巨噬細胞來源的趨化因子和趨化因子類似物的製作方法

2023-06-08 06:28:51 2

專利名稱：：巨噬細胞來源的趨化因子和趨化因子類似物的製作方法
技術領域：
：大體來說，本發明是有關趨化因子的，更具體而言是純化和分離編碼一種新的人C-C趨化因子的多核苷酸，純化和分離由該多核苷酸編碼的趨化因子蛋白，以及新的趨化因子蛋白的重組體生產的材料和方法。背景趨化因子，也稱作「胞間分泌因子」和「SIS細胞因子」，組成一族小的分泌蛋白(例如、70-100個胺基酸和8-10千道爾頓)，它吸引和活化白細胞，從而輔助免疫系統的激活和調節。「趨化因子」的名字來自趨化性的細胞因子，因這些蛋白能刺激白細胞的趨化性。確實，趨化因子可能構成炎性細胞進入病理組織的主要吸引分子。一般參考巴格歐利尼等，免疫學進展，5597-179(1994)。雖然白細胞有豐富的趨化因子，不同的趨化因子在大量的組織中也表達。同上雜誌，表2。以前確認的趨化因子，互相之間一般具有20-70％的胺基酸同一性，含4個高度保守的半胱氨酸殘基。根據前二個半胱氨酸的相對位置，趨化因子可進一步分為二個亞族。「C-X-C」或「α」亞族，編碼的基因位於人第4號染色體上，前二個半胱氨酸被一個胺基酸隔開。「C-C」或「β」亞族，編碼的基因位於人17號染色體上，前二個半胱氨酸是相鄰的。X-射線晶體學和NMR對不同的趨化因子研究表明，在每一族中，第一和第三個半胱氨酸形成第一條二硫鍵，第二和第四個半胱氨酸形成第二條二硫鍵，強烈地影響蛋白的天然構象。僅在人類中，已描述了每一趨化因子亞族有近十個不同的序列。二類亞族的趨化因子具有20-25個胺基酸的特徵性前導序列。C-X-C趨化因子，包括IL-8，GROα/β/γ，血小板鹼性蛋白，血小板因子4(PF4)，IP-10和其它種類；當比較任二個胺基酸序列時(除GROα/β/γ成員間，互相有84-88％的同一性外)，享有大約25％-60％的同一性。大多數C-X-C趨化因子(不包括IP-10和血小板因子4)在前二個半胱氨酸殘基上遊，有一個共同的E-L-R三肽基序(motif)；它們是嗜中性粒細胞的強刺激因子，引起快速的形態變化，趨化性，呼吸爆發和脫粒化。這些效應由七個跨膜域的，視紫紅質樣的G蛋白偶聯受體所介導；對IL-8特異的受體已被赫爾姆斯等，科學，2531278-80(1991)克隆出來，而識別IL-8，GRD和NAP2的相似受體(77％的同一性)已由墨菲和蒂菲尼，科學，2531280-83(1991)克隆。逐步地去除某一C-X-C趨化因子，包括IL-8，的N端胺基酸序列，與活性的顯著增加有關。C-C趨化因子包括巨噬細胞炎性蛋白MIP-1α和MIP-1β，單核細胞化學引誘蛋白1，2和3(MCP-1/2/3)，RANTES，I-309和其它種類，互相之間享有25％-70％胺基酸同一性。所有前已確認的C-C趨化因子能活化單核細胞，引起鈣流和趨化性。更為選擇性的效應是對淋巴細胞，如T淋巴細胞對RANTES有最佳反應。迄今為止，五個具七個跨膜域G蛋白偶聯的趨化因子受體已被克隆，包括識別MIP-1α和RANTES的C-C趨化因子受體-1(CCR1)(內特等，細胞，72415-425(1993))，識別MCP-1的CCR2受體(查羅等，美國國家科學院院報，912752-56(1994))；識別eotaxin的CCR3(康帕蒂爾，生物化學雜誌，27016491(1995))；識別MIP-1α、RANTES和MCP-1的CCR4(普安等，生物化學雜誌，27019495(1995))；和識別MIP-1α、MIP-1β和RANTES的CCR5(薩姆森等，生物化學，353362(1996))。在不同的病理狀態下，許多趨化因子，特別是IL-8的作用已有充分的文獻記載。一般可參見巴格歐利尼等，同前，表7。如牛皮癬與IL-8的過量產生相關，不同的研究觀察到風溼病、骨關節炎和痛風的患者，其發炎的關節滑液有高水平的IL-8。儘管比IL-8的作用了解得少，在病理狀態下C-C趨化因子的作用也有記載。例如，類風溼關節炎患者的滑液中，MCP-1的濃度比其它關節炎患者高。單核吞噬細胞的MCP-1依賴性內流是特發性肺纖維化形成的重要事件。C-C趨化因子在進入動脈粥樣硬化區的單核細胞募集中的作用，目前已引起廣泛的興趣，在巨噬細胞豐富的動脈壁區而不是一般的動脈組織中，已檢測到MCP-1增強性表達。MCP-1在惡性細胞中的表達顯示抑制這些細胞體內成瘤的能力。(見美國專利號5,179,078，在此引入作為參考)。因而有必要對另外的C-C趨化因子予以確認，描述其特徵，進一步說明這個分子重要家族在病理狀態中的作用，和應用衍生於趨化因子的產物，對這些病理狀態進行改進治療。已表明C-C亞族的趨化因子可用於醫學成像，如對感染，炎症位點和其它具有C-C趨化因子受體分子的位點進行成像。如見昆克爾等，美國專利號5,413,778，在此引入作為參考。此種方法涉及的步驟是，用人工識別技術(如見美國專利號4,965,392和5,037,630，在此引入作為參考)，把標記劑(如放射性同位素)化學附著在C-C趨化因子上，讓受試者用藥學可接受的載體服用標記的趨化因子，使標記的趨化因子在靶位積累，對標記的趨化因子在體內靶位成像。本領域需要有另外新的C-C趨化因子，以增加醫學成像工具的有效貯存。也已表明C-C趨化因子RANTES、MIP-α和MIP-1β是人T細胞對人免疫缺陷病毒(HIV)的抑制效應的主要介導者，HIV導致引起人獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)。這些趨化因子顯示抑制HIV特異株感染培養T細胞系，具有劑量依賴性[科克希等，科學，2701811(1995)]。不過，並不是所有受試的病毒株對這種抑制作用有相同的敏感性；因而需要有另外的C-C趨化因子用作HIV株的抑制劑。更為一般來說，由於趨化因子作為趨化性和炎症介導者的重要性，有必要確認和分離新的趨化因子家族成員，以方便炎症和免疫反應的調節。例如，促進炎症的物質可促進傷口癒合或加速比如從肺炎狀態的恢復，發炎對消除感染的重要的。炎症的調節對具明顯炎症的病理狀態同樣重要。節段性迴腸炎，表現為腸所有層的慢性炎症，疼痛和腹瀉，就是這樣的一種病理狀態。對節段性迴腸炎藥物治療的失敗率相當高，該病即使病人接受外科手術後也常復發。對新的趨化因子的確認、分離和特性分析有利於炎症調節。同樣地，誘導免疫應答的物質可促使任一種病理狀態的緩和或消失。由於白細胞(如中性粒細胞和單核細胞)在細胞介導的免應答中的重要作用，以及趨化因子在白細胞趨化性中的確定作用，有必要識別和分離新的趨化因子，以方便於免疫應答的調節。另外，趨化因子的表達，炎症的條件和疾病狀態之間的確定關係，可把趨化因子和能與趨化因子起特異免疫反應的抗體物質，用作診斷和預後的指徵；有必要識別和分離新的趨化因子，以方便作診斷和預後的指徵。除能吸引和活化白細胞外，某些趨化因子，比如IL-8，能影響非白細胞性細胞的增殖。見塔斯切爾，皮膚病研究雜誌，99294-298(1992)。有必要識別和分離新的趨化因子，以促進這些細胞增殖的調節。為前所提的所有理由，需要有重組生產新發現的趨化因子的方法，該法促進涉及趨化因子和趨化因子抑制劑的臨床應用。發明概述本發明提供新的純化和分離多核苷酸和多肽的方法，以滿足以上所概括的一種或更多種的需求。例如，本發明提出的純化和分離的多核苷酸(即，DNA和RNA，正義和反義鏈)，它編碼一種新的C-C亞族的人趨化因子，在此命名為「來自巨噬細胞的趨化因子」或「MDC」。本發明優選的DNA序列包括基因組和cDNA序列，以及化學合成的DNA序列。cDNA核苷酸序列，命名為MDCcDNA，編碼該趨化因子，列於SEQIDNO1中，該序列包括5′和3′非編碼序列。本發明優選的DNA包含SEQIDNO1的20-298位核苷酸，該核苷酸組成MDC的編碼序列。MDC蛋白在氨基端包含推測的24個胺基酸的信號序列。本發明優選的DNA組成SEQIDNO192-298的核苷酸，這些核苷酸包含推測的成熟(分泌)MDC蛋白的編碼序列，沒有信號序列。趨化因子MDC的胺基酸序列列於SEQIDNO2中。除上述的多核苷酸外，本發明優選的多核苷酸包括能編碼列於SEQIDNO2中的胺基酸序列，它與前幾節描述的僅由於眾所周知的遺傳密碼簡併的多核苷酸不同。同樣地，因為SEQIDNO2的24個胺基酸(-24至-1位)組成能裂解產生成熟的MDC趨化因子的公認的信號肽，優選的多核苷酸包括編碼SEQIDNO2的1-69胺基酸的部分。這樣，優選的多核苷酸是純化的多核苷酸，它編碼的多肽含包括SEQIDNO21-69位胺基酸的胺基酸序列。應用本發明的多核苷酸時可用作雜交探針，識別和分離編碼人MDC的基因組DNA，該基因可能含C-C趨化因子基因特有的三個外顯子/二個內含子結構(貝巴格歐利尼等，同上)；識別和分離與MDC同源的編碼非人蛋白的DNA序列；識別與MDC相似的人和非人的趨化因子，以及識別表達MDC的細胞和該蛋白表達的條件。本發明的雜交探針也有診斷用途，如篩選諸如結腸組織的人組織的炎症。更具體而言，使用MDC多核苷酸雜交探針的雜交研究能區別節段性結腸炎患者的結腸組織(MDC雜交檢測上皮，固有層，佩耶(payer’s)斑和平滑肌)與正常人結腸組織(上述背景下不會雜交)。一般來說，本發明的MDCcDNA至少有約14個最好約18個核苷酸的連續部分，對用作本發明的雜交探針是有用的。這樣，在一實施方案中，本發明包括的DNA含SEQIDNO1或相應的非編碼互補鏈的核苷酸序列的連續部分，該部分至少含18個核苷酸，該DNA能在嚴謹條件下與人MDC基因的編碼或非編碼鏈雜交。本發明的雜交探針作診斷用途時，更為可取的是表現為對MDC基因序列的雜交專一性。這樣，在優選的實施方案中，本發明雜交探針DNAs在嚴謹條件下不會與其它的人趨化因子基因雜交(如，MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因等)。另一方面，本發明提供純化的多核苷酸，其在嚴格條件下能與SEQIDNO1的DNA的非編碼鏈雜交。同樣地，本發明提供的純化的多核苷酸，要不是遺傳密碼的冗佘性(redundancy)，在嚴格條件下能與SEQIDNO1的DNA的非編碼鏈雜交。示範性的嚴格雜交條件如下在5×SSC，20mM磷酸鈉，pH6.8，50％甲醯胺中，42℃雜交，在0.2×SSC中42℃下清洗。本領域的技術人員懂得，依據被雜交序列的長度和GC核苷酸鹼基的含量變化實驗條件，是合乎需要的，有確定這些變化的公式[如見，聖姆布魯克等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989).]。另一方面，本發明包括摻入了本發明DNA的質粒和病毒DNA載體，包括上述或本文其它地方描述的DNA的任一種。優選的載體包括表達載體，在表達載體中，摻入的編碼MDC的cDNA可操作地與內源或異源的表達控制序列相連。以上表達載體可進一步包括操作性地連接編碼MDCDNA序列的編碼多肽的DNA序列，這種載體可表達產生含重要的MDC多肽的融合蛋白。另一方面，本發明包括用本發明的DNA或載體穩定轉染或轉化原核或真核宿主細胞。在優選的宿主細胞中，能表達由本發明的DNA或載體所編碼的成熟的MDC多肽。本發明的DNA，載體和宿主細胞，對如本發明的MDC多肽的大量重組生產是有用的。這些方法也在本發明之中。例如，本發明包括一種生產MDC的方法，其中本發明的宿主細胞在合適的營養培養基中生長，從細胞或培養基中分離MDC蛋白。再一方面，本發明包括純化和分離MDC多肽的方法。優選肽是純化的趨化因子多肽，具有包含SEQIDNO2的1-69位胺基酸的胺基酸序列。本發明的多肽可從天然的材料中純化，但優選，應用本發明的DNAs，載體和/或宿主，用重組方法生產，或化學合成。本發明純化的多肽，根據所選的宿主細胞、重組生產的方法、分離方法、處理過程、貯存緩衝液等情況，可以是糖基化或非糖基化的，水溶或不溶，氧化的，還原的等。此外，本發明的一個方面包括MDC多肽類似物，其中是從本發明MDC多肽的一個或多外胺基酸殘基添加，缺失或取代而成，類似物保留C-C趨化因子特有的一個或多個生物學活性。MDC的小有利於以上多肽類似物的化學合成，用本文描述的許多活性測定的方法，篩選具MDC的生物活性(如誘導巨噬細胞趨化性的能力，抑制單核細胞趨化性的能力)的類似物。替代方法是這些多肽類似物可用熟知的方法重組產生，如對本發明編碼MDC的DNA定點突變。有關的方面，本發明包括從本發明的MDC多肽的一或更多個胺基酸殘基被添加、缺失或取代的多肽類似物，該類似物缺乏C-C趨化因子或MDC的生物學活性，但能競爭性或非競爭性地抑制MDC多肽和C-C趨化因子受體的結合。這樣的多肽是有用的，如用於調節宿主內源性MDC的生物學活性，也可用於上述醫學影像方法。MDC的某些特殊的類似物可設計作調節MDC的結構、分子間結合特性和生物學活性。例如，可特別地設計缺失氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)的類似物(截短)改變MDC的結構和功能。另外，可特別地設計下列單胺基酸改變體(單獨或結合)(1)非鹼性胺基酸分別替換SEQIDNO2的24和27位的鹼性精氨酸和/或賴氨酸；(2)帶電荷的或極性胺基酸(如絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或半胱氨酸)替換SEQIDNO230位的酪氨酸，替換SEQDNO2的59位的色氨酸，和/或SEQIDNO260位的纈氨酸；和(3)用鹼性或不帶電荷的小胺基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替換SEQIDNO250位的穀氨酸。具有這些胺基酸改變的特殊類似物包括在下面的通式中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的胺基酸可選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的胺基酸可獨自地選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的胺基酸可獨自地選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸；其中50位的胺基酸可獨自地選自穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位胺基酸可獨自地選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸；其中60位胺基酸可獨自地選自纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸。這些MDC多肽類似物可特別地設計以調節MDC對趨化因子受體和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、紅細胞趨化因子受體)的結合特性，這些特性在MDC呈遞給其受體時認為是重要的。在一優選的實施方案中，本發明的MDC多肽類似物包括SEQIDNO25的1-69的胺基酸。已合成的下述另外的類似物，也成為本發明的方面(a)包含鑑定為SEQIDNO30的1-70位的胺基酸序列的多肽；(b)包含鑑定為SEQIDNO2的9-69位的胺基酸序列的多肽；(c)包含鑑定為SEQIDNO31的1-69位的胺基酸序列的多肽；(d)包含鑑定為SEQIDNO32的1-69位的胺基酸序列的多肽。相關的方面是本發明提供純化和分離編碼以上MDC多肽類似物的多核苷酸的方法，這些多核苷酸對如重組方法生產MDC多肽類似物；把以上多核苷酸與質粒和病毒載體連接，用該DNA或載體穩定地轉化原核和真核宿主細胞是有用的。另一方面本發明包括能和本發明的MDC多肽和多肽類似物起免疫反應的抗體物質(例如，單克隆和多克隆抗體，單鏈抗體，嵌合或人源化抗體等)。以上抗體對諸如純化本發明的多肽，如用熟知的ELISA技術定量測定宿主內源性的MDC和調節MDC對其受體的結合是有用的。本發明進而包括生產本發明抗體物質的雜交瘤細胞系。本發明重組的MDC多肽和多肽類似物象抗體一樣可用於結合反應，以識別表達MDC受體的細胞和用標準的克隆表達技術，分離編碼受體的多核苷酸。這些MDC多肽，MDC多肽類似物和MDC受體多肽對MDC趨化因子活性的調節，多肽和化學性的(如小分子)MDC激動劑和拮抗劑的鑑別是有用的。本發明的另一方面是有關本發明的MDC多肽和多肽類似物的藥學應用。