牛y染色體特異性引物序列及在牛胚胎性別鑑定中的應用的製作方法
2023-06-08 09:29:31
專利名稱：牛y染色體特異性引物序列及在牛胚胎性別鑑定中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用巢式PCR來鑑定牛早期胚胎性別的牛Y-染色體特異性引物序列。
牛早期胚胎的性別鑑定已有十幾年的發展歷史，從早期的免疫學方法到胚胎細胞的染色體核型分析和現在的分子生物學方法，該項技術取得了巨大的進展，但真正進入可以實際應用階段是聚合酶鏈式反應(PCR)技術在牛早期胚胎性別鑑定中的應用。Herr CM等首先成功應用了PCR技術鑑定牛羊胚胎性別(Herr CM，Theriogenology，1991，35(1)45-54)。在國內，曾溢滔等在1991年通過對牛Y-染色體性別決定區(SRY)基因核心序列的直接測序，並通過測定SRY基因核心序列的存在與否鑑定了奶牛胚胎的性別(中國科學(B)，1993，23(4)371-375)。目前人們常用來鑑定牛胚胎性別的序列有Y-染色體重複序列、SRY基因核心序列等，但Y-染色體重複序列常常會因為在其他染色體上可能存在其同源序列而影響胚胎性別鑑定的準確率，曾溢滔等所應用的SRY核心序列也有其不足之處，因為SRY基因的核心序列在哺乳動物間有很高的同源性(達80％以上)，如和人的SRY基因的核心序列的同源性高達84％，這樣在進行牛胚胎性別鑑定時男性操作者和其他動物的DNA容易對鑑定過程產生汙染，特別是在野外進行PCR操作時，因為環境條件不夠嚴格，容易產生假陽性，從而影響胚胎性別鑑定的準確率。並且Herr CM等所用的常規PCR一次擴增的靈敏度有限，因為胚胎性別鑑定時所能從胚胎切割取樣的細胞數很少，所以有時會造成由於擴增產物的量太少而影響鑑定結果的判斷。
本發明的另一個目的是牛Y-染色體特異性引物序列在牛早期胚胎性別鑑定中的應用。
本發明的目的是這樣實現的本發明是先提取牛耳組織基因組DNA，進行引物特異性檢驗，然後分割胚胎的細胞樣品，提取胚胎細胞樣品DNA後，使用巢式PCR進行胚胎性別鑑定的方法來進行牛的性別控制，用外引物進行PCR反應時公牛樣品可以擴增出255bp的片段，使用Y染色體特異片段的內、外引物進行巢式PCR反應時公牛樣品則可以擴增出205bp的擴增片段，而母牛樣品使用這些引物則沒有任何擴增產物，從而可以鑑定牛胚胎性別。
從相關報導中知道SRY基因核心序列以外的區域在目前所檢測的哺乳動物中同源性低於54％，利用這一特點，本發明根據美國基因庫(Genbank)所提供的Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因5′調控區序列，設計合成了A、B、C3條嵌套式引物(見表1)，並利用巢式PCR靈敏度和特異性高的特點，使用巢式PCR鑑定牛胚胎的性別。
表1公牛特異的Y-染色體片段引物序列引序 列物A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′在實際應用中如果只使用Y-染色體特異性引物序列，在牛胚胎性別鑑定過程中容易產生假陰性，因此本發明根據牛酪蛋白基因序列設計合成了一對牛酪蛋白基因引物作為內標基因引物。這樣使用Y-染色體特異性序列引物和牛酪蛋白基因引物對牛DNA或牛胚胎進行性別鑑定時，母牛就只能擴增出403bp的內標基因——牛酪蛋白基因片段，而公牛則同時能擴增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的牛酪蛋白基因片段(見附
圖1)，如果胚胎細胞丟失則沒有任何擴增產物。
綜上所述，本發明提供了Y-染色體特異性序列引物，並且該引物特異性強和其他哺乳動物的同源性低，避免了其他動物DNA給牛胚胎性別鑑定帶來汙染的問題。同時本發明提供的是嵌套式引物，使用的巢式PCR技術提高了性別鑑定的靈敏度和特異性，而且內標基因引物的使用排除了性別鑑定中假陰性錯誤，保證了鑑定結果的可靠性。本發明完全適合在野外操作，便於在生產中使用。
M100bp梯度的DNA分子量標準；1、2、4、6、7為母牛，3、5、8為公牛；9為空白對照，10為陰性對照，11為陽性對照；205bp為公牛Y-染色體特異性片段的PCR擴增產物的電泳條帶；403bp為公、母牛共有基因(內標基因)——酷蛋白基因的PCR擴增產物的電泳條帶。
圖2為引物進行牛胚胎性別鑑定的結果。
1、4、6泳道同時擁有205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因擴增片段的電泳帶，所以性別鑑定為雄性胚胎，而2、3、5、7、8泳道只有酪蛋白基因擴增片段的電泳帶，所以性別鑑定為雌性胚胎。
