人源化的FcγR小鼠的製作方法

2023-06-08 06:36:16

專利名稱：人源化的FcγR小鼠的製作方法
技術領域：
本發明領域是缺失內源鼠Fe YR基因的遺傳修飾的非人動物，包括內源Fe YR基因被人Fe Y R基因替代的遺傳修飾的動物，包括能夠表達至少2、3、4或5種功能性人低親和力Fe Y R基因的小鼠，以及包括包含不表達內源低親和力Fe Y R基因的免疫細胞的遺傳修飾的小鼠。背景Fe受體(FcR)是在哺乳動物的進行免疫系統的多種功能的免疫系統的細胞的表面上發現的蛋白質。FcR以多種類型存在於多種細胞上，並且介導多種免疫功能，例如結合附著至被感染的細胞或侵襲性病原體的抗體、刺激吞噬細胞或細胞毒性細胞以通過抗體介導的吞噬作用或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)破壞微生物或感染的細胞。
ADCC是這樣的過程免疫系統的效應細胞裂解被抗體結合的靶細胞。該過程依賴於對外源抗原或細胞的先行接觸，從而產生抗體應答。ADCC可通過效應細胞例如天然殺傷(NK)細胞，通過效應細胞表面上表達的FcR對本身結合至外源抗原或細胞的抗體的Fe部分的結合來介導。由於FcR在免疫應答中起著中心作用，因此需要有共表達多種人FcR的有用的非人動物，包括共表達多種人低親和力FcR的非人動物。存在對用於研究和闡明人疾病治療(特別是抗腫瘤治療和用於治療自身免疫疾病的治療)和藥物開發(特別是在人抗體藥劑的開發、設計和測試中)的人FcR功能和人的ADCC過程的非人動物模型。附圖
概述圖I是小鼠的野生型低未和力Fe Y R基因座的不意圖，顯不了小鼠Fe Y RIIB，Fe Y RIV和Fe Y RIII基因以及用於這些基因的靶向缺失的小鼠Fe Y R靶向載體，其包括側翼連接有位點特異性重組位點的新黴素盒。圖2顯示了就B細胞(抗-⑶19)，NK細胞(抗_NKp46)和巨噬細胞(抗-F4/80)門控的脾細胞的直方圖，包括野生型和低親和力FcYRa鏈基因缺陷型小鼠(mFcYR K0)的內源mFc YRII和mFc YRIII基因的表達。圖3A-3D顯示了在人源化⑶20小鼠(h⑶20)和培育成Fe Y R敲除小鼠的人源化
0)20小鼠(hQ)20/Fc Y R K0)中在幾個淋巴細胞區室(lymphocyte compartment):骨髓(圖3A)、血液(圖3B)、淋巴結(圖3C)和脾(圖3D)中利用具有小鼠Fe (Ab 168)或人Fe (Ab735)的人抗-人CD20抗體對B細胞進行的體內耗盡。對於每一個圖，y_軸顯示門控的B細胞(B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，x_軸顯示每一個動物組的抗體劑量10mg/kg對照抗體(C), 2mg/kg人抗-人0)20抗體(2Ab和10mg/kg人抗-人0)20抗體(IOAb)。圖4是低親和力小鼠Fe Y R基因座的新黴素靶向缺失和用於將兩個人低親和力Fe Y R基因插入缺失的小鼠基因座的第二靶向載體的示意性描述，所述第二靶向載體包括側翼連接有位點特異性重組位點的潮黴素盒。為了在血小板上表達hFc Y RIIA,使用了可操作地連接於人Fe Y RIIIA-IIA靶向載體的hFc Y RIIA基因的延長的啟動子區域；為了阻止在血小板上表達hFc Y RIIA，刪除或實質上刪除所述啟動子區域。
圖5A顯示針對NK細胞(抗-NKp46和巨噬細胞(抗-F4/80)的門控的脾細胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA純合子小鼠(人FcyRIIIA/FcyRIIA HO)的人FcyRIIIA的表達。圖5B顯示針對嗜中性粒細胞(抗_Ly6G)和巨噬細胞(抗-F4/80)的門控的脾細胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA純合子小鼠(人Fe yRIIIA/Fc YRIIA HO)的AFcyRIIA的表達。圖6為包括兩個低親和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIIA和hFc Y RIIA)的插入的低親和力小鼠Fe Y R基因座的潮黴素靶向缺失以及用於插入3個額外的低親和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIB、hFc Y RIIIB和hFc y RIIC)的第三靶向載體和側翼連接有位點特異性重組位點的新黴素盒的不意圖。圖7顯示針對B細胞(抗-CD19)和嗜中性粒細胞(抗_Ly6G)的門控的脾細胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RmA-IIlB-IIA-IIB-IIC純合子小鼠(人Fe Y RIIIA/Fe Y RIIIB/Fc y RIIA/Fc y RIIB/Fc y RIIC HO)的人 Fe y RIIB 和人 Fe y RIIIB 的表達。 