例如，已表明MDC能調節白細胞趨化性。特別地，MDC能誘導巨噬細胞趨化性和抑制單核細胞趨化性。因而一方面本發明包括調節(如上調或下調)哺乳類宿主的白細胞趨化性的方法，含給哺乳類宿主服用本發明的MDC多肽和多肽類似物的步驟、其中MDC多肽或MDC多肽類似物能調節宿主白細胞的趨化性。在優選的方法中，白細胞是單核細胞和/或巨噬細胞。例如，服用實驗確定的MDC劑量(如在藥學可接受的載體中)，以誘導巨噬細胞趨化性或抑制單核細胞趨化性，而使用抑制性的MDC多肽類似物獲得相反的效果。另一方面，本發明提供減輕病人炎性狀態的方法，該狀態的特徵至少是(i)單核細胞向所述的病人炎症位點趨化或(ii)成纖維細胞增殖之一，該方法包括給病人服用MDC治療有效量的步驟。在一實施方案中，MDC治療有效量是能抑制單核細胞趨化性的量。在另一實施方案中，MDC治療有效量是能抑制成纖維細胞增殖的量。這些治療有效量是用公認技術的劑量反應分析實驗確定的。作為附加的內容，本發明提供含本發明MDC多肽或多肽類似物在藥學可接受的載體中的藥學組合物。同樣地，本發明有相關的根據本發明作如炎性疾病狀態的疾病狀態治療的組合物應用方法。在一實施方案中，炎性疾病狀態的特徵是單核細胞向病態的病人中的炎性位點趨化。在另一實施方案中，炎性疾病狀態的特徵是具病態病人的成纖維細胞增殖。前述的內容和大量的附加內容從下列附圖和詳述中更為明顯。附圖簡述圖1是人MDC(SEQIDNO2)的胺基酸序列和其他以前已描述的人C-C趨化因子的胺基酸序列比較，這些趨化因子是MCP-3[凡戴姆等，實驗醫學雜誌，17659(1992)](SEQIDNO18)；MCP-1[馬特蘇雪瑪等，實驗醫學雜誌，1691485(1989)](SEQIDNO19)；MCP-2(成熟態)[凡戴姆等，同前，常等，國際免疫學，1388(1989)](SEQIDNO20)；RANTES[施查爾等，免疫學雜誌，1411018(1988)](SEQIDNO21)；MIP-1β[布朗等，免疫學雜誌，142679(1989)](SEQIDNO22)；MIP-1α[內高等，分子細胞生物學，103646(1990)](SEQIDNO23)；和I-309[米勒等，免疫學雜誌，1432907(1989)](SEQIDNO24)。斜槓「/」表示公認的信號肽被切割的位點。插入破折號使序列美觀整齊。圖2是描述在一趨化性分析中，增加MDC濃度對人單核細胞遷移的趨化影響圖(用螢光單位計量)。實心圓圈表示來自THP-1細胞系的單核細胞的應答。空心菱形表示對陽性對照，酵母聚糖活化血清(2AS)的應答。圖3是描述增加MDC濃度對人多形核(pmn)白細胞遷移的趨化影響圖(用螢光單位)計量。實心圓圈表示對MDC的應答，空心菱形表示對陽性對照IL-8的應答。圖4是描述增加MDC濃度對巨噬細胞和單核細胞遷移的趨化影響圖(用螢光單位計量)。實心圓圈表示來自THP-1細胞系的巨噬細胞對MDC的應答。空心圓表示來自THP-1細胞系的單核細胞對MDC的應答。圖5是描述增加MDC濃度對豚鼠腹膜巨噬細胞遷移的趨化影響圖(用螢光單位計量)。實心圓圈表示巨噬細胞對MDC的應答。空心三角形表示對陽性對照的酵母聚糖活化血清(ZAS)的應答。圖6是描述增加MDC濃度，對由MCP-1誘導的THP-1單核細胞遷移的抑制趨化性影響圖(用螢光單位計量)。實心圓圈表示MDC抑制趨化的效果，趨化性已被MCP-1誘導出來。空心圓圈表示在對照實驗中，僅用基本培養基(RPMI加0.2％BSA(RBSA)，無MCP-1)時，MDC抑制趨化的效果。X軸上的零點相應於沒有任何MDC時，細胞對MCP-1和RBSA的應答。圖7是描述增加MDC濃度對成纖維細胞增殖的影響圖(用每分計數(cpm)計量)。實心圓圈表示用純化的從CHO細胞重組生產(參考實施例10F)的MDC的增殖反應。空心圓圈表示用化學合成的MDC(參考實施例11)的反應。圖8是用圖表示哺乳類表達載體pDC1的結構。發明詳述用下列的實施例闡述本發明，有關的人cDNA命名為MDCcDNA，所編碼的新的C-C趨化因子命名為MDC(為「來源自巨噬細胞的趨化因子」)。更為詳細地，實施例1描述從人巨噬細胞cDNA文庫中分離部分MDCcDNA。實施例2描述用從實施例1來的cDNA作探針，從cDNA文庫中分離另外的cDNA，這些cDNA之一含全長的MDC編碼序列。另外，實施例2提出複合的MDCcDNA核苷酸序列和由此編碼趨化因子(MDC)的推導性胺基酸序列的特徵。在實施例3中，描述的實驗顯示在不同的人組織中MDC基因表達的水平。觀察到最強的MDC基因表達在胸腺，而可檢出的最弱表達在脾和肺組織。實施例4更為詳細地描述了在單核細胞成熟為巨噬細胞過程中，和誘導HL60細胞分化成巨噬細胞樣的細胞類型時MDC基因的表達。由於在實施例3中MDC基因表達在胸腺和脾中檢出，原位雜交研究可進一步對MDC基因在這些組織中表達進行定位。另外，原位雜交顯示了MDC基因高表達在腸組織和節段性結腸炎之間的相關性。這些原位雜交實驗在實施例5中描述。實施例6描述MDC作為GST融合蛋白在原核細胞中的重組生產，和融合蛋白的切割以及重組MDC純化的方法。實施例7描述用於重組MDC蛋白表達的替代性DNA構體的構建方法和描述用這種構體轉化細菌宿主生產MDC的方法。實施例8提供實驗方案對在實施例7中描述生產的重組MDC進行純化。實施例9和10提供實驗方案分別在酵母和哺乳類細胞中進行MDC重組生產。此外，實施例10提供純化重組MDC的方案。實施例11描述用多肽合成方法生產MDC和MDC多肽類似物。實施例12-17提供方案測定MDC生物學活性。例如，實施例12提供MDC對嗜鹼細胞，肥大細胞和嗜酸性細胞影響的測定法。實施例13描述MDC對單核細胞/巨噬細胞，中性粒細胞和粒細胞的化學引誘和細胞活化特性的測定法。實施例14-17提供體內測定MDC生物學活性的案方。實施例14提供MDC抑制腫瘤生長的測定法。實施例15和16提供方案測定分別經腹腔和皮下注射的MDC活性。實施例18提供方案產生和MDC起特異免疫反應的單克隆抗體。剩下的實施例提供另外的MDC活性測定法。例如，實施例19提供鈣流測定法，以測定MDC誘導細胞活化的能力。實施例20提供方法測定MDC抗HIV增殖的影響。實施例21說明MDC抗成纖維細胞增殖的影響。實施例22提供體外MDC對其他細胞類型增殖的影響的方法。實施例23提供體內方法測定MDC抗成纖維細胞增殖的影響。實施例24提供方法識別MDC調節因子。實施例1部分C-C趨化因子cDNA的分離新的C-C趨化因子的部分cDNA按下法分離。PolyA+RNA從來源自外周血單核細胞的巨噬細胞中收穫。雙鏈，平末端cDNA用體外遺傳拷貝試劑盒(聖地牙哥，CA)產生，在插入哺乳表達載體pRc/CMV(Invitrogen)前，把BstXI修飾子連接到cDNA上[見特喬爾克等，自然，374549-552(1995)]。藍XL1大腸桿菌(stratagene，LaJolla，CA)用質粒cDNA經電穿孔方法轉化，植到含100μg/ml羧苄青黴素的986個平板上(約每板3000個轉化體)。37℃生長過夜後，每板的細菌刮下形成986個細菌庫。用大量微製備DNA純化系統(普洛麥格，麥迪遜，WI)，根據廠家的說明書，把質粒DNA從986個細菌庫中逐個分離。純化的質粒DNA庫按下法進一步鑑定，用於分離單個的DNA克隆來自各個庫的質粒DNA用於轉化藍XL1大腸桿菌細胞，植板，按上法生長過夜。隨機挑選各個轉化體，在添加羧苄青黴素的3mlLB培養基中生長過夜，質粒純化用Wizard微製備純化系統(普洛麥格)，作如下改動250mg硅藻土(西格瑪化學公司，聖路易斯，MO)加到廠家提供的DNA結合樹脂中。純化的質粒DNA在自動測序儀型號373(應用生物系統公司，福斯特城，CA)上測序，所用的引物是JHSP65′GACACTATAGAATAGGGC3′(SEQIDNO3)該引物能與質粒載體pRc/CMV載體鄰近克隆位點的部分雜交。各個cDNAs的核苷酸和推導出的胺基酸序列與核苷酸和肽資料庫比較，以確定編碼蛋白的哪一個克隆與已知的炎性介導分子相似。序列比較於1994年12月14日由布賴斯特國家中心生物技術信息網絡服務部(e-mail「[email protected]」)進行，用艾爾茲邱爾等，分子生物學雜誌，215403-410(1990)的排列算法。序列分析顯示所分離的巨噬細胞cDNA的一個克隆的一部分，稱為pMP390，含基因序列和前已確認的趨化因子基因，包括人MCP-3基因和大鼠MIP-1β基因，有約60-70％的同一性。pMP390的2.85kbcDNA插入片段亞克隆到pBluescriptSK-載體中(Stratagene，LaJollaCA)，從便完全測序。從多聚-A尾巴開始的整套缺失體，用普洛麥格的去-鹼基系統(promega′sErase-a-BaseSystem)(MadisonWI)消化形成。缺失質粒重新環化。克隆進大腸桿菌中，純化，測序用如下表示的M13，T3.1和T7.1引物(SEQIDNO4)M135′GTAAAACGACGGCCAGT3′(SEQIDNO5)T3.15′AATTAACCCTCACTAAAGGG3′(SEQIDNO6)T.7.15′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′這pMP390cDNA全序列相當於SEQIDNO1的73-2923位的核苷酸部分(相當於SEQIDNO2-6-69位的推導胺基酸序列)。與資料庫序列進行最原始比較的序列相當於SEQIDNO173-610位核苷酸。實施例2含完整MDC編碼序列的另外的cDNA克隆的分離用實施例1分離的pMP390cDNA克隆，從同樣的人巨噬細胞cDNA文庫中分離另外的cDNA克隆，這些另外的cDNA含另外的5′序列，能編碼完整的來自巨噬細胞的趨化因子的胺基酸序列。首先，從來自巨噬細胞cDNA文庫(實施例1)的986個質粒DNA庫中，取40個用PCR篩選，以鑑別感興趣的含另外cDNA克隆的庫。根據實施例1獲得的pMP390cDNA序列，構建合成寡核苷酸PCR引物390-1F(稱作SEQIDNO7)和390-2R(SEQIDNO8)，以擴增部分由pMP390編碼的趨化因子基因的211個鹼基對序列390-1F5′TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG390-2R5′CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA3′引物390-1F相應於SEQIDNO1的91-116位核苷酸，前有限制內切酶XbaI的識別位點，4個附加的鹼基便於該酶切割；引物390-2R與SEQIDNO1的301-279位核苷酸互補，加有酶BamHI的識別位點，4個附加的鹼基位於側翼。如XbaI和BamHI切點便於獲得片段的克隆。對每一被選的質粒庫用50μlPCR反應混合液，含0.2μg質粒DNA；1.5mM氯化鎂；50mM氯化鉀；10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8.4；0.2mM每一種dNTP；每一引物10μg/ml和0.5μlTaq聚合酶(5U/μl)(伯林格曼海姆生物化學公司(BMB)，Indianapolis，IN)。反應在94℃溫育4分鐘，然後94℃變性15秒，60℃退火15秒和72℃延伸30秒，循環30次。PCR反應產物通過2％瓊脂糖凝膠(生命技術公司，Gaithersburg，MD)，在0.5XTBE緩中液中電泳[聖姆布魯克等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)]，用溴化乙錠觀察。篩選的40個質粒庫中，6個產生一條相當於預期的230個鹼基對的PCR片段的強帶(預期的PCR片段包括趨化因子基因序列211bp，及側翼的XbaI和BamHI限制性位點)，表明存在一或更多個含與pMP390有關的基因序列的質粒。為分離以上相關的克隆，從6個陽性的質粒庫中選三個等份電穿孔導入大腸桿菌XL-IBlue細胞中，細胞鋪於平板上，按實施例1描述的方法生長過夜。克隆轉移到硝酸纖維素膜上，按下列標準步驟準備雜交(聖姆布魯克等，同前)。篩選膜的放射性標記的MDC探針按下法製備含MDCcDNA的2.85kbDNA片段從pMP390中用限制酶消化切得，在TAE緩衝液中用瓊脂糖凝膠電泳純化(聖姆布魯克等，同前)電洗脫，苯酚和氯仿抽提，乙醇沉澱。純化片段(250ng)用隨機引物DNA標記試劑盒(BMB)，按廠家推薦的方法標記。標記探針過G-50快速旋(QuickSpin)轉柱(BMB)純化。膜和每分鐘計數(cpm)為5×107的探針，在40-50ml的溶液中，42℃溫育16小時，溶液含50％甲醯胺，5×Denhardt’s溶液，5×SSC(1倍SSC為0.15M氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉，pH6.5和0.1mg/ml剪切的鮭魚精子DNA(西格瑪，聖路易斯MO)。雜交後，膜在0.2×的SSC中洗三次，在0.2％SDS中55℃洗30分鐘。為顯影雜交結果，洗過的膜在kodak(羅徹斯特，NK)XAR-5自放射顯影片上，用LighteningPlus增感屏(DuPont，DE)-80℃曝光過夜。PCR用於篩選50個雜交細菌克隆。50個含3901F和390-2R引物的PCR反應按上述方法建立，模板DNA用從來自50個克隆的細菌代替。開始時，反應液94℃變性8分鐘。然後，按上法進行35個擴增循環。一個單克隆產生預期的230個鹼基對的產物；含這克隆的質粒命名為pMP390-12。感興趣的另外MDCcDNA，用特異對pMP390插入片段的5′端的探針，克隆雜交識別。探針按下法製備含pMP390cDNA(SEQIDNO1的91-298位核苷酸)編碼區的211個鹼基和鄰近3′非編碼區的163個鹼基的DNA片段，按上述方法用PCR產生，用60ng的pMP390cDNA作模板和合成的寡核苷酸390-1F(SEQIDNO7)和390-4R(SEQIDNO9)作引物390-4R5′AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG3′引物390-4R含BamHI限制性位點及互補於SEQIDNO1461-442位的核苷酸的序列。PCR產物按上述方法電泳純化，50ng純化片段用隨機引物DNA標記製劑盒(BMB)標記，過G-50快速旋轉柱(BMB)純化。膜按上述方法用該片段探測，在0.4×SSC和0.2％SDS中48℃，洗30分鐘，共三次。放射自顯影按上述方法進行。5個雜交克隆被檢出，命名為MP390A，MP390B，MP390C，MP390D和MP390E。這5個克隆和一個用pMP390-12轉化的克隆被分離和繁殖，用Wizard微量製備DNA純化系統(普洛麥格，麥迪遜，WI)，附加按實施例1所述的硅藻土進行質粒純化。質粒DNA在應用生物系統型號373的自動測序儀上測序，用合成引物390-3R(SEQIDNO10)390-3R5′AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC3′引物390-3R與SEQIDNO1的266-246鹼基互補，含一個HindIII限制內切酶切點和在5′端4個附加的鹼基對。設計該引物能與引物390-2R上遊和SEQIDNO1216位核苷酸下遊退火，216位點在能編碼本發明的趨化因子的基因組DNA中有一內含子[見戴諾夫等，免疫學雜誌，1521182-1189(1994)]。六個克隆中，pMP390-12和pMP390B克隆含最大的附加5′編碼序列，每一克隆在以前所獲的cDNA克隆pMP390的序列上遊額外延長72個核苷酸。複合的DNA序列，在此命名為MDCcDNA，由pMP390和pMP390-12cDNA序列組合後產生。趨化因子MDC的這個2923個鹼基對的複合cDNA序列和推定的胺基酸序列，分別列於SEQIDNOs1和2中。推定的胺基酸序列和已知的趨化因子序列人工比較顯示MDCcDNA序列編碼一種新型的C-C趨化因子，長為93個胺基酸，和其它C-C趨化因子享有28-34％的胺基酸同一性(圖1和表1)重要的是，具趨化因子特徵的四個半胱氨酸殘基在MDC中是保守的。五個附加的殘基在圖1顯示的8個序列中也完全保守。93個胺基酸的MDC序列的前24個胺基酸是明顯疏水的，與決定信號切割的Von.Heijne規則[核苷酸研究，144683-90(1986)]相一致。