菊芋凝集素、其編碼基因及其在抗蟲植物基因工程中的應用的製作方法

2023-06-07 23:20:56

專利名稱：菊芋凝集素、其編碼基因及其在抗蟲植物基因工程中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及菊芋凝集素蛋白，其編碼基因，攜帶所說基因的植物表達載體；還涉及被所說的植物表達載體轉化的植物細胞和由這些細胞再生的對同翅目害蟲具有抗性的轉基因植物及其後代，包括植物種子和植物組織；本發明尤其涉及抗同翅目害蟲的水稻、棉花、小麥或十字花科的蔬菜。
1888年凝集素被發現時，根據它的特性被命名為血細胞凝集素(haemagglutinin)，在隨後的很長時期內一直沿用這個名稱。直到發現一些植物凝集素選擇性地凝集ABO血型系統中某種類型的血細胞，Lectin一詞才被提出，用於說明植物凝集素凝集反應的選擇性特徵(Boyd andReguera，Jounal of Immunology 1949，62333-339)。Lectin一詞來源於希臘語lgere，意思是選擇，但是這個名稱並不十分嚴格，因為它同時包括了一些具有一般凝集活性單並非凝集素的蛋白質。從嚴格意義上說血細胞凝集素(haemagglutinin)一詞更準確地說明了凝集素凝集紅細胞的能力，但是由於血細胞凝集素同時具備凝集其它細胞的能力，所以，凝集素(agglutinin)一詞更為合適。儘管haemagglutinin、lectin、agglutinin的準確含義並不相同，它們通常被用以描述同一類蛋白質，在三個名詞中，lectin一詞使用的相對較多。凝集素最初的定義是指非免疫來源的糖結合蛋白，可以凝集細胞或沉澱糖聚合物，Peumans和Van Damme(Peumans andVan Damme，Plant Physiol.1995，109347-352)於1995年將植物凝集素定義為至少具有一個可與單糖或寡聚糖特異、可逆結合的非催化結構域的植物蛋白，根據這一定義，一大類具有不同凝集細胞或沉澱糖綴合物能力的植物蛋白均被包括在凝集素的範疇內。
根據凝集素胺基酸序列的同源性及其在進化上的關係，植物凝集素被分為7個家族豆科凝集素，幾丁質結合凝集素，單子葉甘露糖結合凝集素，2型核糖體失活蛋白，木菠蘿素(jacalin)家族，葫蘆科韌皮部凝集素和莧科凝集素(Peumans and Van Damme，Biotechnology and GeneticEngineering Reviews 1998，15199-228)。
現在對植物凝集素的生理作用尚不清楚，但比較一致的看法是凝集素的糖結合活性及其專一性決定了它們的功能。專一性研究表明外源多糖可能是許多植物凝集素最可能的受體，外源多糖包括真菌及植物病毒表面、昆蟲及草食動物腸道細胞表面的幾丁質、糖綴合物。基於凝集素與糖的相互作用，對凝集素的生理作用有許多假說，例如，植物體內的凝集素與糖的相互作用，被認為和糖的運輸、儲藏物質的積累、細胞間的互作以及細胞分裂的調控等過程有關。凝集素與外源多糖的互作被認為是植物/微生物互作、共生關係的建立及對外源生物防禦機制建立的決定因素。後來人們認識到植物凝集素不僅在植物體內起作用，如作為氮源、特異的識別因子等，而且在植物抵抗外來生物如植物病毒、昆蟲、草食動物的防禦反應中起作用。許多植物凝集素存在於儲藏器官中，它們既可以作為氮源，也可以在植物受到危害作為防禦蛋白發揮功能，例如，黑刺槐和接骨木的樹皮中積累了大量的凝集素，可以引起鼠類中毒，因而不受嚙齒類等動物的危害，而樹皮中不含凝集素的種類，如楊樹、柳樹、野蘋果等極易嚙齒類的危害(Peumans and Van Damme，Biotechnologyand Genetic Engineering Reviews 1998，15199-228)
人工飼養試驗表明，許多植物凝集素對咀嚼式昆蟲具有毒性，如麥胚凝集素(WGA)、馬鈴薯塊莖凝集素、花生凝集素、刺蘋果種子凝集素、蕁麻屬(stinging nettle)凝集素抑制豆象幼蟲的發育(Murdock et al.，Phytochemistry 1990，2985-89；Huesing et al.，Phytochemistry1991，303565-3568)。玉米螟幼蟲在WGA、紫羊蹄甲種子凝集素劑量很低即可被毒殺，玉米根螟可以被商陸屬凝集素毒殺，被其它幾種凝集素抑制生長發育(Peumans and Van Damme，Biotechnology and GeneticEngineering Reviews 1998，15199-228)。最近的工作發現刺吸式昆蟲如椰粉蝨、葉蟬、蚜蟲等對一些單子葉植物甘露糖結合凝集素敏感，例如純化的雪花蓮外源凝集素(GNA)及轉gna菸草的昆蟲飼餵均表明，GNA對刺吸式昆蟲具有抗性，而且還可以抗植物病原性線蟲(Hilder etal.，Transgenic Research 1995，418-25)。植物凝集素對鞘翅目、雙翅目害蟲的毒性也有報導(Gatehouse et al.，Moluecular Breeding 1999，5153-165)。上述結果說明植物凝集素在植物中具有防禦功能。