概述提供了遺傳修飾的細胞、非人胚胎、非人動物以及用於產生和使用它們的方法和組合物。在不同的方面，非人動物包含人Fe Y R受體、內源低親和力Fe Y R受體的缺失和/或人Fe Y R受體在內源小鼠低親和力Fe Y R基因座上對內源Fe Y R受體的替代。在一個方面，提供了包含功能性FcR Y鏈的遺傳修飾的細胞、非人胚胎和非人動物，其中所述細胞、胚胎和動物包含進一步修飾，包括用一個或多個低親和力人Fe Y R基因序列(例如，選 S Fcy RIIA, Fe y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA、Fe y RIIIB 及其組合)對低親和力內源非人Fe Y R基因序列(例如，Fe Y RIIB、Fe Y RIV和FcyRIII)的替代。在一個實施方案中，細胞、非人胚胎和非人動物為鼠。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈為小鼠FcRy鏈。在一個實施方案中，小鼠FcR Y鏈為對於小鼠、細胞或胚胎而言是內源性的FcR Y鏈。在一個實施方案中，細胞、胚胎和動物為小鼠，並且小鼠表達人低親和力Fe YR受體的功能性α鏈和功能性內源小鼠Y鏈。在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中小鼠不表達選自Fe YRIIBa鏈、FcyRIVa鏈、FcYRIIIa鏈及其組合的內源α鏈；其中小鼠表達功能性內源小鼠Y鏈。在具體的實施方案中，小鼠不表達功能性Fe Y RIIB α鏈，不表達功能性FcyRIVa鏈，並且不表達功能性Fe Y RIII α鏈。在一個實施方案中，小鼠基因組包含內源FcYRIIBa鏈的缺失、內源Fe Y RIV a鏈的缺失和內源Fe Y RIII α鏈的缺失。在一個實施方案中，小鼠包括內源Fe YRIIBa鏈的缺失、內源Fe Y RIV α鏈的缺失和內源Fe YRIII α鏈的缺失，並且還包括與野生型小鼠對於相同抗原的能力相比較減小的對抗原產生免疫應答的能力。在一個實施方案中，減小的免疫應答包括減小的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，減小的免疫應答包括在細胞殺傷測定中減小的實現抗體依賴性NK細胞殺傷的能力。在具體的實施方案中，ADCC或抗體依賴性NK細胞殺傷的減小為至少50%，在一個實施方案中是至少75%，在一個實施方案中是至少90%。
在一個實施方案中，小鼠包含內源Fe Y RIIBa鏈的缺失、內源Fe Y RIV α鏈的缺失和內源Fe Y RIII α鏈的缺失，以及還包括在用抗原免疫後與野生型小鼠例如不包含缺失的相同或相似品系的小鼠相比較，增強的體液抗體應答。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答為野生型小鼠的2倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答為野生型小鼠的3倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答為野生型小鼠的5倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答為野生型小鼠的7倍。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答為野生型小鼠的10倍。在具體的實施方案中，體液抗體應答通過每微克小鼠的血清蛋白特異性結合抗原(已用其免疫小鼠的)的抗體的微克數來測量。在一個實施方案中，增強的體液抗體應答是就野生型小鼠對其展示耐受性的抗原或野生型小鼠對其展示較弱或最小的體液免疫應答的抗原而言的。在具體的實施方案中，抗原是小鼠抗原。在具體的實施方案中，抗原是展示與小鼠蛋白具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。 在一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y Ra鏈基因對低親和力小鼠Fe Y Rα鏈基因的替代的遺傳修飾的小鼠，其中所述替代在內源小鼠Fe YRa鏈基因基因座上。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe Y Ra鏈基因選自Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII α鏈基因。在具體的實施方案中，提供了遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達內源FcRy鏈，並且其中低親和力人FcYRa鏈基因為FcYRIIIAa鏈。在另一個具體的實施方案中，遺傳修飾的小鼠在NK細胞上表達內源FcR Y鏈和功能性人Fe Y RIIIA α鏈。