一種提高肝片吸蟲CatL1(FhCatL1)DNA疫苗免疫保護率的方法

2023-06-07 20:41:11 1

專利名稱：一種提高肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保護率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高抗肝片吸蟲FhCat LI DNA疫苗免疫保護率的方法。具體涉及利用樹突狀細胞(DC)表面分子DEC-205的單鏈抗體SCFVNU)e_145靶向DC細胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI基因的DNA疫苗後對肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高抗肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護率。
背景技術：
肝片吸蟲是一種寄生性蠕蟲，能引起牛、羊等反芻動物及人的嚴重吸蟲病[I]。在世界範圍內，肝片吸蟲病直接影響著畜牧業的發展和人類健康，據估計每年可造成約20億美元的經濟損失[2]，是一種不可忽視的重要人畜共患寄生蟲病。對此病的防治一般採用三氯苯咪唑等化學藥物，但這些藥物只對早期的未成熟蟲體或成蟲具有良好效果，對感染後期的治療不佳。最近發現，家畜已對三氯苯咪唑等化學藥物產生耐藥性[3-5]。同時，人們對畜產品中化學藥物殘留量的要求也越來越嚴格，這給利用化學藥物控制吸蟲病帶來極大困難。因此，防治吸蟲病急切需要一種能替代化學藥物的治療方法，這就給疫苗發展帶來了良好契機[6]。事實上，到目前為止，有很多肝片吸蟲的疫苗候選分子如穀胱甘肽S轉移酶(GST)，亮氨酸氨肽酶(LAP)，脂肪酸結合蛋白(FABP)及組織蛋白酶L (Cat L)被用於開發諸如重組蛋白疫苗及DNA疫苗，雖然這些疫苗能在實驗動物和大動物上產生一定的免疫保護[7，8]，但至今仍沒有一種商品化疫苗能投入到臨床生產，這在很大程度上受制於疫苗的保護率低下的現狀，而這種現狀與如何提高抗原的呈遞有著密切的關係[9-12]。理想的疫苗應能夠刺激機體產生特異性的免疫反應，並能誘導長期持久的免疫記憶以保護機體免受疾病侵襲。作為一種成 功的疫苗，其抗原可被抗原提呈細胞(antigen presentingcells，APC)所提呈，並激活機體免疫系統引起抗原特異性免疫反應。樹突狀細胞(DC)是已知體內最強的專職抗原提呈細胞，其最大的特點是能夠刺激初始T細胞增殖和啟動機體免疫反應。單鏈抗體是一種分子量小，穿透力強，可避免非特異性細胞毒性及免疫原性，目前被認為是最為理想的具有體內特異性導向作用的載體片段[13，14]。DEC205作為小鼠DC表面特異性標誌，DEC205抗體NLDC-145具有特異靶向DC的作用，是體內DC修飾的理想載體。所以抗DEC205的單鏈抗體可將特定抗原定向呈遞給DC，激活初始免疫細胞，使抗原提呈給T細胞，引起有效的抗原特異性免疫反應。組織蛋白酶L是一種半胱氨酸蛋白酶，通常情況下這種酶以非活性狀態存在於分泌囊泡的腸上皮細胞中[15，16]，當前體酶活化並被釋放後，寄生蟲即可利用活化的組織蛋白酶行使多種重要的功能，如能在肝臟中將蛋白分解為多肽從而利於營養的吸收、降解基質蛋白從而有利於寄生蟲從腸道遷移到肝臟[17，18]。研究還表明，組織蛋白酶L還在免疫逃避和免疫調節中發揮重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白從而破壞宿主的免疫攻擊，並能介導和調節巨噬細胞的活性、抑制Thl免疫反應[19-21]。
目前，對肝片吸蟲組織蛋白酶L的疫苗開發主要集中在重組蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重組肝片吸蟲組織蛋白酶L具有與天然蛋白相似的功能[22]，且在荷斯坦牛身上免疫後獲得了 48.2%的減蟲率和顯著升高的總IgG [23]。在DNA疫苗的研究中，肝片吸蟲Cat L DNA疫苗免疫大鼠能獲得70%的免疫保護[24]。然而，要想開發出高效率的抗肝片吸蟲的疫苗，這樣的免疫保護率仍顯不足。因此，如何提高疫苗的保護率就成了目前疫苗開發的熱點。本發明正是著眼於提高肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護率，從提高其抗原在樹突狀細胞中的呈遞作用入手，利用樹突狀細胞(DC)的表面分子DEC-205的單鏈抗體ScFvm45能靶向DC細胞的重要作用機理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI基因的DNA疫苗後對肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高肝片吸蟲Cat LI DNA疫苗的免疫保護率。