植物凝集素對昆蟲及動物產生毒害的機理尚不十分清楚，一般認為植物凝集素可能通過與糖蛋白，如昆蟲圍食膜表面的幾丁質、消化道上皮細胞的糖綴合物、或糖基化的消化酶等結合而影響昆蟲、動物對營養的吸收，促進消化道中細菌的繁殖及誘發病灶，抑制昆蟲的生長發育、繁殖，最終達到殺蟲、或對動物產生毒害的目的。
近年來，植物凝集素在抗蟲基因工程中的應用，特別是針對蚜蟲等同翅目害蟲抗性的應用受到了愈來愈多的重視。報導的具有抗蚜活性基因除植物凝集素基因外，還有ipt基因(異戊烯基轉移酶基因)及Mi基因(番茄抗線蟲基因)，其中應用最多的是植物凝集素基因，包括雪花蓮外源凝集素(GNA)基因、伴刀豆凝集素(ConA)基因、莧菜凝集素(AHA)基。報導的轉凝集素基因的植物有菸草、水稻、馬鈴薯、小麥、番茄等，它們表現出對菜園夜蛾、桃蚜、水稻褐飛蝨、麥長管蚜等害蟲的抑制和抗性，例如，Shi等(Shi et al.，Journal of Experimental Botany 1994，45623-631)將GNA置於韌皮部特異啟動子RSs1的控制下，轉化菸草，對GNA的免疫定位分析表明，GNA僅在韌皮部表達，同RSs1-uidA的GUS染色結果一致，對桃蚜蜜露的免疫檢測也證明轉基因菸草中表達的GNA被運輸到韌皮部汁液中，認為韌皮部特異啟動子RSs1可以用於控制殺蟲蛋白，如GNA在植物韌皮部的特異表達，進而防治吸食韌皮部汁液的害蟲。Stoger等(Stoger et al.，Molucular Breeding 1999，565-73)將GNA置於組成型啟動子及韌皮部特異啟動子控制之下，轉入小麥，獲得的轉基因小麥顯著降低了麥長管蚜的生殖力，若蟲數量平均下降50％，蚜蟲的存活率為對照的60％。Gatehouse等(Gatehouse et al.，Entomol.Exp.Appl.，1996，29295-307)將GNA轉入馬鈴薯，結果表明轉基因馬鈴薯顯著降低了桃蚜的繁殖力，每個雌蚜蟲每天產卵4.1-4.2個，對照為5.4個。Rao等(Rao et al.，Plant Journal 1998，15469-477)將GNA轉入水稻，昆蟲試驗結果表明水稻褐飛蝨的生存率下降，開始每株接種25頭，13天後，轉基因植株上有7.6頭，對照植株上有11.6頭；發育受到抑制，13天後，轉基因植株平均每株有0.8頭髮育到成熟階段，而對照為6.4頭；生殖力下降約30％。Gatehouse等(Gatehouse et al.，Moluecular Breeding1999，5153-165)將ConA轉入番茄後，ConA表達的植株抑制了番茄夜蛾幼蟲的發育，幼蟲體重下降的程度大於45％；使桃蚜的生殖力下降45％。周永剛等(周永剛等，生物工程學報，2001，1734-39)從莧屬植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)中克隆了莧菜凝集素基因的cDNA和基因組片段(AHAc和AHAg)，分別轉化菸草，斑點免疫檢測表明，轉基因植株葉片中有AHA蛋白的表達，對蚜蟲的蟲試結果表明AHAc和AHAg對蚜口密度的平均抑制率分別為48.8％和57.2％，有的植株高達90％以上，他們認為AHAg較AHAc具有更好的抗蚜性，表達AHA蛋白的轉基因菸草主要通過對抑制蚜蟲的繁殖而影響其群體的形成，對蚜蟲死亡率的影響不大。
菊芋凝集素屬於木菠蘿素家族，由4個單體構成一個四聚體，具有甘露糖結合特異性。對其立體結構的研究表明，12條鏈構成的三個β片層排列成β稜柱狀結構，β片層的方向與β稜柱的軸平行(Barre et al.Biochimie 2001 83645-651)。菊芋凝集素在結晶時形成八聚體，八聚體呈環狀排列，糖結合位點包括5個胺基酸殘基(Gly18，Gly135，Asp136，Val137，Asp139)，它們與甘露糖通過8個氫鍵相連(Bourne et al.，Structure1999，71473-1482)。
本申請所披露的內容中，使用了很多術語。在申請中，「基因」是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，並包括該編碼區前面(5』非編碼區)和後面(3』非編碼區)的調控序列。「外源基因」是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉移導入的基因；也可是指正常存在於宿主生物中的，但又被重新導入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導致一種內源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現。
「啟動子」是指一段可與RNA聚合酶及其他一些影響轉錄的反式因子結合而準確有效地起始轉錄的DNA序列。「組成型啟動子」是能驅動目的基因在生物體各發育階段和不同部位表達，且表達水平沒有明顯差異的一類啟動子。「組織特異性啟動子」是指驅動目的基因在生物體特定組織中表達的一類啟動子。「器官特異性啟動子」是指驅動目的基因在生物體特定器官中表達的一類啟動子。「誘導型啟動子」是指在一定的外界條件下(如光、溫、化學物質等)誘導下驅動目的基因表達的一類啟動子。
