一種人結直腸癌蛋白質標誌物CLCA1試劑盒及其應用的製作方法

2023-12-04 19:29:16 1

本發明屬於生物技術和醫學領域，涉及一種用於人結直腸癌標誌物試劑盒，尤其涉及一種用於人結直腸癌標誌物clca1試劑盒，是一種蛋白質鈣離子激活氯離子通道蛋白1(calcium-activatedchloridechannel1,clca1)，以及該試劑盒的應用。

背景技術：

根據世界衛生組織最新的統計數據，在全球範圍內，結直腸癌的發病率居所有惡性腫瘤的第三位，死亡率居第四位。結直腸癌早期症狀不明顯，且目前為止，沒有一種特異性和敏感性均較好的標誌物用於早期檢測結直腸癌，一半以上的患者確診時已處於局部晚期或晚期。臨床分期是決定結直腸癌患者預後的一個及其重要的因素，早期患者的5年生存率可達到90％，而晚期患者的5年生存率不到10％。因此，儘早診斷結直腸癌對於提高結直腸癌患者的生存率和療效具有非常重大的意義。

其次，對於治療後病人的預後、生存期的預測，常規方法依賴於病理參數、tnm分期等因子,但病理判斷受人為因素幹擾較大,且預測特異性不高，非常需要有差異顯著、靈敏度高、特異性好、操作方便的分子標誌物來作為輔助判斷方法。

因此，尋找結直腸癌的有效標誌物,早期診斷及預測生存成為廣大醫學工作者的迫切任務。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種人結直腸癌蛋白質標誌物clca1試劑盒，該試劑盒包括針對clca1的特異性抗體、edta抗原修復液、內源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清、二抗、pbs緩衝液、蘇木素、分化液、dab顯色液，

作為優選，內源性過氧化物酶阻斷劑為3％過氧化氫；

pbs緩衝液配置方法：稱取nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，加蒸餾水至1000ml，充分混勻，調節ph到7.2-7.6；

edta抗原修復液配方：稱取tris30.27g，edta(乙二胺四乙酸)1.461g，加蒸餾水至500ml，充分混勻，使用前稀釋10倍；

蘇木素配置方法：稱取蘇木精2g，溶於250ml無水乙醇中；稱取硫酸鋁17.6g，溶於750ml蒸餾水中；將溶解後的蘇木精和硫酸鋁混勻，用玻璃棒攪拌，邊攪拌邊加入碘酸鈉0.25g，放於自動攪拌機上攪拌過夜；第二日加入20ml冰醋酸；

分化液配置方法：取濃鹽酸1ml,加入無水乙醇99ml，配成1％鹽酸酒精分化液；

dab顯色液配置方法：1ml蒸餾水中，加入dab緩衝液(20×)，dab底物(20×)及dab色原(20×)各50μl，混勻，使用前配置。

本發明的另一個目的是提供一種人結直腸癌蛋白質標誌物clca1試劑盒的應用，所述應用是指作為篩選抗結直腸癌藥物靶標；是用於製備篩查、診斷或預測人結直腸癌的製劑；或用於製備緩解或治療人結直腸癌的藥物。

根據本發明的研究結果，免疫組織化學、westernblot、酶聯免疫吸附試驗表明，clca1在正常結直腸組織中的表達量顯著高於結直腸癌組織，且clca1在健康人血液中的含量顯著高於結直腸癌患者血液中的含量。而且，clca1高表達的結直腸癌患者生存期顯著長於clca1低表達的患者。因此,clca1可以作為一種新的人結直腸癌蛋白質標誌物，並可用於篩選抗結直腸癌藥物的靶標，為有效判斷結直腸癌癌變進程提供科學依據，為早期檢測結直腸癌及判定預後提供科學依據。

本發明提供的一種人結直腸癌蛋白質標誌物clca1試劑盒的檢測方法，通過以下步驟實現：(1)製備石蠟切片；(2)檢測石蠟切片中clca1的表達量。石蠟切片為離體的人源組織製成。利用clca1抗體與樣本中的蛋白反應，檢測clca1的表達量。例如，在本發明的一個優選實施例中，採用免疫組織化學技術確定樣本中clca1的存在及表達量。