發明內容
針對肝片吸蟲疫苗保護率和疫苗抗原呈遞效率低下的現狀，本發明主要著眼於提供一種利用DC特異性單鏈抗體提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI )DNA疫苗免疫保護率的新方法，用於指導抗肝片吸蟲DNA疫苗的研發。本發明採取的技術方案是:一種提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI)免疫保護率的方法，所述方法包括以下步驟:1.運用反轉錄聚合酶鏈 式反應(RT-PCR)擴增目的基因，將擴增得到的Cat LI基因回收後連接入PMD18-T載體，得到pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)；2.利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)和真核細胞Cos7表達目的蛋白；3.Cat LI多克隆抗體的製備；4.純化和鑑定目的蛋白；5.設計合成單鏈抗體scF/.145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1):用單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5』和3』分別加入CACC鹼基和BamH I序列後進行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時合成SF的i sotype序列；6.構建並鑑定編碼ScFVNU)G_145及目的蛋白的真核表達質粒:將pVAXl和合成的SF進行體外連接後轉化大腸桿菌T0P10，然後提取質粒進行鑑定，測序正確的陽性重組質粒pVAXl- SF及步驟I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化到感受態細胞JM109中，提取質粒並進行測序鑑定後獲得陽性 pVAXl-SF- Cat LI 重組質粒(SEQ ID N0.3)；7.動物免疫及感染試驗；8.動物體液及細胞免疫評價；9.免疫保護率評價。本發明利用樹突狀細胞(DC)的表面分子的DEC-205的單鏈抗體scFv 45靶向DC細胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI的DNA疫苗後對肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高FhCat LI的DNA疫苗的免疫保護率，其優點在於:1、與非DC靶向DNA疫苗相比，所採用的DC特異性單鏈抗體能靶向DC細胞，可特異性提高抗原的呈遞效率，從而提高免疫保護率(83.1%)。2、採用的骨架質粒pVAXl為真核表達質粒pcDNA3.1的升級構件，具有更多的技術優勢。3、pVAXl-SF-Cat LI質粒免疫後獲得的免疫保護率顯著高於對照組，且獲得了較pcDNA-Cat LI疫苗(36.3%)高的免疫保護率，也較別的學者以Cat LI為抗原研究的DNA疫苗保護率(70%)高。本發明技術具有針對性強、效率高、易於操作、效果明顯等特點。該技術為肝片吸蟲DNA疫苗的開發提供了一種新的方法，適宜在其他肝片吸蟲候選疫苗分子上引申應用，對抗肝片吸蟲疫苗的研發和生產及肝片吸蟲病的免疫防控具有重要的指導意義和應用價值。


圖1是本發明所構建的疫苗質·粒及其結構。圖2 是 pVAXl-SF- Cat LI 質粒及其 isotype 的結構。圖中 scDEC 即 SF, targetprotein即Cat LI。DEC-H, DEC-L分別為SF的重鏈和輕鏈。圖3是單鏈抗體ScFvnK45的核苷酸序列組成(SEQ ID N0.1)。加粗斜體分別為CACC接頭序列和BamH I酶切位點；下劃線為序列的信號肽SP，該序列廣泛應用於真核表達系統，可促進目的基因表達；斜體下劃線序列為Linker (G4S)3 ；Linker前為重鏈VH，後為輕鏈VL (見圖2)。圖4是PCR檢測scFVNU)e_145，Cat LI及二者連接後的質粒正確性。A為Cat LlPCR電泳圖，目標長度為720bp。