「複合啟動子」是不同啟動子之間或啟動子和調控序列共同構成的。調控元件包括能增強外源基因表達或調控基因在植物中表達部位的各種來源的DNA序列。旨在增強外源基因表達的序列是水稻Actin1內含子1、玉米Ubiquitin內含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1內含子1、玉米乙醇脫氫酶1-S基因內含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外顯子以及水稻EPSP合成酶基因第一內含子。
「增強子」是能夠增強啟動子轉錄活性的一段順式調控序列。「內含子」是一段不轉錄的DNA序列，某些基因的個別內含子能增強啟動子的轉錄活性。
「植物表達載體」是指能驅動目的基因在植物體內表達的載體。「整體水平的轉化」是指以生物體為轉化受體的轉化方法，它包括花粉管通道法介導的基因轉化、生殖細胞浸泡法、胚囊或子房注射法等。
「cDNA文庫」是從mRNA逆轉錄成cDNA單鏈，經DNA聚合酶的作用轉變成雙鏈cDNA分子，然後插入到適當的載體中並克隆化而形成的集合。
「簡併性」是由於遺傳密碼子第3位的可搖擺性而導致的多個密碼子對應一種編碼胺基酸的現象。
在本描述中，「植物」意味著任何能夠進行光合作用的分化的多細胞有機體，「植物細胞」意味著來源於植物並能夠形成未分化組織例如愈傷組織或分化的組織例如胚或植物部分或種子的任何細胞。
本發明通過測定菊芋塊莖cDNA文庫誘導表達產物對胰蛋白酶的抑制活性，進行了文庫篩選，獲得了4個同源的cDNA序列，推測的胺基酸序列與Jacalin家族的甘露糖結合凝集素具有同源性，其中與Van Damme等人(Van Damme et al.，Eur.J.Biochem.1999 259135-142)報導的Heltuba具有高度同源性，核苷酸序列的同源性在85.2％～97.8％之間，胺基酸水平的同源性在91.3％～97.9％之間。將獲得的cDNA序列在大腸桿菌中進行了誘導表達，細菌表達產物的抑制活性測定結果表明，該基因表達產物具有胰蛋白酶抑制活性，凝血試驗也表明其具有凝集素的糖結合活性，因此本發明認為該基因編碼一種雙功能的蛋白質，具有凝集素的糖結合活性及蛋白酶抑制活性，將其命名為hta。
本發明的目的是針對以下兩個事實(1)蚜蟲、稻飛蝨、葉蟬等同翅目害蟲在世界範圍內對植物危害嚴重。同翅目昆蟲的口器為刺吸式，其腸道內的消化酶水平很低，它們通過吸食植物韌皮部汁液獲得營養，直接利用韌皮部中的自由胺基酸作為氮源，無法利用Bt毒蛋白或蛋白酶抑制劑的策略防制刺吸式害蟲(Stoger et al.，Molecular Breeding 1999，565-73)，因而轉Bt、SCK基因的植物對刺吸式害蟲如蚜蟲沒有效果。蚜蟲等同翅目害蟲除通過吸取韌皮部汁液直接危害植物外，還通過攜帶多種植物病毒對植物造成間接危害。植物凝集素對同翅目害蟲具有抗性，與Bt、SCK在抗蟲上具有互補性，互補性包括兩個方面，一是同Bt、SCK在抗蟲譜上的互補，二是通過對凝集素攝取，可以加強Bt、SCK對鱗翅目昆蟲的毒殺作用，降低昆蟲產生抗性的機率。(2)化學殺蟲劑的廣泛使用，除造成環境汙染外，在殺死害蟲的同時也會殺死益蟲，破壞生態平衡。利用轉基因技術將殺蟲基因導入植物，使植物獲得抗蟲能力，不僅可以減少農藥的使用量，降低農藥使用造成的環境汙染，而且可以減輕對農田生態系統平衡的人為破壞，有助於生態平衡的重建及恢復，利於農業生產的可持續發展。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種菊芋凝集素蛋白。
本發明的菊芋凝集素蛋白具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6或者SEQ ID NO8所示胺基酸序列。
本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明的菊芋凝集素蛋白的基因。
本發明的菊芋凝集素蛋白的基因具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5或者SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
本發明還提供了一種利用菊芋凝集素基因產生具有抗蟲性的植物細胞和植株的方法，該方法包括以下步驟(a)將菊芋凝集素基因的上遊端沿有義方向上連接於啟動子的核酸片段之後，其下遊端連接於編碼一種用於控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段之前，進而構建植物表達載體；(b)將構建好的植物表達載體轉化植物細胞；(c)在適宜的培養條件下將轉化後的植物細胞再生，得到表達目的基因的植株。
在本發明的上述方法中，所述的啟動子可以包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或者由啟動子和調控元件組成的複合啟動子。所用的轉化方法可以包括農桿菌介導的轉化方法、基因槍法、原生質體介導的轉化方法、電擊法或者整體水平的轉化方法。所述的植株可以是單子葉植物或者雙子葉植物，例如水稻、小麥、大麥或者菸草、棉花、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、青菜、芹菜、青椒。