本發明提供了一個用於區分人結直腸癌組織以及癌旁正常組織的蛋白質標誌物clca1試劑盒,該試劑盒利用該標誌物製備早期診斷人結直腸癌、判斷預後。本發明為有效判斷人結直腸癌癌變進程提供科學依據。本發明的檢測試劑盒高效、方便、成本較低。

附圖說明

圖1是利用免疫組織化學染色的方法分析人結直腸癌組織及癌旁正常組織中clca1的表達量。對18對結直腸癌組織及其癌旁組織免疫組化分析發現，clca1在結直腸癌組織中的表達顯著低於癌旁組織(p<0.0001)，clca1在94.4％(17/18)的癌旁組織中呈陽性表達，而僅在11.1％(2/18)的結直腸癌組織中呈陽性表達。圖1a及1c為clca1在結直腸癌中表達陰性的代表性圖，分別放大100倍及400倍，圖1b及1d為clca1在癌旁組織中表達陽性的代表性圖，分別放大100倍及400倍，圖中「腫瘤」代表結直腸癌組織，「正常」代表癌旁正常組織。

圖2是clca1在結直腸癌組織及其癌旁組織中的westernblot典型條帶圖,t代表結直腸癌組織，n代表癌旁正常組織。

圖3是19對結直腸癌組織及其癌旁組織westernblot條帶灰度分析結果，以gapdh為內參照，clca1在結直腸癌組織中平均灰度值為0.40±0.48，而在癌旁正常組織中平均灰度值為1.08±0.47，t檢驗表明，差異具有統計學意義，p<0.0001。

圖4是酶聯免疫吸附法測定clca1在結直腸癌患者及健康對照者血液中含量的散點圖。對100例結直腸癌患者及76例健康對照者血液中clca1含量的分析發現，clca1在結直腸癌患者血液中的平均濃度為1.48±1.06ng/ml，顯著低於健康對照組血液中的平均濃度1.06±0.73ng/ml(p＝0.0018)。

圖5是kaplan-meier方法分析clca1的基因表達與結直腸癌患者生存的關係圖。clca1基因低表達組的平均生存時間為64.9個月(n＝22,標準誤9.8，95％置信區間為45.7-84.1)，而clca1基因高表達組的平均生存時間為90.7個月(n＝24,標準誤6.5，95％置信區間為77.9-103.4)，logrank檢驗表明兩組差異具有統計學意義(p＝0.034),說明clca1基因為結直腸癌有效的預後因子。圖中0表示低表達組(clca1基因表達值<100)，1表示高表達組(clca1基因表達值≥100)。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明作詳細說明,而不會限制本發明。

實施例1clca1免疫組化檢測試劑盒的製備

該試劑盒包括針對clca1的特異性抗體、edta抗原修復液、內源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清、二抗、pbs緩衝液、蘇木素、分化液、dab顯色液，

其中內源性過氧化物酶阻斷劑為3％過氧化氫；

pbs緩衝液配置方法：稱取nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，加蒸餾水至1000ml，充分混勻，調節ph到7.2-7.6；

edta抗原修復液配方：稱取tris30.27g，edta(乙二胺四乙酸)1.461g，加蒸餾水至500ml，充分混勻，使用前稀釋10倍；

蘇木素配置方法：稱取蘇木精2g，溶於250ml無水乙醇中；稱取硫酸鋁17.6g，溶於750ml蒸餾水中；將溶解後的蘇木精和硫酸鋁混勻，用玻璃棒攪拌，邊攪拌邊加入碘酸鈉0.25g，放於自動攪拌機上攪拌過夜；第二日加入20ml冰醋酸；

