一種白眉蝮蛇類凝血酶基因及其應用的製作方法

2023-06-08 03:09:56

專利名稱：一種白眉蝮蛇類凝血酶基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛇毒類凝血酶基因及其應用，特別提供了一種白眉蝮蛇類凝血酶基因，及其作為止血/出血性疾病藥物及血栓性疾病藥物的應用。
背景技術：
國內外大量文獻報導，在蝮亞科蛇毒中存在一種與血液凝固相關的蛋白酶，通常稱為「類凝血酶」(Thrombin-like Enzyme,簡稱TLE)。類凝血酶與血液中的凝血酶(Thrombin)作用相似，可以將血液中的纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，纖維蛋白凝結起到止血作用。到目前為止，已在30多種蝮科蛇毒中發現有TLE成分，許多研究人員也通過分子生物學方法克隆得到了 TLE基因，並得到了相對應的蛋白。、
我國地大物博，蛇種類繁多，有7科174種之多，蛇毒資源豐富，我國也是蛇毒用於醫療最早的國家。目前已得到的蛇毒類凝血酶基因其來源各不相同，有尖吻蝮蛇毒腺組織、白眉蝮蛇毒腺組織、竹葉青蛇毒腺組織、烏蘇里蝮蛇毒腺組織等，基本採用RT-PCR方法，長度均在230個胺基酸左右，並且這些基因及對應的胺基酸序列同源性均很高。杜道林等人從長白蝮蛇毒腺中克隆得到一個全長為708個核苷酸的類凝血酶基因，編碼236個胺基酸，推測其活性中心為 His43，Asp88 和 Ser182，二硫鍵為 Cys7-Cys141, Cys28-Cys44, Cys76-Cys234,Cys120-Cys188, Cys152-Cys167 和 Cys178-Cys203,也是一種新型類凝血酶基因。

發明內容
本發明的目的在於提供一種利用分子生物學方法得到的白眉蝮蛇類凝血酶基因及其作為止血/出血性疾病藥物及血栓性疾病藥物的應用。本發明的白眉蝮蛇類凝血酶基因是根據從中國長白山白眉蝮蛇
心毒中分離得到的類凝血酶胺基酸序列，通過分子生物學手段獲得，該種凝血酶基因由714個核苷酸組成，編碼238個胺基酸，經生物信息學分析得知，是一種新型的蛇毒類凝血酶基因，該蛇毒天然類凝血酶基因及酶工程產品均可開發成為藥物用於臨床。其中，由該種白眉蝮蛇類凝血酶基因序列構成的蛇毒類凝血酶分子量為36kDa，等電點為6-7，可使含枸櫞酸鈉的人血漿在Imin內凝固；凝塊在體內纖溶酶的作用下很快溶解，從而使血漿內的纖維蛋白原濃度降低，可用於治療血栓性疾病。本發明以我國白眉蝮蛇毒為原料，利用生物化學方法分離純化得到類凝血酶，再根據C、N端序列設計引物，以毒腺組織中Total RNA為模板，用RT-PCR方法克隆得到cDNA序列，測序結果顯示該類凝血酶基因長714bp，經生物信息學分析得知，我們得到了一種新型的蛇毒類凝血酶基因，與其它白眉蝮蛇類凝血酶基因同源性超過90%。此外，本發明還提供了此蛇毒類凝血酶的分離純化、克隆方法，具體如下
一、分離純化
I )、白眉蝮蛇蛇毒用緩衝液浸泡、溶解過夜，離心去除沉澱，得上清液；
2)蛇毒上清液經SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析，上樣結束後，用pH6. O的PBS緩衝溶液I進行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數達到基線後，再用pH6. O含O. 2MNaCl的PBS緩衝溶液II直線洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集活性峰，得到類凝血酶粗提液；
3)將類凝血酶粗提液用pH8.O的PBS緩衝溶液III透析；
4)透析後樣品經BenzamidineSepharose 6B親和層析，上樣結束後，用ρΗ8· O的PBS緩衝溶液III進行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數達到基線後，再用梯度混合儀進行pH梯度洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集掛柱峰，得到單一組分的類凝血酶；
5)類凝血酶活性鑑別。_■、基因克隆
1)、引物設計；
2)、毒腺組織TotalRNA提取；