本發明還提供了含有本發明所述的基因的植物表達載體。
下面結合實施例進一步闡明本發明，而不構成對本發明權利要求範圍的限制。在實施例中，所用的術語和縮寫是本領域技術人員通用的術語和縮寫。實施例1菊芋塊莖cDNA文庫的構建菊芋塊莖cDNA文庫的構建於表達型噬菌體載體λTripIEx2中，採用Clontech公司的SmartTMcDNA文庫構建試劑盒，按照所提供手冊上的方法進行。1.1RNA的提取總RNA的提取按文獻中的方法(Chomezynski and Sacchi，AnalyticalBoichemistry.1987，162156～159)進行，並稍加改進。2.0g塊莖(發育4周)於液氮中研磨成粉，轉移到40ml的離心管中，加入5ml變性液，混勻，加入0.5ml 2M NaAc(pH4.5)，5ml水飽和酚，1ml氯仿，混勻後冰浴15分鐘，10,000g離心10分鐘，上清加入等體積異丙醇，-20℃沉澱1小時，10,000g離心10分鐘後，棄去上清，加入1ml 4M的LiCl洗滌沉澱，10,000g離心後棄上清，沉澱溶於1ml DEPC處理的水中，加1倍體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，上清加入1/10體積3M NaAc(pH4.5)，2倍體積的無水乙醇，-20℃沉澱1小時，10,000g離心10分鐘，沉澱用70％的乙醇洗滌一次，乾燥後溶於適當體積的DEPC處理的水中，-70℃保存備用。1.2 cDNA第一鏈的合成1μlRNA(約1μg總RNA)1μlSMART III引物
1μl CDS III/3′PCR引物加RNase-free的無菌水至5μl，混勻後，72℃變性2分鐘，冰上冷卻2分鐘後，加入2μl 5×First strand buffer1μl DTT(20mM)1μl dNTP(10mM)1μl MMLV逆轉錄酶(200U)混勻，42℃下進行逆轉錄反應1小時。1.3 cDNA第二鏈的合成取2μl 1.2中的產物進行cDNA第二鏈的合成2μl First-strand cDNA80μl H2O10μl 10×cDNA PCR buffer2μl dNTP(50mM)2μl 5′PCR primer2μl3′PCR primer2μl 50×Advantage cDNA Polymerose mix用以下條件在GeneAmp9600(PE公司)中進行PCR反應95℃預變性60秒，95℃變性30秒，61℃復性30秒，72℃延伸6分鐘，進行19個循環。1.4 cDNA的純化、酶切、分級分離及與載體的連接cDNA的純化取50μl 1.3中的產物，加入2μl蛋白酶K(20μg/μl)，混勻，45℃保溫20分鐘後，加入50μl水擴大體積後，經等體積的酚∶氯仿(50∶49∶1)抽提2次，加入10μl 3M NaAC(pH4.5)，1.3μl糖元(20μg/μl)，2倍體積的無水乙醇，-20℃沉澱過夜，10,000g離心10分鐘，沉澱用70％的乙醇洗滌一次，乾燥後溶於79μl水中。
Sfi I酶切79μl cDNA(上一步的產物)10μl 10×Sfi I buffer
10μl Sfi I酶1μl 100×BSA混勻，50℃保溫2小時。加入2μl 1％二甲苯青。
cDNA的分級分離按說明書中推薦的方法，經CHROMA SPIN-400柱進行分離，逐滴收集洗脫液，取5μl電泳檢測cDNA的分布，將包含cDNA的第1、第2、第3滴合併後加入1/10體積3M NaAC(pH4.5)，2倍體積的無水乙醇，1.3μl糖元(20μg/μl)-20℃沉澱過夜，10,000g離心10分鐘，沉澱乾燥後溶於7μl超純水中。
cDNA與載體的連接cDNA0.5μlVector 1.0μlATP(10mM) 0.5μlT4DNA連接酶0.5μl超純水 2.0μl混勻後，於16℃連接過夜。1.5連接產物的包裝、文庫滴度的測定及擴繁50μl包裝蛋白(Promega公司的λDNA包裝系統)中加入5μl連接產物，輕輕混勻，22℃保溫3小時後，加入445μl phage buffer，25μl氯仿。按分子克隆中的方法進行文庫滴度的測定及擴繁(分子克隆實驗室手冊，Sambrook et al，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。獲得的一級文庫包含1.5～2×106個噬菌體，重組率大於95％。文庫擴增後分裝保存於-70℃備用。實施例2菊芋塊莖cDNA文庫的的篩選及hta cDNA片段的獲得為了獲得具有胰蛋白酶抑制活性的基因，本發明通過測定文庫誘導表達產物對胰蛋白酶的抑制活性，在96孔板上進行文庫的逐級篩選。取106個來自二級文庫的噬菌體與適量的宿主菌(XL1-Blue)、LB培養基(含有10mM MgSO4，0.2％麥芽糖，0.1mM IPTG)混合後平均分配到96孔板的每個孔中，37℃於搖床中過夜培養擴繁後，按照胰蛋白酶抑制劑活性的測定方法(工具酶的活力測定蔣傳葵，上海上海科技出版社，1980，p105-107)，測定每個孔的胰蛋白酶抑制活性，具體方法如下從96孔板每孔取50μl裂解產物，對應加入另一新的96孔板中，同時加入50μlTrypsin溶液(0.05mg/ml)，100μl反應緩衝液(Tris-HCl pH8.0，含10mMCa2+)，混勻，30℃反應2小時後，分別取50μl反應混合物轉移到另一96孔板中，加入50μl反應緩衝液及100μ10mM BApNA(含10mM Ca2+，Sigma公司)，立即在酶標儀上測定405nm下5分鐘內光吸收的變化值，與對照比較，確定陽性孔。