在具體的實施方案中，NK細胞上的Fe Y RIIIA α鏈的功能性反映在人抗體介導的NK殺傷(例如，由人抗體介導的ADCC)。在一個方面，提供了遺傳修飾的細胞、非人胚胎或非人動物，其中所述遺傳修飾包括人FcYRa鏈基因對至少一個內源低親和力Fe Y Ra鏈基因的替代，並且所述細胞、胚胎或動物表達功能性FcR Y鏈。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈為內源FcR Y鏈。在一個實施方案中，低親和力人Fe YRa鏈基因選自Fe YRIIAa鏈基因、Fe YRIIIAa鏈基因及其組合。在具體的實施方案中，人FcyRIIA基因包含多態性，其中多態性選自131His低應答者多態性和131Arg高應答者多態性。在具體的實施方案中，Fe YRIIA多態性為131His低應答者多態性。在一個實施方案中，Fe Y RIIIA基因為特定等位基因變體，其中等位基因變體選自158Val變體和158Phe變體。在具體的實施方案中，Fe Y RIIIA等位基因變體為158Val 變體。在一個實施方案中，低親和力人Fe YR基因選自Fe yRIIB、FcyRIIC, FcyRIIIB基因及其組合。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIB基因包含胺基酸置換，其中所述置換選自232Ile或232Thr置換。在另一個具體的實施方案中，胺基酸置換為232Ile置換。在具體的實施方案中，Fe Y RIIIB基因為特定等位基因變體，其中所述等位基因變體選自NAl變體和NA2變體。在另一個具體的實施方案中，Fe Y RIIIB等位基因變體為NA2變體。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe Y RIIIA、FcyRIIIBa 鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIVa鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因被至少一個低親和力人Fe YRa鏈基因替代。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIVa鏈基因和Fe Y RIIB α鏈基因被至少一個低親和力人Fe Y R α鏈基因替代。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIIBa鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因被至少一個低親和力人Fe Y R a鏈基因替代。在具體的實施方案中，至少一個低親和力人FcYRa鏈基因選自FcyRIIA、Fe Y RIIB,Fe y RIIC.Fc y RIIIA.Fc y RIIIB a鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少一個低親和力人Fe YRa鏈基因選自FcyRIIAa鏈基因、FcyRIIIAa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少一個低親和力人Fe Y R α鏈基因選自Fe Y RIIB、FcyRIIC, FcyRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，低親和力小鼠Fe Y R基因被人Fe Y RIIA α鏈基因和人Fe Y RIIIA α鏈基因替代。在另一個具體的實施方案中，低親和力人Fe Y RIIA和Fe YRIIIAa鏈基因包含變體，其中Fe Y RIIA α鏈基因包含131把8變體並且？(￥1 11從(1鏈基因包含158Val變體。在另一個具體的實施方案中，低親和力小鼠Fe YRa鏈基因被下列低親和力人Fe YRa鏈基因替代Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和FcyRIIIB0在另一個具體的實施方案中，低親和力人Fe Y RIIB α鏈基因和Fe Y RIIIB a鏈基因包含變體，其中Fe YRIIBa鏈基因包含232Ile變體並且Fe Y RIIIB α鏈基因包含NA2變體。在一個實施方案中，遺傳修飾包括小鼠和人染色體I的共線(syntenic)基因組序列的替代。在具體的實施方案中，遺傳修飾包括包含低親和力人Fe Y R基因的基因組片段對包含內源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因組片段的替代。在另一個具體的實施方案中，來自染色體1:172，889，983至染色體1:172，989，911的小鼠基因組被包含人染色體