實施例1通過牛基因組DNA進行性別鑑定，檢測引物的特異性。
先提取公牛和母牛的耳組織DNA，再將提取後的牛耳組織DNA溶於400μl滅菌超純水中，然後取0.5μl用於巢式PCR。
本發明根據Genbank所提供的Y-染色體特異性DNA序列中的SRY基因5′調控區序列，設計合成的引物序列如下所示引物 序列A 5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′B 5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′C 5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′使用本發明設計合成的引物進行性別鑑定的具體實驗過程如下巢式PCR的反應體系為第一次PCR反應體系體積為10μl，其中含引物A、B和酪蛋白基因引物各0.1μmol/l，Taq酶2.0U，共20個循環。取第一次PCR反應物2～4μl作為第二次PCR反應模板，同時加入引物C、B和酪蛋白基因引物各0.25μmol/l，Taq酶2.0U共進行30個循環。循環參數為預變性94℃，5min；變性94℃，30s；退火63℃，30s；延伸72℃，1min，最後在72℃，5min。PCR反應在PTC-100(MJ Research)上進行。擴增產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察結果。
結果表明只使用引物A、B進行PCR擴增時公牛可以擴增出255bp的片段，使用引物A、B、C和酪蛋白基因引物進行巢式PCR擴增時公牛可以擴增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而母牛DNA樣品則只能擴增出403bp的酪蛋白基因片段(如附圖1)。共檢測了19頭公牛和27頭母牛的DNA樣品，性別檢測的結果和實際完全相符，說明本發明設計合成的Y-染色體特異性序列引物公牛特異。
實施例2牛胚胎性別鑑定微量牛胚胎細胞DNA的提取使用簡易胚胎分割儀，從桑椹胚或囊胚切取4-6個細胞，然後把胚胎細胞樣品放入200μl離心管後，加入7μl滅菌超純水；在離心機上短暫離心，使胚胎細胞樣品存在於離心管底，用封口膜封好離心管；在100℃煮沸10-15min後立即置於冰上；冷卻後14000r/min離心10min，取上清用PCR。其巢式PCR的反應體系和循環參數與實施例1相同。胚胎的性別鑑定結果如附圖2所示。雄性胚胎可以擴增出205bp的Y-染色體特異性片段和403bp的酪蛋白基因片段，而雌性胚胎則只能擴增出403bp的酪蛋白基因片段。共檢測了12個胚胎的性別，性別鑑定胚胎移植後產犢牛的性別和檢測結果完全相一致。
實施例3使用本發明所設計的引物對人、羊和豬的基因組DNA進行PCR擴增，檢測引物是否牛特異。
採集人、羊和豬的血液，提取DNA後，用於巢式PCR擴增，其具體的實驗過程與實施例1相同。結果所有的人、羊和豬的基因組DNA都沒有任何擴增產物，說明本發明設計的引物嚴格牛特異，男性操作者和其他動物的DNA不會對牛胚胎性別鑑定結果產生汙染。
權利要求
1.一種牛Y-染色體特異性引物序列，其特徵在於這些引物序列如下所示5′-AGCATTCTGAAAGTCGTTAGCAC-3′5′-ATGAAGGTGCAGCAGACATACTA-3′5′-AGCTACTGGAATACGTACATAGA-3′
2.牛Y-染色體特異性引物序列在使用巢式PCR進行牛早期胚胎性別鑑定中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種牛Y－染色體特異性引物序列及其在牛胚胎性別鑑定中的應用,它是先提取牛耳組織DNA,進行引物特異性鑑定後,再提取胚胎細胞樣品DNA,然後使用巢式PCR進行牛胚胎性別的鑑定,用外引物進行PCR反應時公牛樣品可以擴增出255bp的片段,使用內引物進行PCR反應時公牛樣品則可以擴增出205bp的擴增片段,而母牛樣品使用這些引物則沒有任何擴增產物,說明引物公牛特異,從而表明使用該引物可以鑑定牛胚胎性別。本發明具有既能減少汙染、提高準確率又能提高靈敏度的優點,而且本發明完全適合在野外操作,便於在生產中使用。
文檔編號C07H21/04GK1384209SQ02111848
公開日2002年12月11日 申請日期2002年5月23日 優先權日2002年5月23日
發明者黃路生, 陳從英, 陳靜波, 任軍, 陳克飛, 丁能水, 高軍, 艾華水 申請人:江西農業大學