測定陽性孔的滴度，取105個噬菌體用於下一輪篩選，每一輪所用的噬菌體均較上一輪稀釋10倍，直到每孔稀釋為僅有一個噬菌體時，取陽性孔連續鋪兩次平板，挑取單個的噬菌斑，侵染大腸桿菌BM25.8，通過LoxP位點的重組，帶有外源片段的噬菌體部分環化成具有氨苄抗性(Ampr)選擇性的質粒。106個噬菌體經過5輪篩選後，得到5個陽性孔，從中選取了3個分別連續鋪兩次平板挑取單個噬菌斑，侵染大腸桿菌BM25.8，挑取了24個抗性菌落提取質粒，Sfi I酶切分析插入片段表明，其中23個克隆的插入片段大小基本一致。測序後將cDNA序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)比較的結果表明，該基因的編碼產物與植物凝集素具有同源性，將其命名為hta。實施例3hta基因在大腸桿菌中的表達和胰蛋白酶抑制活性的測定3.1大腸桿菌表達載體的構建大腸桿菌表達載體pET16由中科院遺傳所黃華梁研究員提供。質粒pET16經Nco I酶切後，加Klenow大片段補平末端後，再用Xho I酶切，回收載體部分。質粒pTripHTA經Sma I/Xho I雙酶切，回收hta片段部分，hta片段與pET16載體經T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接產物電擊法轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選獲得重組子pETHTA。質粒提取、酶切、DNA的回收、純化均按分子克隆中的方法進行(分子克隆實驗室手冊，Sambrook et al，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。3.2大腸桿菌的誘導表達及SDS-PAGE電泳將pETHTA電擊轉入E.coli BL21(DE3)菌株中，挑取3個單菌落，於LB液體培養基中過夜培養，按1∶50的比例轉接到新鮮的LB液體培養基中，培養至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.1mM，誘導表達3小時後，離心收集3ml誘導表達後的菌體，重懸於400μl無離子水中，超聲波破菌，4℃、10,000g離心10min，上清即為電泳樣品。SDS-PAGE蛋白電泳按分子克隆中的方法進行(分子克隆實驗室手冊，Sambrook et al，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。蛋白電泳的結果表明，誘導後的大腸桿菌產物中具有特異表達HTA外源蛋白。3.3胰蛋白酶抑制活性的測定取3.2中的上清50μl，按下面的比例混合標準管 樣品管 對照管緩衝液100100100水350300300牛胰蛋白酶50 50 50樣品 0 50 50注單位μl緩衝液50mM Tris-HCl(pH8.0)含40mM Ca2+牛胰蛋白酶1mg/ml混勻，25℃保溫60分鐘，取100μl反應混合物加入1ml底物BApNA(1mM，含20mM Ca2+，Sigma公司)，立即讀出405nm處的光吸收，每隔30秒讀一次，共讀3分鐘，計算Δ405°結果表明pETHTA大腸桿菌產物具有明顯的胰蛋白酶抑制活性。實施例4雙子葉植物表達載體pCNHTA的構建選用CaMV35S組成型啟動子和nos終止子控制hta在植物中的表達，構建植物表達載體。過程如下首先從載體pTripHAT中Sma I/Sac I雙酶切回收hta，插入質粒pSPROK的Sma I/Sac I位點，得到重組子pSRHTA。pSRHTA經Pvu II/Bgl II雙酶切回收35Spromoter-hta-Tnos部分，插入植物表達載體pCNPT-II的Sma I/BamH I位點，得到植物表達載體pCNHTA。質粒提取、酶切、DNA的回收、純化均按分子克隆中的方法進行(分子克隆實驗室手冊，Sambrook et al，New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。