3)、以TotalRNA為模板，反轉錄得到類凝血酶cDNA ；
4)、將得到的cDNA連接載體，轉化疋coli感受態細胞，篩選陽性克隆；
5)、對陽性克隆進行基因測序，測序結果進行生物信息學分析；
其中，步驟I)引物是根據分離純化得到的類凝血酶蛋白C、N端序列設計，並在引物的5』端添加限制性酶切位點，方便後續試驗操作。步驟3)反轉錄過程需要不斷摸索變性、退火、延伸溫度，以找到最合適的RT-PCR條件。步驟4)篩選陽性克隆我們選擇的是藍白斑篩選法，得到的白色菌落需要培養、提取質粒、雙酶切進一步確認後，進行基因測序。本發明得到的白眉蝮蛇類凝血酶純品比活約為4000U/mg，SDS-PAGE呈單一條帶，HPLC分析純度可達90%以上，收率可達80%以上。本發明獲得的白眉蝮蛇類凝血酶活性良好,可製成各種止血藥和治療血栓性疾病的藥物，如，稀釋到規定的酶濃度後，添加合適的輔料，去除病毒、檢驗合格後分裝，製成醫用止血製劑，用於治療手術等各種臨床出血症狀。


圖I為白眉類凝血酶SDS-PAGE圖，其中，Y :白眉類凝血酶，M :分子量Marker ;
圖2為白眉蝮蛇類凝血酶cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M DL2000 Marker7Y =RT-PCR產物；
圖3為cDNA核苷酸及相應的胺基酸序列圖。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制，在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟識的常規手段。實施例I
I、蛇毒類凝血酶的分離純化
(1)將白眉蝮蛇蛇毒用pH6.O的50 mm PBS緩衝溶4°C浸泡、溶解過夜，4500rpm離心15min,去除沉澱,得上清液；
(2)蛇毒上清液經SPSepharose Fast Flow陽離子交換層析，上樣結束後，用pH6. O的PBS緩衝溶液I進行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數達到基線後，再用pH6. O含O. 2MNaCl的PBS緩衝溶液II直線洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集活性峰，得到類凝血酶粗提液；
(3)將類凝血酶粗提液用pH8.O的PBS緩衝溶液III透析；
(4)透析後樣品經BenzamidineSepharose 6B親和層析,上樣結束後，用ρΗ8· O的PBS緩衝溶液III進行洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，至讀數達到基線後，再用梯度混合儀進行pH梯度洗脫，紫外檢測儀280nm檢測，收集掛柱峰，得到單一組分的類凝血酶，見圖I。實施例2
白眉蝮蛇類凝血酶鑑別
取實施例I中類凝血酶蛋白，加水製成每Iml中含Img的溶液，作為供試品溶液。取人-枸櫞酸血漿[取枸櫞酸鈉38g，加水IOOOml溶解，按枸櫞酸鈉溶液-人血(I 9)比例 混合，3000轉/min離心30min。取上清液分裝成每支Iml,冷凍乾燥,使用前加水Iml,搖勻，三小時內使用]0. 3ml，加400IU/ml肝素鈉溶液O. 05ml，37 °C保溫，Imin內，血漿應凝固，力口入1%三氯醋酸溶液1ml，振蕩，凝塊完全溶解，呈澄清透明溶液。取白眉蝮蛇類凝血酶，加水製成每Iml中含血凝酶100 μ g的溶液，為供試品溶液；取小試管，加入人-枸櫞酸血漿O. 3ml，置37±0. 5°C水浴中保溫2min，加供試品溶液
O.1ml，置37°C水浴中觀察，血漿應在30s內凝固。實施例3
白眉蝮蛇毒腺Total RNA提取
a)取新鮮蛇毒腺組織，剪碎，置於I.5ml Ependorf管中，加入適量的RNAiso Plus試齊U，用一次性研磨件研磨組織，直至組織被研磨碎，添加RNAiso Plus到Iml,整個過程在冰上完成，溫靜直5min ；
b)將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5min；
c)12000 g 4。。離心 5 min ；
d)小心吸取上清液，移入新的離心管中(切勿吸取沉澱)；