分化液配置方法：取濃鹽酸1ml,加入無水乙醇99ml，配成1％鹽酸酒精分化液；

dab顯色液配置方法：1ml蒸餾水中，加入dab緩衝液(20×)，dab底物(20×)及dab色原(20×)各50μl，混勻，使用前配置。

實施例2用製備的試劑盒對待測樣本進行檢測

操作流程如下：

1.石蠟切片：取病理確診為結直腸癌的手術標本及其癌旁正常組織，經福馬林固定，石蠟包埋後製成石蠟塊，切片厚度為5微米，所有患者術前均未接受抗腫瘤治療。

2.烤片：將石蠟切片放入60攝氏度恆溫箱中，烤片2小時。

3.脫蠟和水化：

1)將石蠟切片依次放入兩缸二甲苯中，脫蠟兩次，每次20分鐘；

2)水化：將石蠟切片依次放入兩缸無水乙醇中，每缸5分鐘；取出石蠟切片，依次放入兩缸95％乙醇中，每缸5分鐘；取出石蠟切片，放入90％乙醇中，5分鐘；取出石蠟切片，放入75％乙醇中，5分鐘；

3)取出石蠟切片，用蒸餾水衝洗5分鐘。

4.抗原修復：

1)將處理好的切片置於切片架,放入含有1000毫升edta抗原修復液的燒杯中,電爐加熱至沸騰,用小火繼續煮沸15分鐘；

2)將燒杯拿離火源，自然冷卻至室溫，將石蠟切片放入蒸餾水中洗兩次，每次3分鐘，換pbs液洗3分鐘。

5.阻斷內源性過氧化物酶：

1)每張切片滴加一滴內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育30分鐘；

2)將切片用pbs洗3次，每次3分鐘。

6.封閉：每張切片滴加一滴山羊血清，室溫孵育30分鐘，傾去血清。

7.加入一抗：

1)每張切片滴加50微升稀釋1000倍的clca1特異性抗體(購自abcam公司,ab180851)，放入溼盒中，4攝氏度過夜；

2)將切片用pbs洗3次，每次5分鐘。

8.加入二抗：

1)除去pbs液，每張切片滴加50微升envisiontm+/hrp兔工作液(購自邁新公司)，室溫孵育30分鐘；

2)將切片用pbs洗3次，每次5分鐘。

9.dab顯色：配置dab稀釋液，每張切片滴加100微升dab稀釋液，顯微鏡下觀察2-5分鐘，顯色後用自來水衝洗15分鐘。

10.蘇木素復染：將切片放入蘇木素中染色10分鐘，自來水衝洗5分鐘；鹽酸酒精分化2秒鐘，自來水衝洗5分鐘。

11.脫水及封片：

1)將切片放入75％乙醇中，脫水5分鐘；取出切片，放入95％乙醇中，5分鐘；取出切片，依次放入兩缸無水乙醇中，每次5分鐘；

2)中性樹膠封片，通風櫥中晾乾。

實施例3試劑盒的臨床驗證

用上述實施例1製備的試劑盒,依據實施例2的檢測步驟與方法，檢測了18對結直腸癌組織及其癌旁組織clca1的表達情況。所有組織標本在手術後經浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科進行病理證實。每張切片隨機選取至少10個高倍鏡視野(×200),至少計數1000個細胞,以積分法計算結果。即根據每張切片的染色強度和陽性細胞比率進行聯合計分。染色強度:無色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕色3分。陽性細胞比率：50％為3分。取染色強度和陽性細胞比率的兩種評分之和的平均值,<2分者為陰性,≥2分者為陽性。數據統計採用spss20.0軟體進行。

分析結果表明，在18對結直腸癌組織及其癌旁組織中，clca1在結直腸癌組織中的表達顯著低於癌旁組織(p<0.0001)，clca1在94.4％(17/18)的癌旁組織中呈陽性表達，而僅在11.1％(2/18)的結直腸癌組織中呈陽性表達。clca1在結直腸癌中表達陰性的代表性圖見圖1a及1c，clca1在癌旁組織中表達陽性的代表性圖見圖1b及1d。上述臨床驗證的結果進一步表明，clca1可以作為結直腸癌診斷的分子標誌物，採用本發明提供的試劑盒,檢測人體結直腸組織clca1的表達水平,可以方便快捷地為結直腸癌診斷提供幫助。