B為ScFvnldc-145PCR電泳圖，目標長度為819bp。C為scFv.145連接Cat LI後PCR電泳圖，目標長度為1539bp。圖5中A是pET32a_Cat LI在大腸桿菌中的表達結果。M為蛋白標準分子量。1，pET32a- Cat LI陽性質粒在BL21 (DE3)感受態細胞中的表達，所用條件是37°C 1.0mM IPTG誘導4h。2，pET32a空載體;B是Cat LI蛋白純化後SDS-PAGE電泳結果。M為蛋白標準分子量。1-4為純化後蛋白條帶。圖6 中 A 是 pVAXl-Cat LI 轉染 Cos7 細胞後 Western blotting 結果，1-3 為目標蛋白，大小為26.lkD，4為空白對照PVAXI質粒。B是pVAXl-SF轉染Cos7細胞後Western blotting結果，1-3為目標蛋白，大小為29.6kD，4為空白對照pVAXl質粒。圖1是質粒中目標序列的測序結果(SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)。圖8是大鼠免疫後血清中抗體水平。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX1-SF-Cat LI能刺激大鼠產生顯著高水平的IgGl。*，#分別代表與pVAXl_SF_Cat LI組相比差異顯著和極顯著(p〈0.05, p〈0.01)。圖9是外周血細胞因子IL4、IL5和IFNy的含量。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-CatLI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠產生顯著高水平的IL4和IL5。*，林分別代表與pVAX 1-SF-Cat LI組相比差異顯著和極顯著(ρ〈0.05, ρ〈0.01)。圖10是脾細胞增殖反應結果。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾細胞顯著增殖。*代表與pVAXl_SF_Cat LI組相比差異顯著(ρ〈0.05)。圖11是疫苗免疫後受囊蝴感染攻擊後成活的蟲體數量。與pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAXl_SF_Cat LI使大鼠中蟲體成活數量較pVAXl組顯著降低。*代表與pVAXl組相比差異顯著(p〈0.05)。
具體實施例方式本發明具體的方法按如下步驟操作:1.運用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增目的基因根據GenBank收錄的肝片吸蟲Cathepsin LI (登錄號AY573569.1)序列(序列ORF總長720bp，蛋白大小26.1KDa)，應用Oligo 5.0設計特異性克隆(Pl，P2)。Pl- 5』CCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTGTG 3』，P2-5』 CC GAATTCTCA CGG AM TCG TGC CAC CA3』，在克隆引物P1，P2的上下遊分別引入BamH I和EcoR I酶切位點(劃線部分)。肝片吸蟲Cat LI的總RNA提取採用Trizol試劑盒進行，反轉錄後進行PCR擴增。反應條件為:95°C預變性 5min，95°C 40s, 55°C 45s，72°C 60s，30 個循環。最後 72°C延伸 lOmin。每次PCR設陽性和空白對照。將擴增得到的Cat LI基因回收後連接入pMD18-T載體(pMD-CatLI )，轉化入大腸桿菌感受態細胞JM109中，培養後提取質粒進行初步1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑑定後測序確定序列的正確性。2.利用大腸桿菌工程菌(Escherichia coli)表達和純化目的蛋白應用Oligo 5.0 設計特異性表達引物Pel, Pe2，Pel_5』 GGGAATTCCATATG GTA CTGACT ATT GGA TTG TG 3』，Pe2~5'~CGG CTCGAG TCA CGG MA TCG TGC CAC CA 3』，並在其上下遊分別引入Nde I和Xho I酶切位點(劃線部分)。以陽性質粒pMD-Cat LI為模板，用表達引物Pel, Pe2進行擴增，反應條件為:95°C預變性5min，95°C 45s, 56 °C 40s, 72 °C60s, 30個循環。