e)向上述步驟中的勻漿裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s (氯仿沸點低、易揮發，振蕩時應小心Ependorf管蓋突然彈開)，待溶液充分乳化(無分相現象)後，再室溫靜置5min ；
f)12000g 4。。離心 15min ；
g)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相，吸取上清液轉移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層);
h)向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻後，在15-30°C下靜置IOmin ；
i)12000g 4°C離心lOmin，一般在離心後，試管底部會出現沉澱；
j)RNA沉澱的清洗；小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿觸及沉澱)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12000 g 4°C離心5 min後小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應儘量除淨乙醇)；k)RNA的溶解；室溫乾燥沉澱2-5 min (不可以離心或加熱乾燥，否則RNA將會很難溶解)，加入適量的RNase-free水溶解沉澱，必要時可用移液槍輕輕吹打沉澱，待RNA沉澱完全溶解後於-80°C保存。用I X TAE (用DEPC處理的水配製)制I. 0%的瓊脂糖凝膠，電泳槽先用蒸餾水衝洗，然後用DEPC處理的水衝洗或浸泡一會，120V電泳25-30分鐘。實施例4
反轉錄得到類凝血酶基因 反轉錄反應
I組分 陣積(μ ) I
MgCl2 2 I.
I3.Q^C. I Ojxdfi
IOxRTBufferι I
—30min
RNaseFreedH2O3.75.V …，
■ 5mm1 Cyde
DNTP Mixture (各 1—QfpM)I
5—XJ 5min
Rhiase Inhibitor0.25」
Reverse Transcriptase0.5
Oligo dT-Adaptor Primer0.5
Positive Control RNAI
Total10
I...........................................................................................................................................i..............................................................j
PCR反應
組分體積(μ!).~
__9412. 2min
SxPCR Buffer 10 17____94°Q 45sec I
滅菌蒸餾水 28.75 —IT—~ f30 c^des _;__60. 30sec
Ek Taq 0.25 , , I_Z__12 , liran
F-I0.5
R-10.5
Total40
其中，DL2000 Marker和RT-PCR產物的類凝血酶cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖，見圖2。實施例5
連接載體、轉化宿主、篩選陽性克隆
將實施例4中得到的cDNA片段純化，成份按照T-vector I μ I，cDNA 3 μ I，dH20 I μ I，Solution I 5μ I的體積要求加入PCR管中，16°C 12h。
重組質粒轉化萬.co7i JM109感受態細胞，操作如下
a)E.coli JM109感受態細胞置於冰上解凍，100 μ I轉移至滅菌的PCR管內，加入重組質粒，輕輕混勻，冰上放置30min ；
b)42°C放置45-60s，冰上放置2-3min，加入37°C預熱的800μ I SOC培養基，37°C震蕩培養Ih ；
c)2000rpm離心2min,留取少量上清,混勻沉澱,全部塗布於Amp、X_gal、IPTG平板，37 °C過夜培養；