實施例4用westernblot方法分析clca1在結直腸癌組織與癌旁正常組織中的含量。

操作流程如下：

1.蛋白質抽提：取病理確診的結直腸癌新鮮冰凍組織及其癌旁正常組織，加入液氮研磨，研磨好的粉末倒入組織裂解液中，冰上裂解30分鐘，12000rpm，4攝氏度離心10分鐘，取上清即為組織細胞總蛋白，bca法測定蛋白濃度，已測濃度的蛋白樣品按體積比4：1加入5×sds上樣緩衝液，沸水中煮沸5分鐘，-20攝氏度保存。

2.sds-page凝膠電泳：

1)制膠：將成套的灌膠玻璃板用夾子固定在底座上，配製10％分離膠，混勻後立即灌膠，上層用異丙醇封膠，室溫聚合40分鐘以上；待分離膠聚合後吸淨上層的異丙醇，配製5％濃縮膠，混勻後立即灌膠，並插入梳子；

2)上樣及電泳：待膠完全凝固後拔出梳子，將凝膠板轉入電泳槽中，加入電泳緩衝液，取已變性的蛋白樣品，每孔加40微克，同時加預染蛋白marker，作為分子量對照；蓋上槽蓋，接通電源，濃縮膠先以50v電壓進行電泳,待溴酚藍指示劑進入分離膠後轉換成100v繼續電泳,待指示劑跑至分離膠底部0.5cm左右停止電泳。

3.轉膜：

1)在電泳即將結束前，將pvdf膜浸泡在甲醇中活化1分鐘，然後將pvdf膜和濾紙浸泡在轉膜緩衝液中15分鐘；

2)撬開玻璃板，取出sds-page凝膠，按黑板-海綿墊-濾紙-凝膠-pvdf膜-濾紙-海綿墊-白板的順序將凝膠與pvdf膜固定於轉膜夾內,整個操作在轉膜緩衝液中進行，避免產生氣泡；

3)將轉膜夾放入電轉儀中，接上電源，4攝氏度環境中250ma恆流轉膜2.5小時。

4.封閉：轉膜結束後取出pvdf膜，放入5％脫脂牛奶中，室溫封閉1小時。

5.孵育一抗：一抗稀釋1000倍，4攝氏度搖床孵育過夜。

6.孵育二抗：取出pvdf膜，tbst液洗滌3次，每次5分鐘，二抗稀釋5000倍，室溫孵育2小時。

7.ecl試劑發光，顯影和定影：取出pvdf膜，tbst液洗滌3次，每次5分鐘，將ecl底物滴加到膜上，室溫反應3min，放入暗盒中，用保鮮膜包好pvdf膜，暗室中用柯達x膠片感光，顯影液中顯影，定影液中定影。

8.結果：用imagej軟體對條帶進行灰度測量，gapdh為內參。對19對結直腸癌組織及其癌旁組織westernblot條帶灰度分析發現，clca1在結直腸癌組織中的表達顯著低於癌旁組織(p<0.0001)。圖2是clca1在結直腸癌組織及其癌旁組織中的westernblot典型條帶圖,t代表結直腸癌組織，n代表癌旁正常組織。圖3是19對結直腸癌組織及其癌旁組織westernblot條帶灰度分析結果，以gapdh為內參照，clca1在結直腸癌組織中平均灰度值為0.40±0.48，而在癌旁正常組織中平均灰度值為1.08±0.47，t檢驗表明，差異具有統計學意義，p<0.0001。

實施例5酶聯免疫吸附試驗檢測clca1在結直腸癌患者與健康人血液中的含量

操作流程如下：

1.試劑盒：酶聯免疫吸附試驗檢測clca1試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(seg699hu)，組成：96孔板(預包被)、標準品(10ng/ml)、標準品稀釋液、檢測溶液a、檢測溶液b、檢測稀釋液a、檢測稀釋液b、樣本稀釋液、濃洗滌液(30×)、tmb底物、終止液、覆膜。