這些特徵和圖1的多肽比較集中表明MDCcDNA編碼的24個胺基酸的信號肽能被切割，產生在SEQIDNO21位以甘氨酸殘基開始的MDC成熟態分子。該預測按以下實施例10描述的，在哺乳動物細胞重組產生的MDC蛋白的直接測序所證實。MDC複合的cDNA序列表明在SEQIDNO1序列上預定為甲硫氨酸密碼子上遊的延伸了19個核苷酸，和終止密碼子下遊延伸了2.6kb。實施例3MDC基因在人組織中表達的確定進行RNA印跡分析確定MDC基因表達的組織。實施例2中提到的放射性標記的pMP3905′片段(相當於編碼公認的MDC成熟態的MDCcDNA區段，外加相連的3′非編碼區的163個鹼基)，用作探針檢測含來自不同正常人組織的RNA的多組織RNA印跡(Clontech，PaloAlto，CA)。使用前將探針煮沸變性，根據廠家的說明書進行雜交。用2個增感屏-80℃曝光5天進行放射自顯影。觀察到最大的MDC基因表達是胸腺，在脾和肺組織有可檢測的較弱表達。來自小腸組織的MDC表達甚至更低，在腦，結腸、心臟、腎、肝、卵巢、胰腺、胎盤、前列腺、骨骼肌、睪丸或外周血白細胞，未檢測到表達。實施例4巨噬細胞成熟過程中的MDC基因表達因為編碼MDC的cDNAs從人巨噬細胞cDNA文庫中分離、所以要檢查單核細胞分化成巨噬細胞過程中MDC基因表達。A.來自單個供體的人單核細胞培養在系列組織培養板中，0、2、4或6天後從一板中收集細胞。一般參見埃爾斯特等，免疫學雜誌，1401618-1624；特喬爾克等，同上。在這些條件下，4-6天單核細胞分化成巨噬細胞[斯坦福萊尼等，生物化學雜誌，2659682-9687(1990)]。從每一時間點收集的細胞中分離RNA(每道10μg)，準備RNA印跡，用上述放射性標記的pMP390片段探查。來自新鮮分離的單核細胞的RNA中，未檢測到雜交信號，而培養6天後分化成巨噬細胞的細胞，產生非常強的信號。培養4天的細胞產生較弱的信號，而培養2天的細胞產生的信號，只有膜被延長曝光時間後才可見。B.為進一步證實在分化的人巨噬細胞中的MDC的表達，培養上清液用按以下實施例18所述產生的抗MDC的單克隆抗體western印跡分析。幾塊板的人巨噬細胞在巨噬細胞集落刺激因子(0.5ng/ml，RDSystem，Minneapolis，Minnesota)存在下，生長在塑料上分化8天。移去分化的巨噬細胞培養基，重加同樣的培養基或含低密度脂蛋白(LDL，西格瑪)，氧化的LDL(按馬爾頓等，生物化學雜誌，26613901(1991)的方法，溫育在5μMCuSO4·5H2O中氧化)或地塞米松(6nM，西格瑪化學公司)。每一處理進行三天後，取培養液，加鹽酸調pH為6.8，過肝素-葡聚糖CL-6B柱(發瑪西亞，Piscataway，NJ)。用含0.2M氯化鈉的20mM三羥甲基氨基甲烷，pH8洗柱，含0.6M氯化鈉的20mM三羥甲基氨基甲烷pH8的溶液洗脫。洗脫的物質在18％的丙烯醯胺SDS-PAGE膠(NOVEX)中分級分離，電印跡到PVDF膜上(Millipore，BedfordMA)。用標準技術(聖姆布魯克等)，膜被封閉，清洗和與抗MDC的單克隆抗體反應。在每一個分析的培養液中，MDC蛋白在約0.5μg/ml濃度下被檢出，由此確認在分化的人巨噬細胞中MDC的表達。MDC的表達也在人上皮細胞系中做了分析。結腸上皮T84細胞系(ATCC#CCL-248)培養在DMEM/F12培養基(GIBCO，GaithersburgMD)中，肺上皮A549細胞系(ATCC#CCL-185)培養在F12培養基中。篩選細胞中存在的MDCmRNA和培養基中的MDC蛋白，按上述用於巨噬細胞的方法進行。在這些細胞系中任一方法均未檢出MDC的表達。此外，T84細胞系的試樣用腫瘤壞死因子α(5ng/ml，PeproTech，RockyHill，NewJersey)，腫瘤壞死因子-β(1ng/ml，RDSystems)，或幹擾素-γ(200U/ml，PeproTech)，單獨或與100ng/ml的重組MDC(來自CHO轉染細胞，見實施例10)合用，處理一天。A549細胞系試樣用50ng/mlPMA(西格瑪化學公司)處理0、1、3、5或7天。當用上述RNA印跡法篩選時，對T84或A549細胞的這些處理沒有一個能檢出MDCmRNA的表達。C.MDC基因在巨噬細胞中表達的進一步檢測用1％DMSO(西格瑪化學公司)或50ng/mlPMA(西格瑪)處理人細胞系HL60進行。用DMSO處理誘導HL60細胞分化成粒細胞樣表型，而PMA誘導HL60分化成巨噬細胞譜系[帕魯塞等，血液，58836-843(1981)]。RNA從未處理細胞或用DMSO或PMA處理一天或三天的細胞中分離，電泳(每道10μg)和印跡。RNA的Northern印跡探測用實施例3所述的放射性標記的pMP3905′片段。PMA處理三天後，HL60細胞明顯地表達MDCmRNA，儘管表達水平明顯地比培養6天後的巨噬細胞表達水平低(見上)。處理一天後或未處理的細胞未見到表達。此外，用DMSO處理一或三天，沒有可檢測的MDC表達被誘導出來。實施例5原位雜交因為MDC基因表達在胸腺和脾中檢測到，進行原位雜交以定位這些組織的信息來源。此外，原位雜交用於確定MDC基因表達與節段性迴腸炎有關的腸組織炎症相關性。為產生放射性標記的原位雜交探針，含MDC編碼區的DNA片段(SEQIDNO1的91-301位核苷酸)亞克隆到pBluescriptSK-載體中。使用T3和T7RNA多聚酶(BMB)，按廠家的說明，把35S-UTP摻入到互補於基因每條鏈的RNA轉錄本中。正常人脾、胸腺和結腸組織樣品，以及節段性迴腸炎患者的結腸組織樣品，從國家疾病研究交換處(Philadelphia，PA)獲取。組織供體如下正常胸腺19歲男性高加索人，死於機動車禍，屍檢時取組織；正常脾51歲黑人男性，死於腦出血，屍檢時取組織；正常結腸黑人女性，手術時取組織；節段性迴腸炎的結腸1號女性，種族不詳，46歲，潰瘍性結腸炎患者，手術時取組織；節段性迴腸炎的結腸2號18歲男性，種族不詳，節段性迴腸炎，手術時取組織。除了前面的分析外，從一病人做扁桃體切除術時切取的炎性扁桃體組織，用相當於SEQIDNO1的677-1042位的核苷酸的MDCcDNA非編碼部分探查。這部分經MDCcDNA克隆的PCR擴增產生，所用的引物為390-7F(SEQIDNO26)和390-8R(SEQIDNO27)390-7F5′-TATTGGATCGGTTCTAGCTCCGTGTTCTCC3′390-8R5′-CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC3′片段亞克隆到pBluescriptSK-載體中，以產生上述的RNA探針。前段所述的組織樣品按下法製備作原位雜交。組織樣品包埋在「OCT」化合物中(Miles，Inc.，Elkhart，IN)，用恆冷切片機(cryostat)2800E(Leica)切6微米厚的切片。組織切片粘附在用Vectabond(Vector實驗室，伯林格姆，CA)包被的載片上，固定在4％多聚甲醛中4℃20分，酒精脫水，用70％甲醯胺和2×SSC70℃變性。雜交反應用放射性標記的合適探針的有義或反義鏈，載片溫育在雜交水溶液中55℃16小時進行，水溶液含50％甲醯胺，0.3M氯化鈉，20mM三羥甲基氨基甲烷pH7.5，10％硫酸葡聚糖，1×Denhardt’s溶液，100nM＝硫蘇糖醇和5mMEDTA。雜交後，載片在4×SSC和10mMDTT中室溫溫育一小時。然後在2×SSC中室溫；1×SSC60℃；最後在0.1×SSC中室溫洗載片。樣品用乙醇脫水，然後塗KodakNTB2攝影乳膠，空氣乾燥2小時，4℃曝光11天，顯影，用蘇木精/伊紅復染。觀察反義鏈(任一探針)的雜交反應顯示MDC基因在正常人胸腺的整個皮質細胞中表達，濾泡有弱雜交信號。MDC在胸腺中表達可能顯示MDC有T淋巴細胞發育作用。在正常人脾中表達定位在紅髓細胞中，而很少的信號在白髓中檢測到。在發炎的扁桃體中高表達定位在上皮區，儘管炎性細胞似乎浸潤了整個組織樣品。來自節段性迴腸炎患者的結腸樣品在上皮，固有層，佩耶斑和平滑肌細胞中顯示雜交反應。相反，正常人結腸在上述細胞中未顯示雜交反應。在節段性迴腸炎患者的結腸觀察到的MDC表達類型與巨噬細胞特異基因，血小板活化因子乙醯解酶(PAF-AH)[特傑爾克等，同前]的表達緊密相關。該結果，結合實施例4顯示的數據，表明在病原性炎症中巨噬細胞在體內表達MDCcDNA。此外，在節段性迴腸炎病的結腸組織樣品的MDC鑑定顯示MDC水平(如在病人血液，糞便樣品，和/或腸缺損中)與病人的病態或臨床預後有診斷相關性。實施例6重組MDC的生產為產生重組MDC蛋白，編碼公認是蛋白成熟態的序列用PCR擴增，克隆到pGEX-3X(發瑪西亞，Piscataway，NJ)載體中。設計pGEX載體能產生包括由載體編碼的穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)和由插入載體克隆位點的DNA片段編碼的蛋白的-種融合蛋白。實施例2描述的標準PCR條件再次用於擴增MDCcDNA片段，用引物390-2R和390-FX2(SEQIDNO11)5′TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-FX2含BamHI限制性位點，接著是編碼凝血酶切割位點的序列[常等，歐洲生物化學雜誌，151217(1985)]，接著是SEQIDNO1的92-115鹼基。凝血酶切割位點如下亮氨酸-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸、其中甘氨酸和脯氨酸MDC成熟態的前二個殘基。用凝血酶處理重組融合蛋白預期切割融合蛋白的精氨酸-甘氨酸鍵，從GST融合蛋白中釋放成熟的趨化因子。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳純化，用BamHI核酸內切酶消化，克隆到pGEX-3X的BamHI位點上。該pGEX-3X/MDC構建體轉化到大腸桿菌XL-1Blue細胞(Stratagene，LaJollaCA)中，分離各個轉化體，培養。來自不同轉化體的質粒DNA被純化，部分用自動測序儀測序，所用的引物GEX5(SEQIDNO12)，能與pGEX-3X載體近BamHI克隆位點雜交GEX55′GAAATCCAGCAAGTATATAGCA3′用該引物獲得的序列證實存在以合適方向插入的所需MDC片段。GST-MDC融合蛋白的誘導獲取是把轉化的XL-1Blue細菌在LB培養基中(添加羧苄青黴素)在37℃下培養，至波長600nM為0.4的合適密度，接著進一步在0.25-1mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(西格瑪化學公司，聖路易斯MO)下溫育4小時。在細菌中以不溶性的包含體產生的融合蛋白，按下法純化。細胞離心收穫；用0.15M氯化鈉，10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8，1mMEDTA清洗；用0.1mg/ml溶菌酶(西格瑪化學公司)室溫處理15分鐘。超聲澄清裂解產物，細胞碎片12,000xg離心10分鐘形成沉澱。含融合蛋白的沉澱重懸在50mM三羥甲基氨基甲烷，pH8，和10mMEDTA中，鋪展在50％甘油上，6000xg離心30分鐘。沉澱重懸在無Mg++和Ca++的標準磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中。融合蛋白仍處於不溶狀態，約為蛋白質量的80-90％，在變性SDS-聚丙烯醯胺凝膠中，以相對分子量33KD遷移。按考馬斯染色判斷蛋白產量，約每升大腸桿菌培養物100mg。融合蛋白受凝血酶消化，從成熟的MDC蛋白切割GST。消化液(0.5mlPBS中，20-40μg融合蛋白，20-30單位凝血酶(4000U/mg西格瑪))室溫溫育16-48小時，上到變性的SDS-PAGE膠中分離反應產物。將凝膠浸在0.4M氯化鉀中顯現GST和MDC蛋白帶，分別以約26KD和7KD的片段遷移。7KDSDS-PAGE片段的特性用部分胺基酸序列分析證實。首先，蛋白從膠上切下，電洗脫到25mM的三羥甲基氨基甲烷鹼和20mM甘氨酸中，收集到ProSpin柱(應用生物系統，福斯特城，CA)中的PVDF膜上。上樣進行自動序列分析(應用生物系統型號473A，福斯特城，CA)，結果產生15個殘基的序列信息，該序列準確地對應於MDC預定成熟態的預期N端(SEQIDNO2，胺基酸殘基1-15)。實施例7細菌MDC表達載體的構建編碼預定成熟MDC蛋白的MDCcDNA部分克隆到含阿拉伯糖啟動子和pelB前導序列的質粒中[見貝特等，科學，2401041-43(1988)]。更具體地說，MDCcDNA按實施例2所述的PCR法擴增，用約0.1μgpMP390-12作模板和合成的寡核苷酸引物390-2R和390-Pel(SEQIDNO13)390-Pel5′ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-Pel含一個NcoI限制性位點，接著是二個胞嘧啶殘基，然後是SEQIDNO1的92-115位鹼基。預期的232bp的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳純化，用NcoI和BamHI消化，和阿拉伯糖操縱子及pelB前導序列(貝特等，同前)一起克隆到pUC19載體(新英格蘭生物實驗室，倍維菜，MA)中。得到的構建體，命名為P2-390，編碼pelB前導序列(由載體編碼)的融合部分為成熟的MDC蛋白。這構建體的序列用自動序列測定法證實，用引物Ara1(SEQDNO28)和Ara2(SEQIDNO29)，引物能與載體克隆位點鄰近部分退火。Ara15′GCGACTCTCTACTGTTTCTC3′Ara25′-CACAGGAAACAGCTATGACC3′用標準操作法，質粒P2-390轉化進大腸桿菌MC1061株中，挑選產生MDC的氨苄青黴素抗性克隆。克隆培養在3升發酵器(Applikon，福斯特城，CA)中，MDC的產生加50％阿拉伯糖至終濃度0.1％時被誘導出來。在阿拉伯糖存在下溫育一天後，收穫細胞。Western印跡顯示MDC存在在細胞中的水平約每克溼細胞4μg，分泌到培養基的水平為約1μg/ml。實施例8從細菌和培養基中純化重組MDC下面的實驗方案純化實施例7所述產生的重組MDC。分泌的重組MDC蛋白從細菌培養基中純化，如可採用過去描述過的純化重組產生的RANTES趨化因子[庫那等，免疫學雜誌，149636-642(1992)]，MGSA趨化因子[赫魯克等，生物化學雜誌，268541-46(1993)]，和IP-10趨化因子(在昆蟲細胞中表達)[塞萊斯等，實驗醫學雜誌，1781127-1132(1993)]的方法。實施例9MDC在酵母中的重組生產下面的方案進行MDC在酵母中重組表達和重組MDC的純化。MDCcDNA的編碼區從pMP390-12用PCR擴增，所用的引物是含存在引物390-1F和390-2R的MDCcDNA序列的合成寡核苷酸。編碼酵母pre-pro-alpha前導序列的DNA從酵母基因組DNA在PCR反應液中擴增，用含α接合因子基因的1-20位鹼基為一引物，另一引物是與該基因255-235位鹼基互補的序列[科簡和赫斯科威茲，細胞，30933-943(1982)]。pre-pro-alpha前導編碼序列和MDC編碼序列片段連接到含酵母乙醇脫氫酶(ADH2)啟動子的質粒中，以使啟動子指導由pre-pro-alpha因子融合成熟MDC多肽組成的融合蛋白的表達。在羅斯和布洛奇，MethEnz.185234-279，D.Goeddel，ed.，科學出版公司，聖地牙哥，CA(1990)的方法指導下，載體進一步包括克隆位點下遊的ADH2轉錄終止子，酵母「Z-微粒」複製起點，酵母leu-2d基因，酵母REP1和REP2基因，大腸桿菌β-內醯胺酶基因和大腸桿菌複製起點。β內醯胺酶和leu-2d基因分別在細胞和酵母中選擇表達。leu-2d基因也有利於增加質粒在酵母中的拷貝數，誘導高水平的表達。REP1和REP2基因編碼涉及質粒拷貝數調節的蛋白。前段所述的DNA構建體，用已知的方法如乙酸鋰處理[斯蒂斯等，Meth.Enz.同上，pp.280-297]轉化進酵母細胞。ADH2啟動子誘導依賴於生長培養基中葡萄糖耗竭[普賴斯等，基因，55287(1987)]。