最後72°C延伸lOmin。將擴增得到的帶酶切位點的Cat LI基因回收後進行Nde I和Xho I酶切，所得片斷與同樣經Nde I和Xho I酶切的pET32a載體連接過夜(4°C),構建pET32a- Cat LI表達質粒。轉化陽性質粒入BL21 (DE3)感受態細胞，培養後提取質粒進行測序鑑定。選取經PCR鑑定為陽性的質粒轉化大腸桿菌後進行體外IPTG誘導表達。當轉化後的細菌在37°C生長至0D600nm的濃度為0.6時加入ImM IPTG誘導4小時，將所得細菌6000g離心30min後獲取沉澱並稱重。然後按lg/5ml His-Tag結合緩衝液的比例加入緩衝液後作用20min，然後用超聲波反覆作用30次(條件為24KHz，30sec開，30sec關)。將處理後產物於6000g離心30min，取上清，並利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒進行純化，然後用PBS緩衝液透析24小時後備用。蛋白濃度測定採用Coomasie proteinassay測定。3.Cat LI多克隆抗體的製備將5隻6-7周齡雌性SD大鼠分別後腿肌肉注射30 μ g/只的純化後的Cat LI蛋白，總共進行3次免疫，每次間隔I周，最後I次免疫後I周採血分離血清備用。抗體的濃度測定米用Coomasie protein assay測定。4.Western blotting 鑑定目的蛋白將步驟2中利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒純化後的蛋白進行SDS_PAGE(30V，Ih)電泳後轉至尼龍膜上進行Western blotting鑑定。將膜用15ml I XTBS清洗2次後加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結合蛋白位點。經過2次IXTTBS再清洗後，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中lh，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經2次IXTTBS清洗後加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經2次IXTTBS清洗後加入發光底物Chemi Glow，然後進行成像處理以鑑定蛋白的表達情況。5.設計合成單鏈抗體ScFvnldg-145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)根據文獻[25]報導的單鏈抗體片斷scFv 45序列，在其5』和3』分別加入CACC鹼基和BamH I序列後進行全基因合成，合成片斷命名為SF，同時合成SF的isotype序列。6.質粒 pVAXl- SF-Cat LI 的構建將pVAXl和合成的SF進行體外連接後轉化大腸桿菌T0P10，然後提取質粒進行鑑定，測序正確的陽性重組質粒pVAXl- SF及方法I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化到感受態細胞JM109中，利用質粒提取試劑盒(QIANGEN)提取質粒並進行測序鑑定後獲得陽性pVAXl-SF- Cat LI重組質粒。疫苗的設計和構建示意圖見圖1，2。7.質粒的體外轉染及鑑定經過柱分離純化後的陽性重組子pVAXl-SF-Cat LLpVAXl-1SOSF-Cat LI及pVAXl空質粒，分別用質體介導法轉染至70-85%單層Cos7細胞，即準備兩個Eppendorf管,在第一管中加入1.25 μ g質粒和500 μ I Opt1-MEM I (invitrogrn)。在第二管中加入2μ IIipofectamine 和 500 μ I Opt1-MEM I jmin後將兩管混合併再作用 20min後，將此 1000 μ I混合液與3ml70-85%單層Cos7細胞(含有10%FCS的RMPI1640)混合併孵育5min。將細胞清洗2次後於IlOOg離心lmin，然後再與3mllO%FCS的RMPI1640 37°C孵育48h。收集細胞培養液，12，OOOg離心5min後分別收集上清和細胞沉澱。上清液經離心沉澱後，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)或SF抗體(1:500)，羊抗鼠IgG (1:5000)發光底物Chemi Glow進行Western Blotting鑑定質粒的表達情況。