雜樣品(如食品)，不同的加工工藝導致了其內在成分差異很大，例如含糖量、PH值、含鹽量等，其自身的這些複雜情況可能會改變培養基的成分、PH值、鹽分等，從而幹擾細菌的培養， 可能導致漏檢。因此，現有的國標方法存在檢測周期長，檢測步驟繁瑣，對檢驗人員的經驗要求較高，容易導致漏檢的缺點。
發明內容
為解決現有技術中存在的問題(檢測周期長，檢測步驟繁瑣，對檢驗人員的經驗要求較高，容易導致漏檢)，本發明提供用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物、探針及方法。本發明以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點，通過在NCBI資料庫中下載溶血素S的靶基因序列進行序列比對，找到了保守於A、C、G群溶血性鏈球菌中的序列，根據該序列設計螢光PCR引物和探針。一個方面，本發明提供用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列為
正向引物 Pl :5，-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3，(SEQ ID NO 1)； 反向引物 P2 :5，-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA -3，(SEQ ID NO 2)； 探針5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，(SEQ ID NO 3)； 該探針的5』端標記有螢光報告基團，3』端標記有螢光淬滅基團。
作為本發明的進一步改進，所述螢光報告基團選自FAM、HEX、TET或JOE ；所述螢光淬滅基團為TAMRA。作為本發明的進一步改進，所述螢光報告基團選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、 ROX, TAMRA或iTexas Red ；所述螢光淬滅基團為BHQ。作為本發明的進一步改進，所述螢光報告基團選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或 ROX ；所述螢光淬滅基團為ECLIPSE。另一方面，本發明提供一種用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR檢測方法， 其特徵在於包括如下步驟
A)DNA模板的製備；
B)配製含有如權利要求1至4中任一項所述引物和探針的反應體系，對DNA模板進行 PCR擴增，在ABI7500螢光定量PCR儀上的運行條件為95°C 3min ；95°C 15s，60°C 34s, 40 個循環，每個循環結束後收集螢光信號；
C)反應結束後，讀取並記錄擴增循環數(Ct)，根據擴增循環數進行檢測結果的判斷。探針螢光基團標記在探針的5』端，而淬滅基團則在3』端。當完整的探針與目標序列配對時，5』端發光基團因與3』端的淬滅基團接近，其發射的螢光被淬滅。當PCR反應到延伸步驟時，DNA聚合酶的5』外切酶活性將探針酶切斷裂，使發光基團與淬滅基團分離， 從而使發光基團發出螢光信號。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的螢光基團不斷積累，因此螢光強度與擴增產物的數量呈正比關係。Ct值(cycle threshold, Ct)的定義為每個反應管內螢光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。閾值的設定一般是將其設定為恰好可以覆蓋住陰性對照和空白對照的螢光值處，因此可以很好的去除反應管螢光值即背景。檢測結果的判定標準為Ct值 40時，可判定檢測結果為陰性；35<Ct值 40， 則可判定檢測結果為陰性，否則判定檢測結果為陽性。與現有技術相比，本發明的有益效果有
1)特異性強本發明摒棄了以往研究中採用的溶血素0、鏈激酶、M蛋白等常用靶基因位點，以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點，通過在NCBI資料庫中下載溶血素S的靶基因序列進行序列比對，找到了保守於A、C、G群溶血性鏈球菌中的序列，根據該序列設計螢光PCR引物及探針，因此能夠對A、C、G群溶血性鏈球菌進行特異的檢驗；
2)檢測範圍廣可同時對A、C、G群溶血性鏈球菌進行檢驗，可防止漏檢；
3)靈敏度高增菌18h，可在含有初始濃度為3CFU/mL的樣品增菌液檢出A群溶血性鏈球菌，可在含有初始濃度為2 CFU/mL的樣品增菌液檢出G群溶血性鏈球菌，可在含有初始濃度為50 CFU/mL的樣品增菌液檢出C群溶血性鏈球菌；
4)檢測效率高檢測周期由國標方法的5 7天縮短為增菌1 後經歷Ih左右的PCR反應程序，檢測時間短，且可同時檢測96個樣品，檢測量大；
5)操作簡單且結果直接客觀操作步驟簡單，自動化程度高，Ct值為儀器自動生成，結果直接客觀，對操作人員的經驗要求不高；
6)安全性好由於操作時所處理的菌需經過水煮法製備DNA，因此操作人員可避免直接接觸高濃度的活菌，對操作人員有一定的保護性。
圖1螢光PCR檢測溶血性鏈球菌的特異性。圖2螢光PCR檢測樣品的結果。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。實施例1引物和探針的設計和合成。具有乙型溶血特徵的鏈球菌主要為A、B、C、G群鏈球菌，而具有鏈激酶陽性特徵的鏈球菌為A、C、G群鏈球菌，對於具有桿菌肽陽性特徵的鏈球菌為哪幾群則未在文獻中發現相關報導，因此開展桿菌肽敏感實驗。結果如表1所示，桿菌肽紙片抑菌圈直徑大於IOmm判定為桿菌肽敏感即桿菌肽敏感實驗陽性，用+表示；桿菌肽紙片抑菌圈小於等於IOmm判定為桿菌肽耐藥即桿菌肽敏感實驗陰性，用-表示。結果表明同時具有桿菌肽實驗陽性和乙型溶血特徵的菌株為A、C、G 群溶血性鏈球菌。
權利要求
1.用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物和探針，其特徵在於引物和探針的核苷酸序列為引物 Pl :5』 -GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3』 ； 引物 P2 :5』 -AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3』 ； 探針5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，； 該探針的5』端標記有螢光報告基團，3』端標記有螢光淬滅基團。
2.根據權利要求1所述的用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物和探針，其特徵在於所述螢光報告基團選自FAM、HEX、TET或JOE ；所述螢光淬滅基團為TAMRA。
3.根據權利要求1所述的用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物和探針，其特徵在於所述螢光報告基團選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、ROX, TAMRA或Texas Red ；所述螢光淬滅基團為BHQ。
4.根據權利要求1所述的用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物和探針，其特徵在於所述螢光報告基團選自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或ROX ；所述螢光淬滅基團為 ECLIPSE。
5.一種用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR檢測方法，其特徵在於包括如下步驟A)DNA模板的製備；B)配製含有如權利要求1至4中任一項所述引物和探針的反應體系，對DNA模板進行 PCR擴增，運行條件為95°C 3min ；95°C 15s,60°C 34s，40個循環，每個循環結束後收集螢光信號；C)反應結束後，讀取並記錄擴增循環數(Ct)，根據擴增循環數進行檢測結果的判斷。
全文摘要
本發明涉及用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR引物、探針及方法，屬於檢驗檢疫領域。本發明以A、C、G群溶血性鏈球菌的溶血素S為靶基因位點，設計螢光PCR引物及探針，建立了用於檢測溶血性鏈球菌全族群的螢光PCR檢測方法。本發明主要應用於溶血性鏈球菌的檢測。
文檔編號C12Q1/14GK102226215SQ201110131978
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月20日 優先權日2011年5月20日
發明者嚴瓊英, 蘭全學, 李意, 楊國武, 林霖, 祝仁發, 賴心田, 陳國培, 陳血建 申請人:深圳市計量質量檢測研究院