2.實驗步驟：

1)使用前試劑盒內所有試劑緩慢平衡至室溫，避免快速溶解造成蛋白降解。

2)試劑配製：(1)標準品稀釋液：將標準品高速離心後加入1ml樣本稀釋液溶解，充分混勻，其濃度為20ng/ml(貯液)，將其稀釋為標準品s7(10ng/ml)。(2)取7個1.5ml離心管(s0-s6)依次排列，用於標準品稀釋，在每個離心管中加入500μl標準品稀釋液，吸取500μl標準品s7到第一個離心管中(s6)，輕輕吹打混勻，從s6中吸取500μl到第二個離心管(s5)中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋，s0僅為樣本稀釋液。s7-s0標準品濃度分別為10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.312ng/ml、0.156ng/ml、0ng/ml。(3)洗滌工作液：濃洗滌液按1:30倍用去離子水稀釋，充分攪拌混勻,於臨用前配妥。(4)檢測溶液a及檢測溶液b：檢測溶液a及檢測溶液b在使用前，分別以檢測溶液a或b1:100倍分別用檢測稀釋液a或b進行稀釋，輕輕混勻，臨用前10分鐘配妥。(5)底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的tmb至另一乾淨容器中使用，容器中剩餘的底物應予丟棄，不要倒回tmb瓶中。

3)加樣：設置標準品孔、待測樣本孔，每孔分別加標準品或待測樣本(血清)100μl，輕輕晃動混勻，覆上覆膜，37℃溫育1小時。

4)棄去液體，甩幹，不用洗滌。

5)每孔加檢測溶液a工作液100μl(臨用前配製)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。

6)棄去孔內液體，甩幹，每孔加350μl洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標儀朝下用力拍幾次(也可輕拍講孔內液體拍幹)，重複洗板3次。最後一次洗滌後，要把孔內的洗滌液完全甩幹。

7)每孔加檢測溶液b工作液(臨用前配製)100μl，覆上覆膜，37℃溫育30分鐘。

8)棄去孔內液體，甩幹，洗板5次。方法同步驟7。

9)每孔加底物溶液(90μl/孔)，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15～25分鐘，不要超過30分鐘，當標準品前3-4孔出現明顯梯度藍色，最後3孔顯色不明顯時即可加入終止)。

10)每孔加底物溶液(50μl/孔)，終止反應，此時藍色立轉黃色，終止液的加入順序應儘量與底物溶液加入順序相同。如出現顏色不均一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

11)在確保酶標板無水滴及孔內無氣泡後，立即用酶標板在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)。

12)根據標準品吸光值及對應濃度計算標準曲線，根據標準曲線計算公式計算各孔待測樣品濃度，乘以稀釋倍數後得出血清中目標蛋白的濃度。

3.結果：對100例結直腸癌患者及76例健康人血液中clca1含量的分析發現，clca1在結直腸癌患者血液中的平均濃度為1.48±1.06ng/ml，顯著低於健康人血液中的平均濃度1.06±0.73ng/ml(p＝0.0018)。圖4是酶聯免疫吸附法測定clca1在結直腸癌患者及健康人血液中含量的散點圖。

實施例6kaplan-meier方法分析clca1的基因表達與結直腸癌患者預後的關係

提取46例結直腸癌組織總rna，進行基因晶片分析(affymetrixu133plus2.0)，檢測clca1基因表達值。所有患者均具有隨訪數據。測出表達值後將患者按clca1基因表達水分為兩組，表達值<100為低表達，用0表示；表達值≥100為高表達，用1表示。採用kaplan-meier方法分析結直腸癌患者的生存時間，logrank檢驗法比較兩組的平均生存時間。結果表明，clca1基因低表達組的平均生存時間為64.9個月(n＝22,標準誤9.8，95％置信區間為45.7-84.1)，而clca1基因高表達組的平均生存時間為90.7個月(n＝24,標準誤6.5，95％置信區間為77.9-103.4)，兩組差異具有統計學意義(p＝0.034),說明clca1基因為結直腸癌有效的預後因子。圖5是kaplan-meier方法分析clca1的基因表達與結直腸癌患者預後的關係圖，0表示低表達組，1表示高表達組。