8.DNA質粒的大量製備將陽性質粒轉染至大腸桿菌後接種500ml含有50 μ g/ml氨節西林的LB培養基中，37°C培養16h。將培養物於4°C 6000g離心30min後收集沉澱，並按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進行質粒的大量提取。獲得的質粒用UV260nm測定其濃度後儲存於4°C備用。9.肝片吸蟲囊蝴的獲取從自然感染肝片吸蟲的牛糞便中收集蟲卵並置於平皿中於室溫孵育18天，然後將蟲卵暴露在光線下刺激2h以獲取毛蝴。將2隻毛蝴感染I只截口土蝸，然後正常飼餵截口土蝸68天。此後即可收集囊蝴。將收集到的囊蝴置於透明玻璃紙，於4°C儲存備用。10.動物免疫，感染試驗及保護率評估

將70隻6-8周齡雌性SD大鼠隨機分成7組，每組10隻，分別在腿部肌肉注PBS空白對照，40 μ g/ 只 PVAXI 空質粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl- SF, pVAXl-1SOSF-Cat LI,pVAX 1-SF-Cat LI和pcDNA-Cat LI (對照質粒，由實驗室保存)質粒，總共進行2次免疫，每次間隔7天。第2次免疫後14天將其中35隻大鼠採血I次進行抗體水平測定，同時將其中的35隻(每組5隻)用作囊蝴感染，每隻大鼠經口感染30個囊蝴，在感染後63天即可處死大鼠，根據最後獲得的肝片吸蟲數量來評估疫苗保護率。11.動物體液免疫評估採用間接ELISA對肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進行測定，即應用本試驗pET32a表達載體表達的CatLl蛋白(5mg/ml，50l.! I/孔)包被96孔ELISA平板，於4°C過夜。然後用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在進行2次TBST洗滌後加入50 μ I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，於4°C孵育過夜。將平板洗滌後加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，並於室溫孵育2h，然後加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當出現藍色時加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應並於450nm讀數OD值。抗體效價的判定標準為:取大於標準差3倍的0.D值所對應的最大稀釋度為抗體效價。12.動物細胞免疫評估採用夾心ELISA對肝片吸蟲感染引起的外周血中細胞因子水平進行測定，所用試劑均為商品試劑盒。分別於96孔板加入50μ I/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFN y , 1:250)進行抗體包被，並於4°C過夜。在用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h後分別加入5(^1/孔倍比倍稀釋的標準抗體(起始濃度11^4，8叩/1111 ；IL5,10ng/ml ；IFN y , 50ng/ml)及50 μ I/孔的血清樣品，並於4°C過夜。洗滌3次後加入生物素標記的抗體(終濃度IL4，IL5，IFN Y I μ g/ml),於室溫孵育Ih後加入AMDEX鏈黴親和素孵育30min。洗滌3次後加Λ 50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當出現藍色時加入50 μ I/孔lMmH2S04終止反應並於450nm讀數OD值。13.T細胞增殖試驗 於大鼠第二次免疫後14天獲取大鼠脾臟，在無菌條件下獲取脾單細胞培養物，用紅細胞裂解液處理後重懸細胞，以IO6/孔的細胞密度在96孔板上培養脾細胞(培養液為Sigma公司的RPM1-1640)。然後分別加入重組表達的CatLl蛋白(10 μ g/ml)，刀豆蛋白A(ConA, I μ g/ml)進行體外刺激培養。以RPMI基礎培養基作為對照組。培養48小時後，力口A 10% Alamar Blue (Invitrogen)後24小時於540nm讀取OD值，以此測定T細胞的體外增殖情況。注:所有數據採用Graphpad Prism 4.0軟體進行處理,使用ANOVA方法並結合Mann Whitney U test進行分析處理，P < 0.05判為差異顯著，P 0.001判為差異極顯者。