I 161，474，729至染色體1:161，620，458的人基因組片段替代。在一個方面，提供了遺傳修飾的細胞、非人胚胎或非人動物，其中遺傳修飾包括一個或多個內源低親和力受體α鏈基因的敲除、包含一個或多個人Fe Y Ra鏈基因的附加體的存在。在具體的實施方案中，所述細胞、胚胎或動物表達功能性FcR Y鏈。在具體的實施方案中，附加體為微小染色體。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈對於所述細胞、胚胎或動物是內源的。在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，包括用低親和力人Fe Y Ra鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y Ra鏈基因，小鼠包含小鼠FcRy鏈基因，並且小鼠表達功能性人低親和力Fe Y R受體。在一個實施方案中，功能性低親和力Fe Y R受體在其中低親和力Fe YR受體在人中表達的細胞類型上表達。在具體的實施方案中，功能性人低親和力Fe Y R受體為Fe YRIIIA並且Fe Y RIIIA在NK細胞上表達。在一個實施方案中，小鼠包含兩個小鼠Fe YRa鏈基因的缺失。在另一個實施方案中，小鼠包含3個小鼠Fe Y R α鏈基因的缺失。在一個實施方案中，小鼠包括用至少I個人Fe YRa鏈基因對3個小鼠Fe Y R a 鏈基因的替代。在另一個實施方案中，小鼠包括用至少I個FcYRa鏈基因對2個小鼠FcyRa鏈基因的替代。在具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人Fe Y Ra鏈基因對3個小鼠Fe YRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用3個人Fe Y Ra鏈基因替代3個小鼠Fe Y Ra鏈基因。在另一個具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人Fe Y Ra鏈基因對2個小鼠Fe YRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用至少3個人FcyRa鏈基因替代2個小鼠Fe Y Ra鏈基因。在一個實施方案中，低親和力小鼠FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIB、Fe Y RIV、FcyRIIIa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe y RIIC, Fe y RIIIA, Fe y RIIIB α鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、FeyRIII冬(X鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人Fe YRa鏈基因選自Fe YRIIB，Fc YRIIC、Fc YRIIIBa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，用至少I個人Fe YRa鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y RIV a鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因。在一個實施方案中，用至少I個人Fe Y Ra鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y RIV α鏈基因和Fe Y RIIB α鏈基因。在一個實施方案中，用至少I個人FcyRa鏈基因替代低親和力小鼠Fe YRIIBa鏈基因和Fe Y RIIIB α鏈基因。在具體的實施方案中，至少I個人Fe YRa鏈基因選自Fe yRIIA、Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIA、FcyRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少I個人Fe Y R α鏈基因選自Fe Y RIIA、FcYRIIIAa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少I個人FcyRa鏈基因選自Fe YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，用下列人FcYRa鏈基因=FcyRIIA和Fe Y RIIIA替代小鼠α鏈基因。在另一個具體的實施方案中，用下列人Fe YRa鏈基因？0^1 118、？(3￥1 11(和？(3￥1 1118替代小鼠α鏈基因。 在一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y Ra鏈和小鼠FcRy鏈亞基的遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠在選自嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、血小板、朗格漢斯細胞、樹突細胞、NK細胞、肥大細胞、B細胞、T細胞及其組合的細胞上表達人FcYRa鏈。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、血小板、樹突細胞、朗格漢斯細胞及其組合的細胞上表達人Fe Y RIIA a