將質粒pCNHTA電擊轉入根農桿菌LBA4404，轉化使用BIO-RAD公司的電激儀，感受態的製備和電激方法參照產品說明書進行，在YEB(Rif25，Km50)平板上28℃暗培養2天後即有轉化菌落長出，進一步從轉化菌中提取質粒予以鑑定。實施例5菸草轉化苗的獲得利用改良葉盤法，通過農桿菌介導法轉化菸草。具體操作過程如下，將實施例4中的含有植物表達載體的農桿菌LBA4404於含有相應抗生素的YEB固體培養基上劃線，28℃避光培養至長出直徑約1mm大小的單菌落(約36h)。取單菌落再度轉接於同樣的固體培養基上，培養至生長旺盛期(約36h)。取少許根農桿菌轉接於20mlYEB液體培養基中(含有相應抗生素，使用100ml三角瓶)，於28℃，220rpm振蕩培養過夜(約18h)。次日以2％～4％的接種量轉接於20ml不含抗生素的YEB液體培養基中，並補加乙醯丁香酮至終濃度為100μM。繼續振蕩培養3～4h，到達對數生長中期時，用三倍以上體積的液體基本培養基稀釋至肉眼稍見渾濁即可(OD600＝0.1)，以備轉化之用。取完全展開的菸草無菌苗葉片，用打孔器(直徑0.9cm)製成葉盤，在菌液中浸泡10min。取出葉盤，用無菌濾紙吸乾後，轉入覆蓋有一層無菌濾紙的共培養培養基中於25℃暗培養2～3天後，將葉盤轉入繼代培養基中。在繼代培養基中光照培養(光/暗周期為16/8h)3天後，將葉盤轉入篩選培養基。繼續培養7～10天後，將葉盤轉入再生培養基。15～20天即可觀察到葉片邊緣長出愈傷或叢生再生芽，一個月左右可長至1～2cm，轉入新的再生培養基中，待其長到3～4cm時，用解剖刀將再生芽切下，並轉入生根培養基中。再生苗在含有卡那黴素(50mg/L)的生根培養基上生根，一個月後待根系發育完全後，將幼苗轉移至溫室生長。實施例6菸草轉化苗的分子鑑定6.1菸草DNA的提取取T0代菸草新鮮葉片0.3mg置於研缽中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml預熱到60℃的CTAB緩衝液(30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巰基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)。60℃保溫30分鐘，其間輕搖數次。然後加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，上清液轉移到新的離心管中加入2/3倍體積異丙醇，形成的沉澱既是DNA，加入少許洗液(體積分數為76％的乙醇，10mM NH4AC)洗滌沉澱一次，乾燥後用500μl TE緩衝液(10M Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)溶解DNA。隨後加入RNase A(終濃度10mg/L)，37℃保溫30分鐘，依次用等體積的苯酚、苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次，水相加入2.5倍體積無水乙醇沉澱DNA。DNA乾燥後溶解於100μl無菌水中。6.2T0代轉基因植株的PCR檢測取1μl6.1中的DNA為模板進行PCR反應。50μl的反應體系中包括5μl 10×PCR反應緩衝液、引物P1(atggctgccagtgacattg)、P2(aggaacaactacgccacc)各1μl(10μM)、1μl DNA模板、4μl dNTP(2.5mM)，1U Taq酶補加無菌水至總體積50μl。PCR反應條件如下94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘、52℃復性1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，進行30個循環，最後72℃延伸10分鐘。取10μl PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測結果。PCR檢測的結果顯示轉基因菸草基因組DNA可以擴增出與目的基因片段同樣大小的單一條帶。6.3T0代轉基因植株的Southern檢測約20μg 6.1中的DNA加入適量的EcoR I(TaKaRa)酶切後，經1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，0.25N HCl脫嘌呤10分鐘，用0.4N NaOH轉移到Hybond-N+(Amersham pharmacia)膜上，轉移後的膜在2×SSC中洗一下，80℃真空固定2小時。在含有7％SDS(W/V)的0.5M磷酸鈉緩衝液中65℃預雜交2小時，加入[α-32P]dCTP隨機引物法標記的hta cDNA探針進行雜交(Promega隨機引物標記試劑盒)。65℃雜交過夜，0.1×SSC(含0.1％SDS)中65℃洗膜，壓X光片，放射性自顯影。雜交結果表明hta已經整合到菸草基因組中。6.4T0代轉基因植株的Northern檢測轉基因菸草葉片總RNA的提取同1.1中的方法。約30μg轉基因菸草的總RNA經含有0.1％甲醛變性膠(1.2％)電泳後，用20×SSC轉移到Hybond-XL膜上(Amersham pharmacia)，轉移後的膜先在水中洗10分鐘，再於10×SSC中洗10分鐘，80℃真空固定2小時後，即可用於雜交，過程同6.3中的方法。Northern雜交的結果表明hta在轉基因菸草中進行了表達。實施例7轉基因菸草的抗蚜性鑑定轉基因菸草對桃蚜的抗性鑑定委託中國農業科學院植物保護研究所農業昆蟲系進行。7.1抗蚜鑑定方法每株T0代轉基因菸草用毛筆接入1-2齡若蚜10頭，接於植株頂部的嫩葉上，盆與盆之間保持一定距離以避免蚜蟲在不同煙株上轉移。煙株置於光照培養室內，光周期16/8h，溫度25℃，每隔3日調查煙株上的蚜蟲數量，共統計4次。