實驗例:本發明主要分為兩大板塊。一是設計並構建實驗所需質粒，一是對疫苗免疫大鼠的效果評價。以下將結合附圖進行詳細闡述:一、設計並構建實驗所需質粒首先，為獲取候選疫苗基因FhCat LI，將從牛體肝臟中獲取的新鮮蟲體用於提取mRNA(具體提取方法見QIAGEN mRNA試劑盒)。然後將用RT-PCR方法獲取FhCat LI基因的cDNA及所需要的ORF片斷，並將其連接到pMD-18克隆載體中，形成pMD-Cat LI質粒，然後進行PCR測序鑑定(見圖4)，測序結果見圖7 (SEQ ID N0.2)，與預期結果完全吻合。接下來就進行FhCat LI ORF片斷的表達，此時可用設計好的引物(Pel，Pe2)以pMD-Cat LI為模板，擴增目標基因片斷，構建表達質粒pET32a- Cat LI，經測序等鑑定為陽性質粒後轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21 (DE3)，在37°C和適當濃度IPTG的刺激下獲得高度表達的Cat LI蛋白，然後將此蛋白經HiS-Tag柱純化後透析，最後收穫蛋白，蛋白濃度為1.54mg/ml。整個蛋白的表達見圖5，其中A為蛋白在ImM IPTG刺激下獲得的SDS-PAGE蛋白條帶，B為過柱純化後獲得的片斷SDS-PAGE蛋白條帶，所有條帶大小均符合蛋白預期分子量。在運用western blotting方法鑑定此蛋白前,需要獲得Cat LI的多克隆抗體,為此，將5隻6-7周齡雌性SD大鼠分別後腿肌肉注射30 μ g/只的純化後的Cat LI蛋白，總共進行3次免疫,每次間隔I周,最後I次免疫後I周採血分離血清用於western blotting。在獲得Cat LI的多克隆抗體後，將方法2中利用His-Tag融合蛋白純化試劑盒純化後的蛋白進行SDS-PAGE (30V，Ih)電泳後轉至尼龍膜上進行Western blotting鑑定。將膜用15ml IXTBS清洗2次後加入5%脫脂奶粉TBS液封閉未結合蛋白位點。經過2次IXTTBS再清洗後，將尼龍膜撫育在多克隆抗體中lh，用所獲得的Cat LI多克隆血清(1:300稀釋)，再經2次I X TTBS清洗後加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，經2次I X TTBS清洗後加入發和光底物Chemi Glow,然後進行成像處理以鑑定蛋白的表達情況。結合在真核細胞Cos7中的表達(圖6A)並進行的Western blotting鑑定,可以確定所獲得的目的蛋白為正確的FhCat LI蛋白。然後設計合成單鏈抗體ScFvm45的核苷酸序列。根據文獻報導的單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5』和3』分別加入CACC鹼基和BamH I序列後進行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時合成SF的isotype序列。其中的isotype序列是SF的同形異構體，不具有特異結合DEC205的功能。具體的結構見圖3，其中加粗紅色斜體分別為CACC接頭序列和BamH I酶切位點；下劃線為序列的信號肽SP，該序列廣泛應用於真核表達系統，可促進目的基因表達；黃色序列為Linker (G4S)3 ；Linker前為重鏈VH，後為輕鏈VL (見圖2)。合成scFvNLDC-1 45的核苷酸序列後即可構建質粒pVAXl- SF-Cat LI。將pVAXI和合成的SF進行體外連接後 轉化大腸桿菌T0P10，然後提取質粒進行鑑定，測序正確的陽性重組質粒pVAXl- SF及方法I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化到感受態細胞JM109中，利用質粒提取試劑盒(QIANGEN)提取質粒並進行測序鑑定後獲得pVAXl-SF- Cat LI陽性質粒。然後PCR鑑定(見圖3)，並進行序列測定(見圖7 (SEQ ID N0.3))，所得結果證明序列完全正確，獲得P VAX 1- SF-Cat LI陽性質粒，與此質粒同時構建的還有其他幾個質粒(見圖1 )，分別都進行了鑑定後宣告本實驗所需要的所有質粒構建完成。接下來要進行動物試驗，其前提是要獲得足夠的質粒，所以進行了 DNA質粒的大量製備方法是將陽性質粒轉染至大腸桿菌後接種500ml含有5(^8/!111氨苄西林的1^培養基中，371:培養1611。