鏈。在一個實施方案中，小鼠能夠進行通過表達的人FcyRIlAa鏈起始或介導的吞噬作用、ADCC和細胞活化。在一個實施方案中，小鼠表達在選自巨噬細胞、NK細胞、單核細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、至少一種T細胞類型及其組合的細胞上表達人Fe Y RIIIA α鏈。在一個實施方案中，小鼠能夠進行通過在NK細胞上表達的人FcyRin^a鏈介導的ADCC。在具體的實施方案中，小鼠展示響應於包含人Fe的抗體的hFc Y RIIIA-介導的 ADCC。在一個實施方案中，小鼠表達人Fe YRIIAa鏈和人FcyRIIIAa鏈。在一個實施方案中，人Fe YRIIAa鏈在血小板上表達並且人Fe Y RIIIA α鏈在NK細胞上表達。在一個實施方案中，小鼠能夠進行由包含人Fe的抗體介導的ADCC，其中所述介導通過在輔助細胞表面上表達的人Fe Y RIIA α鏈或人Fe Y RIIIA α鏈來進行。在一個實施方案中，人FcyRIIAa鏈不在血小板上表達。在其中人Fe Y RIIA α鏈不在血小板上表達的具體實施方案中，小鼠缺失或實質上缺失可操作地連接於人基因組中的人Fe Y RIIAa鏈的人啟動子序列。在一個實施方案中，小鼠在選自B細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞及其組合的細胞上表達人Fe Y RIIB a鏈。在具體的實施方案中，小鼠在B細胞和肥大細胞上表達人Fe Y RIIB α鏈。在另一個具體的實施方案中，小鼠能夠進行通過表達的人Fe Y RIIB α鏈介導的免疫複合物的吞噬作用。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、血小板、樹突細胞、朗格漢斯細胞及其組合的細胞上表達人Fe Y RIIC α鏈。在具體的實施方案中，小鼠能夠進行通過表達的人Fe YRIICa鏈啟始的吞噬作用、ADCC和細胞活化。在一個實施方案中，小鼠在嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞上表達人FcyRinpa鏈。在具體的實施方案中，小鼠能夠進行細胞活化、吞噬作用、ADCC和脫粒，其中活化、吞噬作用、ADCC和脫粒通過表達的人FcyRI丨丨Pa鏈介導。在一個方面，提供了包含內源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基因的缺失和人Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RI 1C、Fe Y RIIIA和Fe y RIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠包含功能性小鼠FcR Y鏈基因。在一個實施方案中，小鼠包含由內源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因編碼的α 鏈的缺失和由人 Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc Y RIIC,Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 基因編碼的 a鏈的插入。在一個實施方案中，人？(^1 1從、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11從和Fe Y RII IBa鏈基因的插入位於小鼠基因組的隨機位置。 在一個實施方案中，人？(^1 1從、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11從和Fe Y RIIIBa鏈基因的插入位於內源小鼠低親和力Fe Y Ra鏈基因座。在一個實施方案中，小鼠在NK細胞和巨噬細胞上表達人Fe Y RIIIA。在具體的實施方案中，來自小鼠的脾細胞樣品的所有或大體上所有NK細胞表達人Fe Y RIIIA。在具體的實施方案中，來自小鼠的脾細胞樣品的所有或大體上所有巨噬細胞表達人Fe Y RIIIA0在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細胞、巨噬細胞及其組合的細胞類型上表達選自人Fe Y RIIA、人Fe YRIIIA及其組合的人Fe y R0在具體的實施方案中，小鼠在小鼠的脾細胞樣品的全部或大體上全部嗜中性粒細胞和巨噬細胞上表達人Fe Y RIIA和人