pre-pro-alpha序列影響融合蛋白從細胞中分泌。同時，酵母KEX2蛋白把pre-pro序列從成熟的MDC趨化因子上切割下來[皮特等，美國國家科學院院報，815330-5334(1984)]。另外，用商業化的表達系統，如Pichia表達系統(Invitrogen，聖地牙哥，CA)，按廠家的說明進行MDC在酵母中重組表達。該系統也依賴pre-pro-alpha序列指導分泌，但插入片段的轉錄由甲醇誘導的酒精氧化酶(AOX1)啟動子所驅動。分泌的MDC從酵母生長培養基中純化，如用從細菌和哺乳細胞上清純化MDC的方法(見實施例8和10)。實施例10MDC在哺乳動物細胞中重組生產按下列步驟MDC在哺乳動物細胞中重組表達。A.表達載體390HXE的合成MDCcDNA的截短譯本按實施例2所述的PCR法合成，用pMP390-12作模板和合成的寡核苷酸390RcH和390RcX作引物。(SEQIDNO14)390RcH5′GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA(SEQIDNO15)390RcX5′TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG引物390RcH含HindIII限制性位點，接著是SEQIDNO1的1-20位鹼基；引物390RcX含XbaI限制性位點，接著是與SEQIDNO1的403-385位鹼基互補的序列。預期的423bp的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳純化，克隆到HindIII/XbaI消化的pRc/CMV載體中((InVitrogen，聖地牙哥CA)允許在哺乳細胞中直接表達的載體)。得到的質粒，命名為390HXE，含SEQIDNO1的1-403位鹼基。插入的序列用自動測序法證實，所用的引物是DC03(SEQIDNO16)和JHSP6。DC035′CGAAATTAATACGACTCACT3′引物DC03能與pRc/CMV載體鄰近克隆位點的序列退火。B.表達載體390HmX的合成另一個MDCcDNA構建體用PCR產生，用pMP390-12作模板，引物是390RcH和390mycRX(SEQIDNO17)。390mycRX5′TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTATTGAGAAT3′引物390mycRX含XbaI限制性位點，互補於編碼「myc」表位序列[富爾克斯等，生物技術，13422-427(1992)]的序列，和互補於SEQIDNO1的298-278位鹼基的序列。該反應擴增出預期的354bp片段，該片段含SEQIDNO1的1-298位鹼基和在MDC羧基端融合「myc」表位。這表位能用於方便作免疫沉澱，親和純化和western印跡法檢測MDC-myc融合蛋白。片段克隆到pRc/CMV以產生390HmX質粒。插入的序列用引物DC03，自動測序法證實。C.MDC在293T和NS0細胞中表達二種轉染方案用於表達上述A.和B.亞部分的二個MDCcDNA構建體瞬間轉染到人胚腎293T細胞系和穩定轉染到鼠骨髓瘤NS0細胞系(ECACC85110503)。293T細胞的瞬間轉染用陳和歐克雅瑪，生物技術，6632-638(1988)和分子細胞生物學，872745-2752(1987)的磷酸鈣沉澱方法進行。細胞和上清於轉染後四天收集。Northern印跡的準備是來自每一細胞裂解物的4μg總RNA，用PCR製備的放射性標記的MDC片段探查。標記反應的模板是前述的用引物390-1F和390-4R(見實施例2)擴增pMP390產生的PCR片段。約30ng該片段用於PCR反應，反應液含如下1.5mM氯化鎂，50mM氯化鉀，10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8.4，0.2mM脫氧腺苷酸三磷酸，0.2mM脫氧胸苷三磷酸，0.2mM脫氧鳥苷三磷酸，1μM脫氧胞苷三磷酸，50μCiα32P-脫氧胞苷三磷酸(DuPont/NewEnglandNuclear，波士頓MA)，2.5UTaq聚合酶和10μg/ml每一引物390-1F和390-2R。反應液在94℃加熱變性4分鐘，接著按實施例2所述方法擴增15個循環。探針過G-25快速旋轉柱(BMB)純化。雜交條件在實施例2中已述。膜接著在0.5×SSC中洗和42℃2％SDS中洗30分鐘。放射自顯影在-80℃用一個增感屏進行16小時。MDCDNA構建體在轉染細胞中高表達，在非轉染細胞中檢測不出來。為穩定轉染體，NS0細胞在D-MEM(Gibco)中生長到80％匯合密度，離心收集，用PBS清洗。20μg質粒DNA用ScaI限制酶(BMB)切成線性，加到細胞上，在一0.4cm間隙(gap)小杯(BioRad，HerculesCA)中冰上溫育15分鐘。細胞電穿孔用1.5千伏3微法的二次脈衝。細胞稀釋到20mlD-MEM中，5％CO237℃中培養24小時，用含800μg/mlgeneticin的D-MEM不同的稀釋度植到96孔板中篩選。含單個抗藥克隆的孔在選擇性培養基中擴大培養。總RNA按前段所述的Northem印跡法分析。MDC的信息只在轉染細胞系中可見。MDC從哺乳動物細胞培養上清中純化，如採用純化重組TCA3趨化因子[威爾遜等，免疫學雜誌，1452745-2750(1990)]，或下面F亞部分所述的方法。D.MDC在CHO細胞中表達用引物390RcH和390RcX(SEQIDNOs14和15)，按上述A亞部分所述的方法，PCR擴增MDCcDNA克隆的1-403位鹼基。片段克隆到表達載體pDC1的HindIII和XbaI位點之間，pDC1是pUC19的衍生體，含驅動插入片段表達的巨細胞病毒(CMV)的啟動子。更具體地說，pDC1載體，圖示在圖8中，衍生自pRc/CMV和pSV2-dhfr(ATCC載體#37146)。載體pDC1與哺乳表達載體pRc/CMV(Invitrogen，聖地牙哥)相似，除了在新黴素磷酸轉移酶基因部位，pDC1攜帶鼠二氫葉酸脫氫酶(dhfr)基因為選擇標誌。在pDC1中靶基因的轉錄在CMV強啟動子控制之下。見斯特恩伯格等，病毒學雜誌，49190-199(1984)。此外，來自牛生長激素基因[古德溫和羅特曼，生物化學雜誌，26716330-16334(1992)]的多腺苷化序列接在靶基因的3′端。dhfr表達盒[薩伯拉曼尼等，分子細胞生物學，1854-864(1981)]允許缺乏有功能的dhfr基因的細胞選擇pDC1。用CaCl2溫育和熱休克的標準技術(聖姆布魯克等)，XL-1藍細菌(Stratagene)用pDC1/MDC轉化。轉化體生長在含100μg/ml羧苄青黴素的LB培養基中。從單獨轉化克隆來的質粒DNA，用普羅麥格(promega)WizardMaxiprep系統(麥迪遜，WI)分離，其序列用引物390-IF和390-2R自動測序證實。質粒用PvuI內核酸酶(BoehringerMannheim)經限制性消化成線性，該酶在載體序列中僅切割一次。用於MDC生產的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系是DG-44，缺失dhfr基因產生。見厄洛伯等，細胞，33405(1983)。電穿孔時，107的這些CHO細胞用PBS清洗，重懸浮在1mlPBS中，和25μg被線性化的質粒混合，轉移到一0.4cm小杯中。懸液用BioradGenePulser(Richmond，CA)在290伏，960微法下電穿孔。轉化體生長在含10％透析胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)，缺次黃嘌呤和胸腺嘧啶的α-培養基(Cat.NO.12000，Gibco，Gaithersburg，MD)中選擇。來自幾百個轉化克隆的細胞混合，重新在含20nM氨甲喋呤(西格瑪，聖路易斯，MO)的α-培養基中庫存和再接種。分離在這輪選擇中存活的克隆，在含20nM氨甲喋呤的α-培養基中擴大培養。E.作蛋白測序用的MDC的純化轉染的CHO克隆在α-培養基中，生長在塑料組織培養皿上到約90％匯合密度，在那時培養基用含0.2％-1.0％FBS的P5培養基更換。P5培養基由以下表2(以預先混合的粉末購自Hyclone，LoganUT)所列的組分組成，添加以下額外的組分(1)3g/l碳酸氫鈉(西格瑪，聖路易斯，MO)；(2)2μg/l亞硒酸鈉(西格瑪)；(3)1％大豆水解物(QuestIntemational，Naarden，TheNetherlands)；(4)1×硫酸亞鐵/EDTA溶液(西格瑪)；(5)1.45ml/lEX-CYTEVLE溶液(Bayer，Kankakee，IL)；(6)10μg/ml重組胰島素(Nucellin，EliLily，Indianapolis，IN)；(7)0.1％普盧蘭尼克F-68(西格瑪)；(8)30μg/ml甘氨酸(西格瑪)；(9)50μM乙醇胺(西格瑪)；(10)1mM丙酮酸鈉(西格瑪)；培養額外的二天後，每一上清等分級分和等體積的丙酮混合。沉澱的蛋白離心沉澱，在18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸膠(NOVEX)中分級分離，印跡到PVDF膜上(Millipore，貝德福德，MA)。結合在膜上的MDC用粗製備的抗MDC的單克隆抗體(按實施例18所述製備)檢出。分泌高水平MDC蛋白(約1μg/ml)的克隆細胞，用0.5％胰蛋白酶和5.3mMEDTA(GIBCO)的溶液處理，從板上分離，用於加10％胎牛血清(FBS)的α-培養基中進行懸浮培養。過8天時間，加5倍體積的P5培養基到培養物中。加聚乙二醇(MW8000，UnionCarbide，Danbury，CY)到培養血清至20％(重量/體積)，蛋白從培養血清中沉澱，在18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸膠中分離，在CAPS緩衝液(3-[環己胺基]-1-丙磺酸，pH10.4)(西格瑪，聖路易斯，MO)中電轉離到PVDF膜上(Millipore，貝德福德，MA)。切下膜上的一條帶，用產生抗MDC單克隆抗體(見實施例18)的雜交瘤細胞系的上清，蛋白印跡法檢測MDC。以表觀分子量6.4KD遷移的反應帶從膜的殘餘部分切下。用自動測序儀(應用生物系統，型號473A，福斯特城，CA)，測定蛋白N端的序列是GPYGANMEDS。這序列與SEQIDNO2的1-10位殘基相同，與MDC預定成熟態的N端一致。F.作生物學測定用的MDC的純化作較大規模的培養生長，表達MDC的CHO細胞在α-培養基中，生長在組織培養板上至80％匯合密度，用胰蛋白酶和EDTA處理，細胞從板上分離，在加1％FBS的P5培養基中，以3×105細胞/ml的密度37℃重懸在螺口培養瓶中。需要時添加P5/1％FBS培養基，保持細胞密度在1×106～3×106範圍。經11天培養後，細胞通過過濾從培養基中分離。調培養基的pH至6.8，培養基過肝素-葡聚糖CL-6B柱(法瑪西亞，Piscataway，NJ)。用0.2M氯化鈉的磷酸鉀緩衝液，pH7，清洗後，柱用0.2-0.7M氯化鈉的線性梯度溶液洗脫。分離的級分用SDS-PAGE分析，考馬斯染色確定哪一部分含MDC。約在0.6M氯化鈉中，MDC從柱上洗脫。混合含MDC的級分，用能濾過(cutoff)分子量3KD的濾膜在攪拌室腔(Stirred-cellChamber)中(Amicon，Beverly，MA)超過濾濃縮。加辛基葡糖苷(終濃度10mM，BoehringerMannheimBiochemicals)到濃縮的MDC中，接著過SephacrylHR100柱(法瑪西亞，Piscataway，NJ)級分用SDS-PAGE分析，以確定MDC的存在。MDC蛋白的終產量約為每升培養上清0.1mg，按考馬斯染色判斷估計，其純度在95％以上。實施例11肽合成法生產MDC和MDC類似物MDC和MDC多肽類似物用肽化學合成法製備，所用的技術已成功用於其他趨化因子如IL-8[克洛克-李威斯等，生物化學雜誌，26623128-34(1991)]和MCP-1的生產。這些方法具有優勢是因為對象趨化因子這樣的短序列的蛋白，它們快速，可靠，能選擇性地導入新的，非天然的胺基酸和其它化學修飾物。例如，MDC和MDC類似物的化學合成，可用優化的逐步固相法[舒諾齊等，Int.J.Pept.ProteinRes.，40180(1992)]根據梅裡菲爾德[J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]的叔丁氧羰基化學原理，在應用生物系統430A肽合成儀(福斯特城，CA)上進行。用反相的HPLC純化蛋白，其標準方法的特徵包括電噴射質譜學和核磁共振。化學合成的MDC與重組MDC的成熟態一致，由SEQIDNO2的1-69位殘基組成。幾種方法用於化學合成的MDC與實施例10所述的CHO轉染細胞產生的重組MDC相比較。在變性SDS-PAGE(18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸凝膠，NOVEX)中，化學合成的MDC的遷移率與重組MDC相同。此外，在蛋白印跡分析中，用以下實施例18所述的抗細菌產生的MDC的單克隆和多克隆抗體，這些蛋白反應相似。在用抗MDC的單克隆抗體免疫沉澱分析中，化學合成的MDC也以重組MDC相同的方式表現。這些研究顯示化學合成MDC的變性和非變性結構與重組MDC的這些結構相似。以下的MDC類似物也已化學合成1)「MDC(n+1)」(SEQIDNO30)由亮氨酸接著是SEQIDNO2的1-69位殘基組成。2.「MDC(9-69)」由SEQIDNO2的9-69位殘基組成。3.「MDC-yl」(SEQIDNO31)由SEQIDNO2的1-69位殘基組成，其中有如下替換59-60位殘基(Trp-Val)用Tyr-Leu序列取代。4.「MDC-eyfy」(SEQIDNO32)由SEQIDNO2的1-69位殘基組成，其中有如下替換28-31位殘基(His-Phe-Tyr-Trp)用Glu-Tyr-Phe-Tyr序列取代，此序列來自趨化因子RANTES的胺基酸序列(SEQIDNO21的26-29位於殘基)。預期類似物「MDC(n+1)」，「MDC(9-69)」和「MDC-yl」是MDC活性的拮抗劑，通過競爭性地結合識別MDC的相同受體而抑制MDC活性。另外的可能是類似物能和天然的MDC形成異二聚體產生抑制作用。「MDC-eyfy」類似物的可能活性包括前述類似物的MDC抑制作用。相反，「MDC-eyfy」表現為天然MDC相似的特性。該類似物的其他活性可能包括趨化因子RANTES的典型功能，如淋巴細胞，單核細胞或嗜酸性細胞的趨化性。另外，可特別地設計下列單胺基酸變異體(單獨或結合)(1)非鹼性胺基酸分別替換SEQIDNO224和27位的鹼性精氨酸和/或賴氨酸；(2)帶電荷的或極性胺基酸(如絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺或半胱氨酸)替換SEQIDNO230位的酪氨酸，替換SEQIDNO259位的色氨酸、和/或SEQIDNO260位的纈氨酸；(3)鹼性或不帶電荷的小胺基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替換SEQIDNO250位的穀氨酸。具有這些胺基酸改變的特殊類似物包括在下表中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTYrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的胺基酸可選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的胺基酸可獨立地選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的胺基酸可獨立地選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸；其中50位的胺基酸可獨立地選自穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位的胺基酸可獨自地選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸；其中60位的胺基酸可獨立地選自纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸。這些MDC多肽類似物可特別地設計調節MDC對趨化因子受體和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、紅細胞趨化因子受體)的結合特性，這些特性在MDC呈遞給其受體時認為是重要的。如前面實施例所述的重組技術也可設計作製備MDC多肽類似物。更具體地說，用熟知的技術如定點突變和聚合酶鏈反應修飾編碼MDC的多核苷酸，以編碼感興趣的多肽類似物。一般參見聖姆布魯克等，同前，第15章。修飾過的多核苷酸重組表達，按前面實施例所述的方法純化重組的MDC多肽類似物。MDC或MDC多肽類似物對涉及炎症過程的一種或更多種細胞類型(如T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜鹼性細胞、嗜酸性細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞或其他細胞)的化學引誘和/或活化細胞的特性，通過確認的已用於許多其它的趨化因子的技術分析。在前面實施例所述的一種或更多種方法純化和分離的天然MDC、重組MDC或MDC多肽類似物、或合成的MDC或合成的MDC多肽類似物、按下面所述的關於MDC的實施例分析其活性。實施例12MDC對嗜鹼性細胞、肥大細胞和嗜酸性細胞作用的測定分析MDC對嗜鹼性細胞、肥大細胞和嗜酸性細胞的影響，如用韋伯等，免疫學雜誌，1544166-4172(1995)所述的測定MCP-1/2/3活性的方法。用這些方法，測定細胞胞液游離鈣的變化和前炎性(proinflammatory)介質(如組胺和白三烯)的釋放。阻斷趨化因子介導的這些種類細胞的活化涉及遲發變態反應的處理，在遲發變態反應中，前炎性介質的分泌起重要的作用[韋伯等，同上]。實施例13MDC對人單核細胞/巨噬細胞和人中性粒細胞的化學引誘和細胞活化特性的分析MDC對人單核細胞/巨噬細胞和人中性粒細胞影響的評價，如用戴維等，免疫學雜誌，1535376-5383(1995)描述的評價鼠TCA3誘導的中性粒細胞和巨噬細胞活化的方法。在上述研究中測定的活化指數包括因整合素活化增加對纖維蛋白原的粘附，化學趨化性，誘導活性氮中間體，呼吸爆發(超氧化物和過氧化氫的產生)，和在細胞松馳素B存在下溶菌酶和彈性蛋白酶的胞吐作用。如同戴維等討論一樣，這些活性與白細胞對炎症應答的不同階段有關。白細胞的這種應答，按斯普林傑，細胞，76301-314(1994)的綜述，涉及白細胞對血管內皮細胞的粘附，通過內皮層的遷移，對趨化因子源的趨化性和炎性介質特定位點的釋放。在這些階段的任一個涉及MDC會是臨床介入，調節炎性應答的重要靶點。用一公認技術的趨化反應測定法，為修改的Boyden室法，被測的白細胞在室溫下和Calcein溫育20分鐘標記上螢光。標記細胞用無血清的RPMI洗二次，重懸於含2mg/ml的BSA的RPMI中，然後定量加到室的上孔中，上孔與下孔被聚碳酸酯膜(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)分開。用與白細胞相同的培養基稀釋的MDC，以不同濃度加到下孔中。室在37℃下溫育2小時。方法的結束部分是未遷移穿過膜的細胞，在用PBS洗膜和橡皮刮刀(policeman)刮後移開。遷移過膜的細胞在螢光板讀數計(Cytofluor，MilliporeInc，波士頓，MA)中讀取每孔的螢光值定量。使用公認技術的方法，進行一系列實驗以確定MDC的趨化特性。開始時，測定人單核細胞對MCD的反應。MDC對多形核白細胞(粒細胞)趨化反應的影響也作了檢測。已經證實C-C趨化因子MCP-1，引起單核細胞募集和活化，但誘導巨噬細胞遷移的能力顯得有限。MCP-1不能吸引巨噬細胞似乎與分化過程有關當單核細胞分化時，逐漸降低細胞對MCP-1的應答[戴赫爾姆和斯坦克斯，細胞因子，7436-440(1995)]。MCP-1的生物學活性似乎與趨化因子的表達相關，在單核細胞中存在的MCP-1mRNA，當這些細胞分化時降低。MCD的表達類型似乎與所述的MCP-1的情況相反，當單核細胞分化成巨噬細胞時，MDCmRNA的數量增加。為確定是否該表達類型與對MDC的生物學應答相關，比較了MDC對單核細胞和巨噬細胞遷移的影響。在趨化性和抑制趨化性的測定中，分析了許多不同類型的白細胞。用本領域已知的方法[戴赫爾姆等，美國病理學雜誌，135571-580(1989)]，從外周血中分離了人單核和多形核白細胞。其次，使用了人單核細胞系，THP-1(從ATCCRockville，MD)獲取，在含10％FBS和青黴素/鏈黴素的RPMI中維持培養)。THP-1能以單核細胞的形態培養，或用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)處理能誘導分化成巨噬細胞[戴赫爾姆和斯坦克斯，細胞因子，7436-440(1995)]。一些實驗用單核的THP-1細胞，其他實驗單核THP-1細胞和乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)溫育分化成巨噬細胞。第三，豚鼠腹膜巨噬細胞基本按尤悉穆拉，免疫學雜誌，1505025-5032(1993)的方法得到。簡言之，收穫細胞前二天，給動物腹腔注射3％無菌的硫羥乙酸(thioglycollate)(DIFCO)用含1mMEDTA和0.1％葡萄糖的磷酸鹽緩衝液(PBS)灌洗，從腹腔獲取巨噬細胞。細胞離心洗一次，然後用於以下所述的趨化性測定。趨化活性測定，用上述製備的細胞，基本上按戴赫爾姆和斯坦克斯，Cytometry，19366-369(1995)所述的方法，用96-孔室(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)以及細胞用螢光染料，Calcein(分子探針，Eugene，OR)進行。測定時所用的聚碳酸酯膜是無PVP的(NeuroprobeInc.)；用於不同類型細胞的膜孔大小是單核細胞和THP-1細胞為5μm，多形核白細胞為3μm，豚鼠巨噬細胞為8μm。5萬個Calcein標誌的細胞重懸在含2mg/mlBSA的RPMI培養基中，放入上孔。MDC或其他測試物質用含BSA的RPMI稀釋(如，MDC終濃度為25、50、100、250ng/ml)，放入下孔中。接著37℃溫育2小時，擦去仍在膜上的未遷移細胞，然後讓膜空氣乾燥。這些測定的對照是含BSA的RPMI為陰性對照，50ng/mlMCP-1和1％酵母聚糖活化血清(ZAS，按[戴赫爾姆和利威斯，美國病理學雜誌，126464-474，(1987)]所述的方法製備)用作陽性對照。細胞的遷移率在螢光板讀數計(Cytofluor，MilliporeInc.Bedford，MA)上定量，遷移的細胞數以螢光單位表示。抑制活性測定中，在室上孔的細胞懸浮在不同濃度(0.005、0.05、0.5、5.0和5ng/ml)的MDC中。室的下孔注滿僅為培養基或培養基加趨化因子，MCP-1或酵母聚糖活化血清(ZAS)。比較缺MDC時遷移到MCP-1或ZAS的細胞數與增加MDC濃度遷移的細胞數，估計抑制率。細胞的製備和測定的定量嚴格按上述趨化測定方法操作。遷移的細胞數以螢光單位表示。如圖2所示，MDC不能誘導來自THP-1的單核細胞遷移，但在10～100ng/ml濃度內較明顯地抑制單核細胞的遷移。其它C-C趨化因子，如MCP-1和RANTES，在該濃度範圍典型地誘導最大的單核細胞趨化性。如圖3所示，濃度為0.001～100ng/ml的MDC對粒細胞遷移率沒有淨影響。除了缺乏對粒細胞趨化性影響外，MDC與其它前述的C-C趨化因子相似。巨噬細胞和單核THP-1細胞對MDC的應答用圖4表示。巨噬細胞(實心圓圈)以劑量依賴的方式向MDC遷移，最適活性為50ng/ml。巨噬細胞對較高濃度(100ng/ml)的MDC趨化應答的降低反映了細胞的脫敏作用，這是大多數趨化因子在高濃度時的特徵[福爾克和列納德，InfectInmunol.32464-468(1981)]。不過，單核THP-1細胞(空心圓圈)沒有向MDC遷移。MDC對巨噬細胞的趨化活性進一步用激活的豚鼠腹腔巨噬細胞的實驗證實。濃度為100～500ng/ml的MDC誘導豚鼠巨噬細胞以劑量依賴性遷移(圖5)。誘導豚鼠巨噬細胞遷移所需的濃度約為對人細胞(圖4)起作用濃度的10倍。對其它物種人趨化因子的最高生物活性所需的濃度，MCP-1有相似的差別，該結果已由尤悉穆拉，免疫學雜誌，1505025-5032(1993)報導。這些實驗結果表明MDC的生物學活性與單核細胞向巨噬細胞的分化有聯繫。與MCP-1相比[尤悉穆拉，免疫學雜誌，1505025-5032(1993)]，MDC誘導巨噬細胞而不是單核細胞的趨化性。MDC吸引巨噬細胞的能力顯示該趨化因子可能在誘導組織巨噬細胞的病灶性累積中起作用。組織巨噬細胞在特殊區域的累積在肉芽腫形成中是重要的，肉芽腫形成時肺巨噬細胞包圍和包裹異物或相對非破壞性的細菌病原如分支桿菌而起作用[亞當斯，美國病理學雜誌，84164-191(1976)]。在某些情況下如關節炎，已了解巨噬細胞的累積是有害的，具有破壞性。MDC能促進巨噬細胞趨化性顯示本發明的MDC抑制劑有治療效用，以預防、降低或消除巨噬細胞在組織中累積。圖2表示的用人單核細胞的趨化性測定結果暗示MDC能抑制細胞遷移。如圖6所示(MDC為0ng/ml)缺乏MDC時，單核THP-1細胞向MCP-1的遷移。不過，當細胞和MDC存在時，對MCP-1的趨化應答(實心圓圈)降低。濃度為0.005-0.5ng/ml的MDC抑制單核細胞對MCP-1的趨化應答。儘管MDC抑制單核細胞對MCP-1的趨化應答，在存在或缺乏MDC時，從向僅為培養基(空心圓圈，RPMI含BSA)遷移的細胞數看，MDC對趨化動力學或隨機遷移都沒有明顯的影響。MDC對單核細胞趨化性的抑制活性顯示MDC在處理幾種慢性炎性病態(動脈粥樣硬化、關節炎、肺纖維化)的治療效用，在這些病態中，單核細胞的趨化性似乎起重要的病原作用。增強MDC在以上疾病中的活性可導致降低單核細胞對組織的遷移性，從而減少疾病症狀的嚴重程度。實施例14MDC體內腫瘤生長抑制作用的測定MDC抑制腫瘤生長特性的分析，如修改自蘭寧等，免疫學雜誌，1534625-4635(1995)所述的分析鼠TCA3的抑制腫瘤特性的方法。編碼MDC的cDNA電穿孔法轉染進來自骨髓瘤的J558細胞系(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)。篩選MDC產生的轉染體用標準技術如ELISA(酶聯免疫吸附法)，採用實施例18細述的抗MDC的單克隆抗體。來自產生MDC克隆的一千萬細胞的團塊皮下注射到BALB/c小鼠的右下四分體中。為了比較，一千萬非轉染細胞注射到對照鼠中。比較兩組腫瘤形成的速度和發生率確定MDC抑制腫瘤生長的功效。隨後和腫瘤細胞有關的細胞浸潤物的特點用組織學方法辨認。此外，重組MDC(20ng)和非轉化J558細胞混合，注射(20ng/天)到形成自以上細胞的腫瘤中，以分析給與外源的MDC對腫瘤細胞的影響。實施例15腹膜內注射測定按洛等，免疫學雜誌，1534616-4624(1994)所述的方法，通過注射1-1000ng純化的MDC到小鼠或其它動物(如兔或豚鼠)的腹膜內腔中，確定體內對MDC起應答的細胞。注射後，白細胞從外周血和腹膜腔中分離，用DiffQuick試劑盒(Baxer，McGraw，IL)染色識別。白細胞的全貌是在不同時間估計不同細胞類型出現的動力學測定。在單獨的實驗中，抗MDC(實施例18)的中和抗體和MDC一起注射，以證實白細胞的浸潤是由於MDC的活性所致。實施例16體內活性測定-皮下注射MDC化學引誘物特性的體內測定，採用梅拉等，實驗醫學雜誌，1781913-1921(1993)所述的方案。重組MDC(10-500pmol/點)注射到合適的哺乳動物如狗或兔的皮下。在4-24小時，組織法估計注射點的細胞浸潤。用直接抗MDC的抗體免疫組織化學法證實存在MDC。細胞浸潤物的特點用Baxer’sDiffQuick試劑盒染色識別。實施例17脊髓抑制活性測定MDC脊髓抑制活性的測定，注射MDC到小鼠或另外的哺乳動物(如兔、豚鼠)中，如用梅茲等，免疫學雜誌，1491004-1009(1992)所述的測定MIP-1α的脊髓抑制作用的方法進行。單劑量0.2-10μg的重組MDC靜脈注射到C3H/HeJ小鼠中(傑克遜實驗室，BarHarborME)。測定在股骨髓和脾中髓樣祖細胞的循環效率(cyclingrate)確定趨化因子的骨髓抑制效應。祖細胞生長和分裂的抑制作用在臨床上與對接受化學治療或放射治療的病人的處理有關。以上趨化因子處理的脊髓保護效應已由達洛普等，血液，792221(1992)在臨床前模型中闡明。以前述對趨化因子衍生物白細胞介素-8(IL-8)和血小板因子4(PF-4)相同的方式，體外測定法也用於測定MDC對脊髓抑制的影響。見戴利等，生物化學雜誌，2702382(1985)。簡言之，為估計粒-巨噬前體細胞，在缺乏(對照)或存在MDC時，低密度(少於1.077g/cm)的正常人骨髓細胞植板於含10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)，100units/ml的重組人GM-CSF(RDSystems，Mineapolis，MN)，50ng/ml重組人青灰(Steel)因子(ImmunexCorp，Seattle，WA)，0.3％的瓊脂培養基中。為估計紅系粒細胞髓系巨核細胞集落形成單位(CFU-GEMM)和紅系簇形成單位(BFU-E)，在存在重組人紅細胞生成素(1-2units/ml)及與50ng/ml青灰因子合用下，細胞生長在含0.9％甲基纖維素的培養基中。在37℃低氧(5％)培養14天後，數個板上得到了集落。GM-CSF和青灰因子或紅細胞生成素和青灰因子的合用使能檢出大集落(通常＞1000細胞/克隆)，這些集落來自粒細胞髓系集落形成單位(CFU-GM)，CFU-GEMM和BFU-E的早，更不成集的子集合。實施例18抗人MDC的抗體A.單克隆抗體重組MDC，按實施例6所述的切割GST-MDC融合蛋白的方法產生，用於免疫小鼠，以產生單克隆抗體。此外，不同的小鼠用相當於MDC成熟態N端(SEQIDNO21-12位殘基)的化學合成肽段免疫。肽在應用生物系統型號473A肽合成儀(福斯特城，CA)合成，按廠家介紹的方法，連接到鑰孔_血藍素(Pierce)上。開始注射時，約10μgMDC蛋白或連接肽用弗氏完全佐劑乳化，皮下注射。間隔2-3周後，附加量的MDC蛋白用弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射。在最後灌注增強(prefusionboost)前，從免疫小鼠中取出血清樣品。這些血清用western印跡法分析，以證實其和MDC蛋白的反應性。為灌注增強，小鼠用在PBS中的MDC液注射，四天後殺死小鼠取出脾臟。脾放在10ml無血清的RPMI1640中，在二片玻璃顯微鏡載片磨砂端研磨浸在添加2mML-穀氨酸、1mM丙酮酸鈉，100units/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素(RPMI)(Gibco，加拿大)的無血清RPMI1640中的脾，形成單細胞懸液。細胞懸液用無菌的70目Nitex細胞濾過器(strainer)(BectonDickinson，Parsippany，NewJersey)過濾，離心200g5分鐘洗二次，重懸沉澱在10ml無血清RPMI中。取自三次未做過實驗的Balb/c小鼠的胸腺細胞，以相似的方法製備用作滋養層。NS-1骨髓瘤細胞，融合前在含10％胎牛血清(FBS)(Hyclone實驗室，Inc，Logan，Utah)的RPMI中維持其對數期三天，200g，5分鐘離心收集，按前段所述的方法洗沉澱二次。將脾細胞(2×108)和4×107NS-1細胞混合，離心，吸去上清。輕敲離心管移動細胞沉澱，加2ml37℃的PEG1500(50％在75mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸中(Hepes))(BoehringerMannheim)，攪拌1分鐘以上，接著加14ml無血清RPMI，7分鐘以上。