將培養物於41: 6000g離心30min後收集沉澱，並按照QIAGEN-tip 500試劑盒說明進行質粒的大量提取。獲得的質粒用UV260nm測定其濃度後儲存於4°C備用。二、對疫苗免疫大鼠的效果評價在獲得大量質粒後，需要對大鼠進行免疫，並對免疫效果進行評價。在獲得大量肝片吸蟲囊蝴後(見方法9)，本試驗將將70隻6-8周齡雌性SD大鼠隨機分成7組，每組10隻，分別在腿部肌肉注PBS空白對照，40μ g/只pVAXl空質粒，pVAXl-Cat LI，pVAXl- SF,pVAXl-1SOSF-Cat LLpVAXl-SF-Cat LI 和 pcDNA-Cat LI (對照質粒，由實驗室保存)質粒，總共進行2次免疫，每次間隔7天。第2次免疫後14天將其中35隻大鼠採血I次進行抗體水平測定，同時將其中的35隻(每組5隻)用作囊蝴感染，每隻大鼠經口感染30個囊蝴，在感染後63天即可處死大鼠，採集血液和脾臟以備實驗。在接下來的動物體液免疫評估中，採用間接ELISA對肝片吸蟲特異性IgGl和IgG2a進行測定，即應用本試驗pET32a表達載體表達的CatLl蛋白(5mg/ml，50 μ I/孔)包被96孔ELISA平板，於4°C過夜。然後用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在進行2次TBST洗滌後加入50μ I/孔的倍比系列稀釋的血清(起始濃度1:100)，於4°C孵育過夜。將平板洗滌後加入1:6000稀釋的IgGl或1:4000稀釋的IgG2a，並於室溫孵育2h，然後加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當出現藍色時加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應並於450nm讀數OD值。抗體效價的判定標準為:取大於標準差3倍的0.D值所對應的最大稀釋度為抗體效價。所得的抗體效價見圖8，結果顯示pVAXl-SF-Cat LI免疫可刺激機體產生高滴度的I gG I，且 I gG I 的水平較 I gG2a 高。pVAX I 空質粒，pVAX 1-Cat LI，pVAX 1-SF，pVAX 1-1 SOSF-CatLI和pcDNA-Cat LI免疫大鼠後產生的IgGl均顯著低於pVAXl-SF-Cat LI，但在IgG2a上，組間無統計學差異。動物細胞免疫評估採用夾心ELISA對肝片吸蟲感染引起的外周血中細胞因子水平進行測定，所用試劑均為商品試劑盒。分別於96孔板加入50 μ I/孔的捕獲抗體(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFNy ,1:250)進行抗體包被，並於 4°C過夜。在用 200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h後分別加入50 μ I/孔倍比倍稀釋的標準抗體(起始濃度IL4，8ng/ml ；IL5, IOng/ml ；IFNy ,50ng/ml)及50 μ I/孔的血清樣品，並於4°C過夜。洗滌3次後加入生物素標記的抗體(終濃度IL4，IL5，IFNy I μ g/ml)，於室溫孵育Ih後加入AMDEX鏈黴親和素孵育30min。洗滌3次後加入50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202顯色，當出現藍色時加入50 μ I/孔IMmH2SO4終止反應並於450nm讀數OD值。結果見圖9，顯示pVAXl-SF-Cat LI能刺激大鼠產生 IL4 和 IL5，且較 pVAXl 空質粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl-SF 和 pcDNA-Cat LI 顯著增加，而IFNy的規律卻與IL4和IL5不同，各組間無明顯差異。為進行T細胞增殖試驗，於大鼠第二次免疫後14天獲取大鼠脾臟，在無菌條件下獲取脾單細胞培養物，用紅細胞裂解液處理後重懸細胞，以IO6/孔的細胞密度在96孔板上培養脾細胞(培養液為Sigma公司的RPM1-1640)。然後分別加入重組表達的CatLl蛋白(10 μ g/ml),刀豆蛋白A (ConA, I μ g/ml)進行體外刺激培養。以RPMI基礎培養基作為對照組。培養48小時後，加入10% Alamar Blue (Invitrogen)後24小時於540nm讀取OD值，以此測定T細胞的體外增殖情況。