d)挑取白色菌落，37°C搖瓶培養過夜；
e)提取質粒，雙酶切進一步驗證； f)陽性重組質粒進行基因測序，具體見圖3。實施例6 生物信息學分析
為了驗證我們得到的蛇毒類凝血酶基因序列是否與Gene Bank發表的序列為相同序列，測序結果經生物信息學軟體進行分析，結果顯示，本發明得到的白眉蝮蛇類凝血酶基因與Gene Bank中序列同源性超過90%，為一種新型的類凝血酶基因。實施例7
白眉蝮蛇類凝血酶與尖吻蝮蛇、矛頭蝮蛇毒類凝血酶體外凝血活性比較標準品溶液的製備取降纖酶標準品，加三羥甲基氨基甲烷緩衝液(PH7. 4)製成每Iml中含20、10、5、2. 5單位的溶液。供試品溶液的製備取本品適量，用三羥甲基氨基甲烷緩衝液(PH7. 4)(取三羥甲基氨基甲烷2. 42g與氯化鈉O. 585g，加水適量溶解，用lmol/L鹽酸溶液調節pH值至7. 4，加水稀釋至500ml)製成標準曲線範圍內濃度的溶液。測定法取試管(101^10011)4支，各精密加入0.4%纖維蛋白原溶液；取纖維蛋白原，用上述三羥甲基氨基甲烷緩衝液(Ph7. 4)製成O. 4%可凝蛋白溶液]O. 2ml，置(37±0. 5) °C水浴中保溫2分鐘，依次精密量取4種濃度的標準品溶液各O. 2ml，迅速加入上述各試管中，立即搖勻，同時計時，於(37±0. 5) °〇水浴中觀察纖維蛋白原的初凝時間，每種濃度測5次，求平均值(5次測定最大與最小值之差不得超過平均值的10%，否則重測)。在雙對數坐標紙上以標準品單位數(U)為橫坐標，初凝時間為縱坐標計算回歸方程(相關係數應大於O. 99)。取三種蛇毒類凝血酶溶液按上法測定，用直線回歸方程求得每Img的單位數，白眉蝮蛇類凝血酶、尖吻蝮蛇類凝血酶、矛頭蝮蛇類凝血酶比活力分別為3700U/mg、3100U/mg、3200U/mg。實施例8
白眉蝮蛇類凝血酶與尖吻蝮蛇、矛頭蝮蛇類凝血酶體內凝血活性比較將40隻昆明小鼠，體重(19. 5±1. 5)g，隨機分成4組，實驗組和對照組，每組10隻，雌雄各半。實驗組按0.5 U/kg劑量、O. I ml/10g給藥體積於小鼠尾靜脈注射，對照組注射生理鹽水。末次給藥後30 min，取小鼠置於固定器中，使其尾部垂直，距尾尖5 mm處剪斷，每隔30 s左右用濾紙輕觸尾部斷處，直至停止出血為止，記錄斷尾至停止出血的時間即為尾出血時間。結果顯示，實驗組小鼠尾部出血時間明顯短於對照組，白眉蝮蛇類凝血酶的小鼠尾部出血時間明顯短於其他試驗組，白眉蝮蛇類凝血酶可使小鼠尾部在20 min左右停止出血。
tt射不BH*類繼愈_後小鼠麗部ailiifB
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不同來源的類繼Il酶對小鼠尾部出血時間的影響
組別丨 齊懂(U-kg-Q出血對網(mm)
變白對■!§ i =35 O ±3.94
白β·蛇突凝血_ O- 520 6 ± 2.95
尖吻蠛蛇類礙倉_ O 5271 2-98
矛頭蠖蛇類礙血_ O 529.0 ± 3.50
權利要求
1.一種白眉蝮蛇類凝血酶基因，其特徵在於具有如下的DNA核苷酸及相應的胺基酸序列
2.按照權利要求I所述的白眉蝮蛇類凝血酶基因，其特徵在於由所述的基因序列構成的蛋白酶，分子量為36kDa，等電點為6-7。
3.按照權利要求2所述的白眉蝮蛇類凝血基因，其特徵在於所述的蛋白酶製成醫用止血製劑，用於治療手術各種臨床出血症狀。
4.按照權利要求2所述的白眉蝮蛇類凝血酶基因，其特徵在於所述的蛋白酶用於治療血栓性疾病。
全文摘要
一種白眉蝮蛇類凝血基因從中國長白山白眉蝮蛇(Gloydiusussuriensi)毒中分離得到的類凝血酶胺基酸序列，通過分子生物學手段獲得，該種凝血基因由714個核苷酸組成，編碼238個胺基酸，經生物信息學分析得知，是一種新型的蛇毒類凝血酶基因，該蛇毒天然類凝血基因及酶工程產品均可開發成為藥物用於臨床。
文檔編號A61P7/02GK102719460SQ201110076849
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月29日 優先權日2011年3月29日
發明者於忠福, 劉鵬輝, 孫東, 曹麗麗, 李曉軍, 王宏英, 石皎, 薛百忠, 薛雁 申請人:瀋陽守正生物技術有限公司