Fe Y RIIIAo在一個實施方案中，小鼠在來自小鼠的B細胞門控的脾細胞樣品的B細胞和B細胞的嗜中性粒細胞上表達人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIIB0在具體的實施方案中，小鼠在來自小鼠的B細胞門控的脾細胞樣品的全部或大體上全部B細胞和嗜中性粒細胞上表達Fe Y RIIIB 和 Fe Y RIIB0在一個實施方案中，小鼠還包含人源化⑶20基因。在一個實施方案中，還包含人源化CD20基因的小鼠在用包含Fe的抗-CD20結合蛋白處理後展示B細胞的(體內)耗盡。在一個實施方案中，所述耗盡存在於選自骨髓、血液、淋巴結、脾及其組合的區室中。在一個實施方案中，Fe為人Fe。在一個實施方案中，Fe為小鼠Fe。在一個實施方案中，抗-CD20結合蛋白為抗-CD20抗體。在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的細胞。在一個實施方案中，所述細胞選自胚胎幹細胞(ES)、多能細胞、誘導的多能細胞和全能細胞。在一個實施方案中，細胞選自小鼠細胞和大鼠細胞。在具體的實施方案中，細胞為ES細胞。在更具體的實施方案中，細胞為小鼠ES細胞。在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的非人胚胎。在一個實施方案中，非人胚胎選自小鼠胚胎和大鼠胚胎。在一個方面，提供了測定治療劑的功效的方法。在一個實施方案中，治療劑為包含人Fe的抗體(例如，單、雙、三、多特異性的)。在一個實施方案中，治療劑為人抗體。在一個實施方案中，功效為治療劑介導的細胞殺傷(例如，ADCC)的功效。在具體的實施方案中，人治療劑是包含人免疫球蛋白重鏈的Fe的融合蛋白。在一個實施方案中，給本文中描述的小鼠施用治療劑並且測量治療劑依賴性ADCC的水平。在一個實施方案中，通過給小鼠施用治療劑，隨後檢測(例如，從獲自動物的樣品(例如，血液)進行體外檢測)治療劑對表達FcyR的細胞上的人低親和力Fe Y R的結合來將小鼠用於評估治療劑的ADCC活性。在具體的實施方案中，從小鼠分離小鼠的輔助細胞，並且測試其在治療劑存在和不存在的情況下介導治療劑依賴性ADCC的能力。在一個方面，提供了用於確定低親和力Fe Y R是否與人疾病或障礙相關的方法，包括測定根據本發明的小鼠的與人疾病或障礙相關的性狀的步驟。在一個實施方案中，所述性狀為與一個或多個低親和力Fe Y R的功能的不存在或喪失相關的表型。在具體的實施 方案中，疾病或障礙為自身免疫疾病或障礙。在具體的實施方案中，自身免疫疾病或障礙選自類風溼關節炎(RA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barre症候群、硬化症、多發性硬化、Goodpasture』 s症候群、Wegener』 s肉芽腫病和實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)。在具體的實施方案中，小鼠包含低親和力Fe Y R中的多態性，並且性狀選自與大部分不具有多態性的人群相比較增強的介導ADCC的能力以及與大部分不具有多態性的人群相比較減小的介導ADCC的能力。在一個方面，提供了用於在小鼠中產生抗-人FcRa鏈抗體的方法，包括將根據本發明的小鼠與本文中描述的人FcR接觸。在一個實施方案中，識別人的FcR的抗體分離自小鼠。在另一個實施方案中，鑑定和克隆了編碼識別人FcR的抗體的全部或部分可變區的核酸序列。在一個方面，提供了用於測定抗-人FcR抗體將分子靶向表達FcR的細胞以吞噬靶分子的能力的方法，包括將本文中描述的小鼠與包含抗-人FcR抗體的試劑接觸，並且測量革G分子的吞曬。在一個方面，提供了用於在小鼠中產生針對抗原的抗體的方法，所述抗原在對於一種或多種Fe Y R為野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括將本文中描述的缺失小鼠低親和力FcR但表達Fe Y R Y鏈的小鼠與在對於一種或多種Fe Y R為野生型的小鼠中具有差免疫原性的抗原接觸，並鑑定識別所述差抗原性的抗原的抗體。在一個實施方案中，所述方法包括從小鼠分離抗體。在另一個實施方案中，鑑定和克隆了編碼抗體的全部或部分可變區的核酸序列。在一個方面，提供了用於產生能夠產生包含人可變區的抗體的小鼠的方法，包括將本文中描述的第一小鼠與第二小鼠交配的步驟，所述第二小鼠包含(a) —個或多個人免疫球蛋白可變區基因區段和一個或多個人恆定區基因；或(b)可操作地連接於小鼠恆定區基因的一個或多個人免疫球蛋白可變區基因區段，其中所述人基因區段在小鼠可變區基因區段的基因座上替代可變區基因區段。在一個實施方案中，第二小鼠(a)包含含有一個或多個人免疫球蛋白輕鏈可變區基因區段和人輕鏈恆定基因的轉基因和含有一個或多個人免疫球蛋白重鏈可變區基因區段和一個或多個人重鏈恆定基因的轉基因。在一個實施方案中，包含一個或多個人免疫球蛋白重鏈可變區基因區段的轉基因包兩個或更多個重鏈恆定基因並且能夠進行類別轉換(class switching)。