圖10表明，與pVAXl-Cat LI及pcDNA- Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾細胞顯著增殖。最後，本研究對疫苗的保護效率進行了直觀評價，於第2次免疫後14天將將其中的35隻(每組5隻)用作囊蝴感染，每隻大鼠經口感染30個囊蝴，在感染後63天即可處死大鼠，根據最後獲得的肝片吸蟲數量來評估疫苗保護率。保護率的計算按照(PVAX1空質粒免疫組的蟲體數量減去pVAXl-SF-Cat LI或pcDNA-Cat LI免疫組蟲體的數量)除以pVAXl空質粒免疫組的蟲體數量的百分數來記錄。試驗結果(見圖ll)，pVAXl-SF-Cat LI獲得83.1%保護率，而對照組pcDNA-Cat LI卻只獲得36.3%減 蟲率。本發明利用樹突狀細胞(DC)的表面分子DEC-205的單鏈抗體SCFVNU)G_145靶向DC細胞，提高了 Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat LI的DNA疫苗後對肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高了 FhCat LI DNA疫苗的免疫保護率，且與常用的以pcDNA3.1為骨架且無DC靶向的疫苗(本研究為pcDNA-Cat LI)相比，具有很大的技術優勢，可用於我國抗肝片吸蟲病DNA疫苗的開發。參考文獻:1.Mas-Coma MS, Esteban JGj Bargues MD.Epidemiology of humanfascioliasis: a review and proposed new classification.Bulletin of the WorldHealth Organization 1999，77(4):340 - 6.
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權利要求
1.一種提高肝片吸蟲Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗免疫保護率的方法，所述方法包括以下步驟: 1)運用反轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR擴增目的基因肝片吸蟲CatLI，將擴增得到的Cat LI基因回收後連接入pMD18-T載體，獲得pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)； 2)利用大腸桿菌工程菌(Escherichiacoli)和真核細胞Cos7表達目的蛋白； 3)製備CatLI多克隆抗體 4)純化和鑑定目的蛋白 5)設計合成單鏈抗體ScFvm45的核苷酸序列SEQID N0.1:用單鏈抗體片斷ScFvm45序列，在其5』和3』分別加入CACC鹼基和BamH I序列後進行全基因合成，合成片斷命名為SF,同時合成SF的i sotype序列； 6)構建並鑑定編碼SCFVNU)e_145及目的蛋白的真核表達質粒:將pVAXl和合成的SF進行體外連接後轉化大腸桿菌T0P10，然後提取質粒進行鑑定，測序正確的陽性重組質粒P VAX 1- SF及步驟I中獲得的pMD-Cat LI分別用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化 到感受態細胞JM109中，提取質粒並進行測序鑑定後獲得PVAXl-SF- Cat LI 陽性質粒，pVAXl- SF-Cat LI 中 SF-Cat LI 序列為 SEQ ID N0.3 ； 7)動物免疫及感染試驗； 8)動物體液及細胞免疫評價； 9)免疫保護率評價。
全文摘要
一種提高肝片吸蟲Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保護率的方法，所述方法從提高其抗原在樹突狀細胞中的呈遞作用入手，利用樹突狀細胞(DC)的表面分子的DEC-205的單鏈抗體scFvNLDC-145能靶向DC細胞的重要作用機理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫編碼FhCat L1的DNA疫苗後對肝片吸蟲感染的抵抗力，從而提高FhCat L1的DNA疫苗的免疫保護率。
文檔編號A61P33/12GK103083684SQ20121050885
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者羅洪林 申請人:西南大學