加另外的16mlRPMI，細胞用200g離心10分鐘。去上清液後，沉澱重懸在含15％FBS、100μM次黃嘌呤鈉，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸腺嘧啶核苷(HAT)(Gibco)，25untis/ml白細胞介素-6(BoehringerMannheim)和1.5×106胸腺細胞/ml的200mlRPMI中，植板於10個Corning平底96孔培養板(Corning，Corning紐約)中。融合後第2，4和6天，從融合板的孔中移去100μl培養基，重加100μl新鮮培養基。在第8天，按下列檢測存在能結合MDC的鼠IgG的ELISA法篩選融合細胞。Immulon4板(Dynatech，Cambridge，MA)用稀釋在25mM三羥甲基氨基甲烷，pH7.5中每孔100ng的MDC，37℃包被2小時。吸去包被液，每孔加200μl封閉液[稀釋在CMF-PBS中0.5％魚皮明膠(西格瑪)]，37℃溫育30分鐘。吸去封閉液，加50μl培養上清。37℃溫育30分鐘後，用含0.05％吐溫20(PBST)的PBS洗三次，加50μl以1∶7000稀釋在PBST中偶聯的羊抗小鼠IgG(fc)辣根過氧化酶(傑克遜免疫研究，西格羅夫，賓夕法尼亞)。將板按上法溫育，用PBST洗4次，加100μl在100mM檸檬酸鹽，pH4.5中含1mg/ml鄰苯二胺(西格瑪)和0.1μl/ml30％過氧化氫組成的底物液。5分鐘後，加50μl15％的硫酸終止顏色反應。在板讀數儀(Dynafech)上讀A490值。選出的融合細胞稀釋在96孔板中克隆二次，5天後可數每孔的克隆數。由雜交瘤產生的單克隆抗體用Isostrip系統(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)同型化。抗MDC的抗體，用western印跡法抗上述在大腸桿菌或哺乳CHO細胞產生的重組MDC，進一步確定其特點。為準備印跡，約3μl沉澱細胞(產生MDC的轉化大腸桿菌，產生MDC的轉染CHO細胞；未轉化的大腸桿菌(對照)；和未轉染CHO細胞(對照))溶解在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和DTT(二硫蘇糖醇)的標準樣品製備緩衝液中(聖姆布魯克等)。煮沸後，裂解液通過變性SDS-PAGE(18％丙烯醯胺、三羥甲基氨基甲烷甘氨酸凝膠，NOVEX)分級分離，電印跡到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA)。MDC單克隆抗體用PBS稀釋到0.7μg/ml，按照標準技術(聖姆布魯克等)，用於蛋白印跡。作為另外的對照，進一步測試單克隆抗體對人皮膚、扁桃體和胸腺的全組織裂解液的蛋白印跡帶的交叉反應性。有一抗MDC的單克隆抗體，命名為單克隆抗體191D，它與細菌和哺乳動物細胞產生的重組MDC有強烈反應。而且，該抗體顯示對所試的細菌、CHO哺乳動物細胞系或全部人組織非常小背景反應性。此外，該抗體表現為按照標準的免疫沉澱方法(聖姆布魯克等)，能免疫沉澱來自CHO的重組MDC。產生單克隆抗體191D(命名為雜交瘤191D)的雜交瘤細胞系，按照布達佩斯特條約的條款(ATCC保藏日期1996年6月4日；ATCC登記號HB-12122)，存放在美國典型培養物保藏中心(ATCC)中，12301ParklawnDriVe，RockVilleMD20852(美國)。保藏材料的存活性不應僅理解為當在違反任何政府當局根據其專利法授予的權利時的通行證。B.多克隆抗體抗MDC的多克隆抗體，按照標準方案(聖姆布姆克等)，在兔中產生。上述以GST融合蛋白產生的重組MDC用PBS稀釋，弗氏完全佐劑乳化，皮下注射到兔中。間隔3-6周，另外稀釋在PBS中的MDC用弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射到相同的兔子中。第三次免疫後10天，從兔中抽取血清，用10倍的含0.5％吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩衝鹽溶液稀釋(TBS-T，聖姆布姆克等)，通過上述抗重組MDC的蛋白印跡法定性。實施例19鈣流測定細胞內鈣濃度的變化，為趨化因子細胞活化的指標，用公認技術的鈣流測定法在幾個細胞系中進行了監測，細胞在室溫下溫育在1ml含1μMFura-2/AM(分子探針，Eugene，OR)的完全培養基中30分鐘，洗一次，以～106細胞/ml重懸在D-PBS中。2ml懸浮細胞放在位於螢光計(AMINCO-BowmanSeries2，羅徹斯特，NY)內37℃下不斷攪拌的小杯中。胞內鈣濃度用螢光表示，這是以0.5秒間隔轉換340nm和380nm的激發波長時，在發射波長510nm處所測定的螢光值。從340nm到380nm激發波長的發射比率相當於胞內鈣水平。該測定測量的細胞系包括如下穩定轉染公認的趨化因子受體基因V28[萊普特等，基因，163295-299(1995)]的人胚腎HEK-293細胞系；穩定轉染趨化因子受體基因CCR5的HEK-293細胞[塞姆森等，生物化學，353362-3367(1995)；也見共同擁有，共同未決的美國專利申請，流水號08/575,967，提交日期1995年12月20日，在此引入參考，公開趨化因子材料和方法，包括CCR5(在那認作「88C」)]，人單核THP-1細胞系，人肺上皮A-549細胞系；人成纖維IMR-90細胞系。這些細胞對重組MDC蛋白應答時均沒有鈣流。作為陽性對照，HEK-293轉染細胞對凝血酶有強烈反應，提示測定是有效的。此外，THP-1細胞對終濃度為25ng/ml購買的趨化因子MCP-1和MCP-3(Peprotech，RockyHill，NJ)有強烈反應。對A-549或IMR-90細胞系，未測定另外的刺激。實施例20HIV增殖的抑制作用幾種CC趨化因子涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的增殖，HIV是人獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS)的誘發因素。見科克希等，科學，2701811(1995)。MDC抗HIV增殖的活性用科克希等所述的方法測量，在該方法中，CD4+T細胞用HTV株急性感染，在不同濃度的MDC存在下培養。三天後，往細胞中加含新鮮稀釋MDC的培養基。感染後5～7天，HIV水平用商業化的ELISA檢測盒(科爾特，邁阿密，FL)，檢測培養上清存在的HIVp24抗原測量。檢測了抗MDC的抗體中和由人淋巴細胞產生的抑制活性的能力(科克希，同上)此外，在HIV抑制測定中，化學合成的MDC類似物(實施例11)或重組方法產生的類似物的功效也進行了測試。實施例21MDC對成纖維細胞增殖的影響除了能吸引和活化白細胞外，一些趨化因子如IL-8，表明能影響非白細胞性的細胞增殖[見達斯悉爾，J.Invest.Dermatol.，92294-298(1992)]。整個機體的成纖維細胞對大多數組織的完整性是重要的。成纖維細胞增殖對傷口癒合和對損傷的反應是必不可少的，但在慢性炎性疾病如肺纖維化的情況下，也是有害的[番恩，炎症免疫學，Elsevier(1983)，pp.121-162)]。體外細胞增殖測定用於估計MDC對成纖維細胞增殖的影響。人成纖維細胞(CRL-1635)從ATCC獲得，在含10％FBS和1％抗生素的DMEM中維持培養。增殖測定的操作和定量，按本領域由戴赫爾姆和番恩，美國病理學雜誌，134355-363(1989)前述的方法。簡言之，第一天，在含10％FBS的DMEM中，2.5×103細胞/孔種到96孔板上。第二天植板24小時後，細胞上的培養基換成無血清的DMEM。第3天培養基從細胞中移去，代之以含0.4％FBS稀釋有MDC的DMEM。第5天每孔加1微居裡的3H胸腺嘧啶核苷，繼續溫育5小時。把細胞收穫到玻璃纖維濾膜上。細胞增殖率以摻入到成纖維細胞中的3H胸腺嘧啶核苷的cpm表示。該測定的對照包括測定所用的基本培養基，含0.4％FBS的DMEM作陰性對照，含10％FBS的DMEM作陽性對照。如圖7所示，MDC處理以劑量依賴方式降低成纖維細胞的增殖。用從CHO細胞純化的MDC(實心圓圈)和化學合成的MDC(空心圓圈)觀察到相似的成纖維細胞增殖抑制作用。MDC抗成纖維細胞增殖的效應顯示有治療用途，用MDC處理如肺纖維化和腫瘤疾病，這些疾病中，增強或失控的細胞增殖是主要特徵。實施例22細胞增殖測定測定MDC對上皮細胞、T細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞增殖的影響，用本領域熟知的如戴赫爾姆等，美國病理學雜誌，134355-363(1989)所述的方法和「免疫學現代方法」書中3-4節，「淋巴細胞功能體外測定」由威利和桑斯(1992)所寫的生長因子活性測定法。在這些方法中，測量了細胞生長的增強和抑制作用和生長因子的釋放。MDC對上皮細胞和內皮細胞增殖影響的測定，用上述對成纖維細胞(實施例21)相同的步驟。用外周血淋巴細胞，測定對T細胞增殖的影響。單核細胞按戴赫爾姆等，美國病理學雜誌，135571-580(1989)所述的方法，從外周血中分離；細胞重懸在含10％FBS的RPMI中，在塑料培養瓶中溫育過夜。淋巴細胞仍懸浮在這些培養物中，離心培養液得到。10萬個淋巴細胞接種到96孔板的一孔中，在含1μg/ml植物血球凝集素(PHA)加或不加50、125、250或500ng/mlMDC的培養基(RPMI加10％FBS)中培養3天。在培養最後18小時，加1微居裡的3H-胸腺嘧啶核苷。收穫細胞，增殖率按實施例21所述的用於成纖維細胞的方法表示。測定MDC對巨噬細胞增殖的影響，用按上述實施例13中獲得的激活的豚鼠腹腔巨噬細胞。巨噬細胞以每孔10萬個細胞的密度在含10％FBS的RPMI中，植到96孔板中，溫育2小時使細胞貼壁。然後移去培養基，代以加或不加50、125、250或500ng/ml的MDC的新鮮培養基。細胞和MDC溫育3天，按上述用於淋巴細胞的方法測定增殖率。趨化因子介導的這些類型細胞的增殖控制，在損傷後加強組織修復和在慢性炎症反應如牛皮癬、纖維化、動脈粥樣硬化和腫瘤疾病中限制這些細胞增殖時，有治療意義。實施例23成纖維細胞增殖的體內測定體內測定MDC對成纖維細胞抗增殖的影響，用本領域公認的方法，如番恩和方託恩，美國病理學雜誌，50587-591(1984)的報導方法，該法用博萊黴素誘導的大鼠肺纖維化模型。該模型特徵明確，允許在疾病的整個階段估計成纖維細胞的增殖和膠原合成。簡言之，把大鼠分為4個處理組1)對照，給予生理鹽水氣管內注射；2)鹽水注射大鼠，再接受每天腹腔注射鹽水中的500ngMDC；3)博萊黴素處理，給予1.5mg/kg博萊黴素(Calbiochem，PaloAlto，CA)氣管內注射；4)博萊黴素處理大鼠再給予每天腹腔注射500ngMDC。開始氣管注射後4、7、14、21和28天，每組殺三隻大鼠。取肺，每個肺葉樣品作組織學檢查和膠原含量測定。實施例24MDC調節因子測定MDC活性的調節因子(modulator)，對MDC在其中起作用的疾病或疾病症狀的處理可能是有用的。以上調節因子要麼是MDC結合的激動劑或是拮抗劑。以下的受體結合測定提供方法識別以上的MDC調節因子。MDC用可檢測的標記物如125I、3H、14C、生物素或銪標記。含MDC受體的細胞膜製備自對MDC有應答的自然細胞，如人巨噬細胞、佛波酯激活的THP-1細胞、人成纖維細胞、人成纖維細胞系或豚鼠巨噬細胞。(替代的方法是當以上MDC受體cDNA被鑑定和克隆時，從轉染MDC受體cDNA的細胞中制重組受體製備物)。例如，膜製品暴露在125I標記的MDC中，在合適的條件下溫育(如37℃10分鐘)。然後在濾膜上真空過濾收集任何方式結合125I-MDC的膜，清洗移去未結合的125I-MDC。然後把膜放到液體閃爍分光光度計中定量和結合MDC有關的放射性。MDC結合的特異性可在增加未標記MDC的數量的情況下，重複前面的方法，測定競爭性地結合到受體的水平證實。這些結合測定也能用於識別MDC受體結合的調節因子。前面的受體結合測定也可作如下修改進行除標記MDC外，待定的MDC調節因子放到膜製品中。在這改變的測定方法中，膜有關的標記物增加水平(數量)顯示待定的調節因子是MDC結合的活化因子；膜有關的標記物降低水平(數量)顯示待定的調節因子是MDC受體結合的抑制劑。該測定方法能用於從大量的化合物或天然產物中識別MDC結合的特異活化劑和抑制劑。同時快速地篩選大量調節因子候選化合物是特別希望的。如上述闡明的MDC的生物學功能，表明有幾方面的臨床用途。一般來說，趨化因子吸引和活化單核細胞和巨噬細胞(巴格歐裡尼等，同上)，MDC特別地吸引巨噬細胞和抑制單核細胞趨化性。這樣在病原性炎性固定點的MDC表達，可通過補充另外的巨噬細胞或白細胞到疾病位點，活化已經存在的白細胞，或誘導白細胞仍在疾病位點而加重病態。因而，抑制MDC的化學引誘活性可望減輕有害的炎性過程。有意義的是上述方法的潛在好處已在涉及IL-8的實驗中被直接闡明，IL-8是吸引和活化中性粒細胞的C-X-C細胞趨化因子。直接抗IL-8的抗體具有極強的能力。抑制由中性粒細胞介導的炎性疾病[哈拉達等，Leukoc.Biol.56559(1994)]。可望MDC的抑制作用在假定巨噬細胞起作用的疾病如節段性迴腸炎，風溼性關節炎或動脈粥樣硬化中，具有相似的效果。可供選擇的是，增加MDC的影響可能在以上疾病中具有有益的作用，因為已經表明趨化因子在傷口癒合和血管生成中有正作用。這樣，外源的MDC或MDC激動劑可能在促進以上疾病恢復中是有益的。此外，闡明C-C趨化因子MIP-1α(梅茲等，同上)的骨髓抑制效應表明MDC可能有相似的活性。由MDC或MDC激動劑提供的以上活性，對接受化學療法或放射療法的病人產生實際的益處，降低治療對病人髓樣祖細胞的有害影響。也可證明MDC或MDC激動劑在治療腫瘤時有臨床的重要性，如已表明C-C趨化因子TCA3能抑制小鼠的腫瘤形成(見蘭寧等，同上)。MDC可直接或間接地抑制腫瘤形成而起作用，如吸引和活化不同的非特異效應細胞到腫瘤位點或激活特異的抗腫瘤免疫。MDC抗成纖維細胞增殖的效應顯示MDC在治療諸如肺纖維化和腫瘤這些疾病的治療用途，這些疾病中，增強或失控的細胞增殖是主要的特徵。當本發明按特別的實施方案描述時，可以理解本領域的技術人員會想到變化的和修改的方法。因此，本發明只受所附權利要求中限制因素的限制。序列表(1)總的信息(i)申請人Godiska，Ronald；Gray，PatrickW.(ii)發明題目巨噬細胞來源的趨化因子和趨化因子類似物(iii)序列數32(iv)通信地址(A)收信人Marshall，O』Toole，Gerstein，MurrayBorun(B)街道6300SearsTower，233SouthWackerDrive(C)城市芝加哥(D)州伊利諾斯(E)國家美利堅合眾國(F)郵區60606-6402(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)當前申請數據(A)申請號(B)提交日期(C)分類(vii)在先申請數據(A)申請號08/558,658(B)提交日期1995年11月16日(vii)在先申請數據(A)申請號08/479,620(B)提交日期1995年6月7日(viii)委託人/代理人信息(A)姓名Gass，DavidA.