在具體的實施方案中，小鼠包含失活的內源輕鏈基因座和/或失活的內源重鏈基因座。在具體的實施方案中，小鼠包含內源輕鏈基因座的缺失和/或內源重鏈基因座的缺失。在一個實施方案中，第二小鼠(b)分別在小鼠重鏈和輕鏈基因座上包含人重鏈和人輕鏈可變區基因區段。在一個方面，提供了用於選擇抗腫瘤抗體的方法，包括測定抗體介導ADCC的能力的步驟，其中通過測定由本文中描述的小鼠的細胞介導的ADCC來測試抗體介導ADCC的能力，如果抗體利用本文中描述的遺傳修飾的小鼠的細胞介導ADCC，則選擇該抗體。在具體的實施方案中，測定抗體對遺傳修飾的小鼠的細胞的結合，並且就其結合細胞上的人Fe Y R的能力選擇抗腫瘤抗體。在具體的實施方案中，人Fe Y R為低親和力Fe Y R0在一個實施方案中，抗腫瘤抗體通過與抗腫瘤抗體通過野生型小鼠的細胞介導ADCC的能力相比較的增強的通過小鼠的細胞介導ADCC的能力來進行鑑定。在具體的實施方案中，抗腫瘤抗體通過其通過NK細胞介導ADCC的能力來進行鑑定。在具體的實施方案中，所述NK細胞表達人Fe Y RIIIA。 在一個實施方案中，提供了用於選擇抗腫瘤試劑的方法，包括給第一非人動物施用包含人Fe或修飾的人Fe的試劑的步驟，其中第一非人動物按照本發明進行了遺傳修飾並且包含人腫瘤；給包含腫瘤的第二非人動物施用試劑的步驟；和測定第一非人動物和第二非人動物在施用試劑後延緩人腫瘤生長的能力，其中如果試劑在第一非人動物中但非在第二非人動物中展示增強的延緩人腫瘤生長的能力，則其被選擇為抗腫瘤試劑。在一個實施方案中，第一非人動物經修飾包含內源FcRa -亞基的缺失，並且經修飾包含選自 Fe YRiiAa -亞基、FcyRIIBa -亞基、-FcyRE^a 亞基、Fe Y RIl IA a -亞基、Fe YRIIIBa-亞基及其組合的人FcR a -亞基。在一個實施方案中，第二動物為野生型動物。在一個實施方案中，第一非人動物表達內源FcRy鏈。在一個實施方案中，第一非人動物表達功能性內源Fe YRI。在一個方面，提供了用於產生小鼠的方法，所述小鼠缺失低親和力小鼠FcY R，表達功能性 FcR Y 鏈並且包含編碼人Fe Y RIIA,Fe y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和 Fe y RIIIB的α鏈的基因，包括用人FcYRa鏈在小鼠FcYRa鏈基因座上替代低親和力小鼠FcyRa鏈的步驟。在一個實施方案中，第一步驟包括缺失內源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因的α鏈和插入人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的α鏈；第二步驟包括將人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe Y RIIIB基因的α鏈插入由第一步驟產生的小鼠的基因組；其中所述小鼠包含功能性小鼠FcRy鏈基因.在具體的實施方案中，第二步驟的人Fe Y RIIB、FcyRIIC和Fe Y RIIIB基因的α鏈插入在相對於第一步驟的人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的a鏈的5』。在一個方面，提供了用於測定人治療劑在非靈長類動物中的細胞殺傷的方法，包括將細胞、非人胚胎或非人動物與包含人Fe的人治療劑接觸的步驟，其中所述細胞、胚胎或動物包含功能性FcR Y鏈並包含一個或多個人Fe Y Ra鏈對一個或多個內源低親和力FcyRa鏈基因的替代，以及測定人治療劑通過細胞、胚胎或動物的低親和力人Fe Y R介導細胞殺傷的能力。在一個實施方案中，非靈長類動物為小鼠。在具體的實施方案中，內源小鼠Fe y Ra 鏈基因 Fe Y RIIB、Fc Y RIV 和 Fe Y RIII 被人Fe γ Ra 鏈基因 Fe Y RIIA、Fc Y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIB 替代。在一個實施方案中，細胞選自B細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞及其組合。在具體的實施方案中，細胞為NK細胞並且測定通過人或人源化抗體產生的NK細胞介導的ADCC。在具體的實施方案中，低親和力人FcyR為人Fe Y RIIIA0在一個方面，提供了用於測定治療劑依賴性血栓形成的方法，包括將在血小板上表達人Fe Y RIIA的第一非人動物與治療劑接觸；將不在血小板上表達人Fe Y RIIA的第二非人動物與所述治療劑接觸；在第一非人動物和第二非人動物中測量治療劑依賴性血栓形成的量；和測定治療劑依賴性血栓形成的差異。在一個實施方案中，非人動物選自小鼠和大鼠。