T0代轉基因菸草的種子經30％次氯酸鈉消毒後，置於MS培養基中(平皿)發苗，待長出2-3片真葉後，轉移到含有卡那黴素(50mg/L)的MS培養基中進行篩選，正常生根的幼苗被視為T1代陽性轉基因植株。待煙苗長出4～5片真葉後，每棵菸草苗上接一隻2～3齡左右的桃蚜，每隔3天統計一次繁殖的若蟲數目及若蟲的發育狀況，統計後將若蟲全部取出，共統計3周次。7.2抗蚜數據的統計分析抗蚜數據的統計分析參照常規的統計方法進行(生物統計學李春喜等，科學出版社，第二版，北京，2000)。統計分析的結果表明，T0轉hta菸草對桃蚜的繁殖具有明顯的抑制作用(表1，2，3)，平均抑制率在46.9％～78％之間。。統計分析表明轉基因植株與對照植株上蚜蟲後代數目的差異顯著(表4，5，6)，T1代轉基因植株對桃蚜繁殖的平均抑制率分別為50.1％(hta-b)及64.6％(hta-c)，轉基因植株除對桃蚜繁殖具有明顯的抑制作用，還對若蚜的發育具有抑制作用。表1 T0代轉基因菸草上桃蚜後代群體數目方差分析表變異來源df SSs2F F0.01處理間 4 16287.27 4071.82 14.07**4.77處理內 164630.54289.41總變異 2020917.81表2 T0代轉基因菸草上桃蚜後代群體數目差異性顯著性比較表(新復極差法)差異性顯著性轉化的基因平均數á＝0.05á＝0.01CK93.75 aAhta-c 49.75 bBhta-b 22.67 cBChta-d 21.63 cChta-a 20.5 cC表3 T0代轉基因菸草上桃蚜後代群體數目的LSR值(新復極差法)M 2 3 4 5SSR0.053.003.143.243.30SSR0.014.134.314.424.51LSR0.0525.53 26.72 27.57 28.08LSR0.0135.15 36.68 37.61 38.38表4 T1代轉基因菸草上桃蚜後代群體數目方差分析表變異來源 df SS s2F F0.01處理間 4 6253.14 1563.2926.87**3.72處理內 502908.61 58.17總變異 549161.75表5 T1代轉基因菸草上桃蚜後代群體數目差異性顯著性比較表(新復極差法)差異性顯著性轉化的基因 平均數á＝0.05 á＝0.01CK 34.73aAhta-b 16.59bBhta-c 12.47bB表6 T1代桃蚜後代群體數目的LSR值(新復極差法)M 23 4 5SSR0.05 2.84 2.99 3.08 3.15SSR0.01 3.79 3.96 4.06 4.20LSR0.05 6.53 6.88 7.08 7.25LSR0.01 8.72 9.11 9.34 9.66
序列表110中國科學院遺傳研究所120菊芋凝集素基因及其在抗蟲植物基因工程中的應用130I20012781608170PatentIn version 3.12101211775212DNA213Helianthus tuberosus220221CDS222(48)..(491)2234001cacaacataa gttacttaag aagctttgaa tttgcataga ccagaaa atg gct gcc56Met Ala Ala1act gac att gcg gta cag gcc gga cca tgg gga ggt aat ggt gga aaa104Thr Asp Ile Ala Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Lys5 10 15cgc tgg ttg caa aca gct cgt ggt ggt aag att act tcg atc att atc152Arg Trp Leu Gln Thr Ala Arg Gly Gly Lys Ile Thr Ser Ile Ile Ile20 25 30 35aaa ggc gga act tgt att ttc tcc atc cag ttc gta tat aag gac aaa200Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr Lys Asp Lys40 45 50gat aat att gaa tac cat tct gga caa ttt ggt gtt cag ggt gac aaa248Asp Asn Ile Glu Tyr His Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln Gly Asp Lys55 60 65gct gaa aca att acc ttt gcg gac gat gag gac atc act gcg atc agc296Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr Ala Ile Ser70 75 80gga act ttc gga gca tat tat cac ttg aca gtt gtt aca tcg ctc act344Gly Thr Phe Gly Ala 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Ile