(B)登記號38,153(C)參考/檔案號27866/33318(ix)電訊信息(A)電話312/474-6300(B)傳真312/474-0448(C)用戶電報25-3856(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特徵(A)長度2923鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱/鍵CDS(B)位置20..298(ix)特徵(A)名稱/鍵mat_肽(B)位置92..298(xi)序列描述SEQIDNO1GAGACATACAGGACAGAGCATGGCTCGCCTACAGACTGCACTCCTGGTTGTC52MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValVal-24-20-15CTCGTCCTCCTTGCTGTGGCGCTTCAAGCAACTGAGGCAGGCCCCTAC100LeuValLeuLeuAlaValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyr-10-51GGCGCCAACATGGAAGACAGCGTCTGCTGCCGTGATTACGTCCGTTAC148GlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyr51015CGTCTGCCCCTGCGCGTGGTGAAACACTTCTACTGGACCTCAGACTCC196ArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThrSerAspSer20253035TGCCCGAGGCCTGGCGTGGTGTTGCTAACCTTCAGGGATAAGGAGATC244CysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAspLysGluIle404550TGTGCCGATCCCAGAGTGCCCTGGGTGAAGATGATTCTCAATAAGCTG292CysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeuAsnLysLeu556065AGCCAATGAAGAGCCTACTCTGATGACCGTGGCCTTGGCTCCTCCAGGAAGGCTCA348SerGlnGGAGCCCTACCTCCCTGCCATTATAGCTGCTCCCCGCCAGAAGCCTGTGCCAACTCTCTG408CATTCCCTGATCTCCATCCCTGTGGCTGTCACCCTTGGTCACCTCCGTGCTGTCACTGCC468ATCTCCCCCCTGACCCCTCTAACCCATCCTCTGCCTCCCTCCCTGCAGTCAGAGGGTCCT528GTTCCCATCAGCGATTCCCCTGCTTAAACCCTTCCATGACTCCCCACTGCCCTAAGCTGA588GGTCAGTCTCCCAAGCCTGGCATGTGGCCCTCTGGATCTGGGTTCCATCTCTGTCTCCAG648CCTGCCCACTTCCCTTCATGAATGTTGGGTTCTAGCTCCCTGTTCTCCAAACCCATACTA708CACATCCCACTTCTGGGTCTTTGCCTGGGATGTTGCTGACACTCAGAAAGTCCCACCACC768TGCACATGTGTAGCCCCACCAGCCCTCCAAGGCATTGCTCGCCCAAGCAGCTGGTAATTC828CATTTCATGTATTAGATGTCCCCTGGCCCTCTGTCCCCTCTTAATAACCCTAGTCACAGT888CTCCGCAGATTCTTGGGATTTGGGGGTTTTCTCCCCCACCTCTCCACTAGTTGGACCAAG948GTTTCTAGCTAAGTTACTCTAGTCTCCAAGCCTCTAGCATAGAGCACTGCAGACAGGCCC1008TGGCTCAGAATCAGAGCCCAGAAAGTGGCTGCAGACAAAATCAATAAAACTAATGTCCCT1068CCCCTCTCCCTGCCAAAAGGCAGTTACATATCAATACAGAGACTCAAGGTCACTAGAAAT1128GGGCCAGCTGGGTCAATGTGAAGCCCCAAATTTGCCCAGATTCACCTTTCTTCCCCCACT1188CCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTTCGCTCTTGTCACCCACGCTGGAGTG1248CAATGGTGTGGTCTTGGCTTATTGAAGCCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCTTGC1308CTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGTTCCTGCTACCACGCCCAGCTAATTTTTGT1368ATTTTTAGTAGAGACGAGGCTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGTCCTC1428AGGTAATCCGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACAGTGC1488CTGGCCTCTTCCCTCTCCCCACTGCCCCCCCCAACTTTTTTTTTTTTTTTATGGCAGGGT1548CTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTCGGCTCACTACAACCTCGAC1608CTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCCACCCCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTGTG1668TGCCACTACGGCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGTTTCACCATATTGGCC1728AGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCTTCCTTGTGCTCCCAAAGTGCTG1788AGATTACAGGCGTGAGCTATCACACCCAGCCTCCCCCTTTTTTTCCTAATAGGAGACTCC1848TGTACCTTTCTTCGTTTTACCTATGTGTCGTGTCTGCTTACATTTCCTTCTCCCCTCAGG1908CTTTTTTTGGGTGGTCCTCCAACCTCCAATACCCAGGCCTGGCCTCTTCAGAGTACCCCC1968CATTCCACTTTCCCTGCCTCCTTCCTTAAATAGCTGACAATCAAATTCATGCTATGGTGT2028GAAAGACTACCTTTGACTTGGTATTATAAGCTGGAGTTATATATGTATTTGAAAACAGAG2088TAAATACTTAAGAGGCCAAATAGATGAATGGAAGAATTTTAGGAACTGTGAGAGGGGGAC2148AAGGTGAAGCTTTCCTGGCCCTGGGAGGAAGCTGGCTGTGGTAGCGTAGCGCTCTCTCTC2208TCTGTCTGTGGCAGGAGCCAAAGAGTAGGGTGTAATTGAGTGAAGGAATCCTGGGTAGAG2268ACCATTCTCAGGTGGTTGGGCCAGGCTAAAGACTGGGAGTTGGGTCTATCTATGCCTTTC2328TGGCTGATTTTTGTAGAGACGGGGTTTTGCGATGTTACCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTG2388GGCTCAAGCGATCCTCCTGGCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAATCAC2448TGCGCCTGGCTTCCTCTTCCTCTTGAGAAATATTCTTTTCATACAGCAAGTATGGGACAG2508CAGTGTCCCAGGTAAAGGACATAAATGTTACAAGTGTCTGGTCCTTTCTGAGGGAGGCTG2568GTGCCGCTCTGCAGGGTATTTGAACCTGTGGAATTGGAGGAGGCCATTTCACTCCCTGAA2628CCCAGCCTGACAAATCACAGTGAGAATGTTCACCTTATAGGCTTGCTGTGGGGCTCAGGT2688TGAAAGTGTGGGGAGTGACACTGCCTAGGCATCCAGCTCAGTGTCATCCAGGGCCTGTGT2748CCCTCCCGAACCCAGGGTCAACCTGCCTGCCACAGGCACTAGAAGGACGAATCTGCCTAC2808TGCCCATGAACGGGGCCCTCAAGCGTCCTGGGATCTCCTTCTCCCTCCTGTCCTGTCCTT2868GCCCCTCAGGACTGCTGGAAAATAAATCCTTTAAAATAGTAAAAAAAAAAAAAAA2923(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特徵(A)長度93胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO2MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuArg101520ValValLysHisPheTyrTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysGluIleCysAlaAspProArg455055ValProTrpValLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO3GACACTATAGAATAGGGC18(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特徵(A)長度17鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO4GTAAAACGACGGCCAGT17(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO5AATTAACCCTCACTAAAGGG20(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO6GTAATACGACTCACTATAGGGC22(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO7TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG35(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO8CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA33(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO9AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG29(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO10AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC31(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特徵(A)長度45鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO11TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA45(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO12GAAATCCAGCAAGTATATAGCA22(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO13ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA36(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO14GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA30(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO15TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG29(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO16CGAAATTAATACGACTCACT20(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特徵(A)長度67鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO17TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTAT60TGAGAAT67(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特徵(A)長度99胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「HuMCP-3」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO18MetLysAlaSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuThrAlaAlaAla-20-15-10PheSerProGlnGlyLeuAlaGlnProValGlyIleAsnThrSerThr-515ThrCysCysTyrArgPheIleAsnLysLysIleProLysGlnArgLeu10152025GluSerTyrArgArgThrThrSerSerHisCysProArgGluAlaVal303540IlePheLysThrLysLeuAspLysGluIleCysAlaAspProThrGln455055LysTrpValGlnAspPheMetLysHisLeuAspLysLysThrGlnThr606570ProLysLeu75(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特徵(A)長度99胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵字misc_特徵(D)其它信息「HuMCP-1」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO19MetLysValSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuIleAlaAlaThr-20-15-10PheIleProGlnGlyLeuAlaGlnProAspAlaIleAsnAlaProVal-515ThrCysCysTyrAsnPheThrAsnArgLysIleSerValGlnArgLeu10152025AlaSerTyrArgArgIleThrSerSerLysCysProLysGluAlaVal303540IlePheLysThrIleValAlaLysGluIleCysAlaAspProLysGln455055LysTrpValGlnAspSerMetAspHisLeuAspLysGlnThrGlnThr606570ProLysThr75(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特徵(A)長度76胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「HuMCP-2」(xi)序列描述SEQIDNO20GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle151015AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr202530AsnIleGlnCysProLysGluAlaValIlePheLysThrLysArgGly354045LysGluValCysAlaAspProLysGluArgTrpValArgAspSerMet505560LysHisLeuAspGlnIlePheGlnAsnLeuLysPro657075(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特徵(A)長度91胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「RANTES」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO21MetLysValSerAlaAlaAlaLeuAlaValIleLeuIleAlaThrAla-20-15-10LeuCysAlaProAlaSerAlaSerProTyrSerSerAspThrThrPro-515CysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLys10152025GluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPhe303540ValThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp455055ValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer6065(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特徵(A)長度91胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「MIP-1β」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO22MetLysLeuCysValThrValLeuSerLeuLeuMetLeuValAlaAla-20-15-10PheCysSerProAlaLeuSerAlaProMetGlySerAspProProThr-515AlaCysCysPheSerTyrThrArgGluAlaSerSerAsnPheValVal10152025AspTyrTyrGluThrSerSerLeuCysSerGlnProAlaValValPhe303540GlnThrLysArgSerLysGlnValCysAlaAspProSerGluSerTrp455055ValGlnGluTyrValTyrAspLeuGluLeuAsn6065(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特徵(A)長度92胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「MIP-1α」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..70(xi)序列描述SEQIDNO23MetGlnValSerThrAlaAlaLeuAlaValLeuLeuCysThrMetAla-20-15-10LeuCysAsnGlnPheSerAlaSerLeuAlaAlaAspThrProThrAla-51510CysCysPheSerTyrThrSerArgGlnIleProGlnAsnPheIleAla152025AspTyrPheGluThrSerSerGlnCysSerLysProGlyValIlePhe303540LeuThrLysArgSerArgGlnValCysAlaAspProSerGluGluTrp455055ValGlnLysTyrValSerAspLeuGluLeuSerAla606570(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特徵(A)長度96胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息「I-309」(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..73(xi)序列描述SEQIDNO24MetGlnIleIleThrThrAlaLeuValCysLeuLeuLeuAlaGlyMet-20-15-10TrpProGluAspValAspSerLysSerMetGlnValProPheSerArg-515CysCysPheSerPheAlaGluGlnGluIleProLeuArgAlaIleLeu10152025CysTyrArgAsnThrSerSerIleCysSerAsnGluGlyLeuIlePhe303540LysLeuLysArgGlyLysGluAlaCysAlaLeuAspThrValGlyTrp455055ValGlnArgHisArgLysMetLeuArgHisCysProSerLysArgLys606570(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特徵(A)長度93胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(ix)特徵(A)名稱/鍵蛋白質(B)位置1..69(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息提示/＝「24位的胺基酸選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸」(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息提示/＝「27位的胺基酸分別選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸和甲硫氨酸」(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息/提示＝「30位的胺基酸分別選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸」(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息/提示＝「50位的胺基酸分別選自穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸」(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息/提示＝「59位胺基酸選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸」(ix)特徵(A)名稱/鍵misc_特徵(D)其它信息/提示＝「60位胺基酸選自丙氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺和半胱氨酸」(xi)序列描述SEQIDNO25MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO26TATTGGATCCGTTCTAGCTCCCTGTTCTCC30(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO27CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC31(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO28GCGACTCTCTACTGTTTCTC20(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特徵(A)長度20鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO29CACAGGAAACAGCTATGACC20(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特徵(A)長度70胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO30LeuGlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAsp151015TyrValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrp202530ThrSerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArg354045AspLysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIle505560LeuAsnLysLeuSerGln6570(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特徵(A)長度69胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO31GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTyrLeuLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特徵(A)長度69胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單(D)拓撲學線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO32GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysGluTyrPheTyrThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65關於微生物保藏的說明(細則13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)權利要求1.編碼具有SEQIDNO2的巨噬細胞來源的趨化因子(MDC)胺基酸序列的多肽的純化多核苷酸。2.權利要求1的為DNA的多核苷酸。3.權利要求2的具有SEQIDNO1的20-298位核苷酸的DNA。4.編碼MDCSEQIDNO2的1-69位胺基酸的純化多核苷酸。5.權利要求4的為DNA的多核苷酸。6.權利要求5的具有SEQIDNO1的92-298位核苷酸的DNA。7.選自如下的純化的多核苷酸(a)SEQIDNO1的DNA；(b)在嚴謹條件下能與SEQIDNO1的DNA非編碼鏈雜交的多核苷酸；(c)由於遺傳密碼的冗餘性，在嚴格條件下能與SEQIDNO1的DNA非編碼鏈雜交的多核苷酸；和(d)與SEQIDNO1的DNA編碼相同的多肽的多核苷酸。8.權利要求7的為DNA的多核苷酸。9.編碼具有SEQIDNO25胺基酸序列的多肽的純化多核苷酸。10.權利要求9的為DNA的多核苷酸。11.編碼SEQIDNO25的1-69位胺基酸的純化的多核苷酸。12.權利要求11的為DNA的多核苷酸。13.選自如下的純化的多核苷酸(a)權利要求12的DNA；(b)在嚴格條件下能與權利要求12雜交的多核苷酸；和(c)由於遺傳密碼的冗餘性，在嚴格的條件下能與權利要求12的DNA雜交的多核苷酸。14.權利要求13的為DNA的多核苷酸。15.包含權利要求2、5、8、10、12或14的DNA的載體。16.權利要求15的為表達載體的載體，其中DNA能可操作地與表達控制DNA序列連接。17.以一種可在所述宿主細胞中表達MDC的方式用權利要求2或5的DNA穩定轉化或轉染的宿主細胞。18.產生MDC的方法，所述的方法包括在營養培養基中培養權利要求17的宿主細胞和從所述的細胞或培養基中分離MDC。19.以一種可在所述宿主細胞中表達MDC多肽類似物的方式由權利要求10或12的DNA穩定轉化或轉染的宿主細胞。20.產生MDC多肽類似物的方法，所述的方法包括在營養培養基中培養權利要求19的宿主細胞和從所述的細胞或培養基分離MDC多肽類似物。21.具有SEQIDNO25的胺基酸序列的純化多肽。22.權利要求21的具有SEQIDNO2的胺基酸序列的純化多肽。23.具有SEQIDNO25的1-69位胺基酸的純化多肽。24.根據權利要求23具有SEQIDNO2的1-69位胺基酸的純化多肽。25.選自如下的多肽(a)包含鑑定為SEQIDNO30的1-70位的胺基酸序列的多肽；和(b)包含鑑定為SEQIDNO2的9-69位的胺基酸序列的純化多肽；和(c)包含鑑定為SEQIDNO31的1-69位識別的胺基酸序列的多肽；和(d)包含鑑定為SEQIDNO32的1-69位識別的胺基酸序列的多肽。26.編碼權利要求25的多肽的多核苷酸。27.權利要求26的是DNA的多核苷酸。28.包含權利要求27的DNA的載體。29.用權利要求27的DNA以一種可在所述宿主細胞中表達所述多肽的方式穩定轉化或轉染的宿主細胞。30.一種與權利要求21，22，23，24或25的多肽特異反應的抗體。31.根據權利要求30為單克隆抗體的抗體。32.產生權利要求31的抗體的雜交瘤細胞系。33.包含按權利要求30抗體的多克隆抗血清。34.和MDC起特異反應的抗體。35.在哺乳動物宿主中調節白細胞趨化性的方法，它包括如下步驟(a)給所述的哺乳動物宿主施用權利要求21、22、23、24或25的多肽，其中所述的多肽在所述的宿主中能調節白細胞趨化性。36.權利要求35的方法，其中所述的白細胞選自單核細胞和巨噬細胞。37.減輕病人炎症疾病的方法，所述的疾病其特徵至少是(i)在所述的病人中單核細胞向炎症位點趨化或(ii)成纖維細胞增殖中之一，所述的方法包括如下步驟(a)給病人施用治療有效量的MDC。38.權利要求37的方法，其中所述的治療有效量的MDC是能抑制單核細胞趨化性的量。39.按權利要求37的方法，其中所述的治療有效量的MDC是能抑制成纖維細胞增殖的量。40.包含SEQIDNO1核苷酸序列的一個連續部分或與其互補的非編碼鏈的DNA，所述的連續部分包含至少18個核苷酸，所述的DNA在嚴謹條件下能和人MDC基因雜交。41.權利要求40的DNA，其中所述的DNA在所述的嚴謹條件下，不能與選自MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因的人趨化因子基因雜交。42.在藥學上可接受的載體中包含權利要求21，22，23，24或25的多肽的藥用組合物。43.權利要求42的組合物在治療炎性疾病狀態中的用途。44.權利要求43的用途，其中所述的炎性疾病狀態其特徵在於在具有所述疾病狀態的病人中，單核細胞向炎症位點趨化。45.按權利要求43的用途，其中所述的炎性疾病狀態其特徵在於具有所述疾病狀態的病人中，成纖維細胞增殖。46.鑑定具有MDC調節活性的化合物的方法，包括步驟(a)提供包含MDC受體的第一和第二受體組合物；(b)提供包含可檢測標記的MDC的對照組合物；(c)提供包含可能檢測標記的MDC和進一步包含所述化合物的測試組合物；(d)在MDC能與MDC受體結合的情況下，用對照組合物接觸第一受體組合物；(e)在MDC能與MDC受體結合的情況下，用檢測組合物接觸第二受體組合物；(f)洗去第一和第二受體組合物，以移去未與MDC受體結合的可檢測標記的MDC；(g)在所述的第一和第二受體組合物中測定可檢測標記的MDC；和(h)鑑定含MDC調節活性的化合物，其中MDC調節活性與被可檢測標記的MDC在所述的第一和第二受體組合物中的差異有關。全文摘要本發明提供了編碼一種新的稱為MDC的人巨噬細胞來源的趨化因子及其多肽類似物的純化和分離的多核苷酸序列。還提供了重組生產該趨化因子，和純化和分離的趨化因子蛋白，以及多肽類似物的材料和方法。文檔編號C12N15/19GK1163635SQ96190875公開日1997年10月29日申請日期1996年6月7日優先權日1996年6月7日發明者R·戈迪斯卡,P·W·格雷申請人:艾科斯有限公司