Lys Gly Gly Thr Cys Ile Phe Ser Ile Gln Phe Val Tyr35 40 45Lys Asp Lys Asp Asn Ile Glu Tyr His Ser Gly Gln Phe Gly Val Gln50 55 60Gly Asp Lys Ala Glu Thr Ile Thr Phe Ala Asp Asp Glu Asp Ile Thr65 70 75 80Ala Ile Ser Gly Thr Phe Gly Ala Tyr Tyr His Leu Thr Val Val Thr85 90 95Ser Leu Thr Phe Gln Thr Asn Lys Lys Val Tyr Gly Pro Phe Gly Thr100 105 110Val Ala Ser Ser Ser Phe Ser Leu Pro Leu Thr Lys Gly Lys Phe Ala115 120 125Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val130 135 140Val Val Pro1452103211784212DNA213Helianthus tuberosus220221CDS222(48)..(491)2234003cacaacataa gttacttaag aagctttgaa tatgcataga ccagaaa atg gct gcc56Met Ala Ala1agt gac att ggg gta cag gcc gga cca tgg gga ggt aat ggt gga aaa104Ser Asp Ile Gly Val Gln Ala Gly Pro Trp Gly Gly Asn Gly Gly Lys5 10 15cgc tgg ttg caa aca gct cat ggc ggt aag att act tcg atc att atc152Arg Trp Leu Gln Thr Ala His Gly Gly Lys Ile Thr Ser Ile Ile Ile20 25 30 35aaa ggc gga act tgt att ttc tcc atc cag ttc gta tat agg gac 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115 120 125Gly Phe Phe Gly Asn Ser Gly Asp Val Leu Asp Ser Ile Gly Gly Val130 135 140Val Val Pro14權利要求
1.一種菊芋凝集素蛋白，它具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQID NO6或者SEQ ID NO8所示胺基酸序列。
2.編碼按權利要求1所述的蛋白的基因。
3.按照權利要求2所述的基因，它具有如下特徵(a)具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5或者SEQ ID NO7所示的核苷酸序列；(b)因密碼子的簡併性引起的核苷酸序列與權利要求3(a)中所述的序列不同，但仍編碼權利要求1所述胺基酸序列的蛋白的核酸分子；(c)為cDNA分子或基因組DNA分子。
4.一種利用菊芋凝集素基因產生具有抗蟲性的植物細胞和植株的方法，該方法包括以下步驟(a)將菊芋凝集素基因的上遊端沿有義方向上連接於啟動子的核酸片段之後，其下遊端連接於一種用於控制轉錄終止的合適調控序列的核酸片段之前，進而構建植物表達載體；(b)將構建好的植物表達載體轉化植物細胞；(c)在適宜的培養條件下將轉化後的植物細胞再生，得到表達目的基因的植株。
5.按照權利要求4所述的方法，所述的抗蟲性是指抗同翅目害蟲的能力。
6.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的啟動子包括組成型啟動子、器官特異性啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或者由啟動子和調控元件組成的複合啟動子。
7.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於，所用的轉化方法包括農桿菌介導的轉化方法、基因槍法、原生質體介導的轉化方法、電擊法、花粉管通道法或者整體水平的轉化方法。
8.按照權利要求4所述的方法，所述植株的特徵在於，該植株是單子葉植物或雙子葉植物。
9.按照權利要求8所述的方法，所述的植株是水稻、小麥、大麥，或者菸草、棉花、大豆、甘薯、馬鈴薯、白菜、青菜、芹菜、青椒。
10.含有權利要求2所述的基因的植物表達載體。
全文摘要
本發明涉及菊芋凝集素蛋白,其編碼基因,攜帶所說基因的植物表達載體;本發明還涉及利用菊芋凝集素基因產生具有抗蟲性的植物細胞和植株的方法。
文檔編號C12N15/87GK1357553SQ01144120
公開日2002年7月10日 申請日期2001年12月11日 優先權日2001年12月11日
發明者朱禎, 常團結 申請人:中國科學院遺傳研究所