在一個實施方案中，將治療劑依賴性血栓形成的測定的差異用於鑑定與向人施用該治療劑相關的風險。在一個實施方案中，測定的差異導致治療劑給有此需要的人患者的施用的改變。發明詳述本發明不限於描述的特定方法和實驗條件，因為這樣方法和條件可改變。本文中使用的術語僅為了描述特定的實施方案，無意起限制作用，因為本發明的範圍將僅由權利要求限定。除非另外定義，否則本文中使用的全部技術和科學術語具有與本發明所屬領域內的技術人員通常理解的相同的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用於實施或測試本發明，但現在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物通過引用方式全文併入本文。短語「靶向構建體」包括含有靶向區域的多核苷酸分子。靶向區域包含與靶細胞、組織或動物中的序列實質上同源的序列並且提供了靶向構建體至細胞、組織或動物的基因組內的位置的整合。在具體的實施方案中，靶向構建體還包括特定目標核酸序列或基因、選擇標記、控制和/或調節序列以及允許通過蛋白質的外源添加介導的重組的其它核酸序列，所述蛋白質幫助或促進牽涉這類序列的重組。在另一個具體的實施方案中，靶向構建體還包含目標基因，其中所述目標基因為編碼與由內源序列編碼的蛋白質具有相似功能的蛋白質的異源基因。除非另外明確地指出，否則術語「替代」包括其中將DNA序列以這樣的方式置於細胞的基因組內用異源序列(例如，小鼠中的人序列)在基因組序列的基因座上替代基因組中的序列。這樣放置的DNA序列可包括作為用於獲得這樣放置的序列的源DNA的一部分的一個或多個調控序列(例如，啟動子、增強子、5』-或3』-非翻譯區等)。例如，在不同的實施方案中，替代是異源序列對內源序列的置換，該置換導致基因產物從這樣放置的DNA序列(包括異源序列)產生，但不表達內源序列；替代是用DNA序列置換內源基因組序列，所述DNA序列編碼具有與內源基因組序列編碼的蛋白質相似的功能的蛋白質(例如，內源基因組序列編碼低親和力小鼠Fe Y R受體，DNA片段編碼一種或多種人低親和力Fe Y R受體，例如 Fe Y RIIC 和 / 或 Fe Y RIIIB)。術語「Fe Y R」包括Fe、例如IgG免疫球蛋白的Fe部分的受體。Fe Y R基因包括α鏈，所述α鏈在細胞表面上表達並且用作配體結合結構域，並與FcR Y鏈的同二聚體或FcRy鏈與δ鏈的異二聚體結合。存在幾種不同的FcyR基因並且可根據在免疫複合物中與IgG的優先結合將它們分成低親和力和高親和力類型。人的低親和力Fe Y R基因包括Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和Fe y RIIIB,並且已在患有自身免疫疾病的人受試者中描述了在大多數此類基因內天然存在的遺傳差異或多態性。在閱讀本公開內容後本領域技術人員將認識到基因組中的一個或多個內源低親和力Fe Y R基因(或全部)可被一個或多個異源低親和力Fe Y R基因(例如，變體或多態性例如等位基因形式、來自另一物種的基因、嵌合形式等)替代。術語「等位基因變體」包括基因的正常序列的變異，其導致同一基因的一系列不同形式。所述不同形式可在來自基因的蛋白質序列中包含至多20個胺基酸的差異。例如，等位基因可被理解為相同物理基因基因座上的可選擇的DNA序列，其可以導致或可以不導致不同的性狀(例如，可遺傳的表型特徵)、例如對某些疾病或病況的易感性，其不導致相同基因的其它等位基因或在不同程度上導致其它等位基因。
「輔助細胞」包括參與免疫應答的效應子功能的免疫細胞。示例性免疫細胞包括淋巴樣或骨髓樣來源的細胞，例如淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、血小板、郎格漢斯細胞、樹突細胞、肥大細胞等。輔助細胞通過在它們的表面上表達的受體例如FcR進行免疫系統的特定功能。在具體的實施方案中，輔助細胞能夠觸發通過在細胞表面上表達的FcR例如低親和力Fe Y R介導的ADCC。例如，表達FcR的巨噬細胞參與吞噬作用和破壞抗體包被的細菌。輔助細胞還可能能夠釋放介導其它免疫過程的試劑。例如，肥大細胞可被結合至FcR的抗體激活以在感染的部位釋放顆粒例如炎症分子(例如，細胞因子)。在不同的其它實施方案中，FcR在輔助細胞上的表達可受其它因子(例如，細胞因子)調節。例如，Fe Y RI和Fe Y RIII表達可通過利用幹擾素-Y (IFN- Y )的刺激誘導。小鼠和人FcR免疫球蛋白的Fe區(即，恆定區)的受體(FcR)在免疫應答的調節中起著重要作用。FcR存在於宿主免疫系統的輔助細胞上以有效地除去被抗體結合的外源抗原。FcR也在平衡免疫系統的輔助細胞的激活和抑制應答中起著重要作用。FcR參與巨噬細胞的吞噬作用、肥大細胞的脫粒、抗體-抗原複合物的攝取和免疫應答的調節以及其它免疫系統過程。在小鼠和人中，不同的FcR在不同輔助細胞的表面上差異性表達，所述輔助細胞各自對於存在於表達的抗體庫中的免疫球蛋白同種型是特異性的。例如，免疫球蛋白G(IgG)抗體通過IgG受體(Fe Y R)介導效應子功能。FcyR已被分成3類高親和力激活性Fe Y RI (CD64)、低親和力抑制性FcyRII (CD32)和低親和力激活性FcyRIII (CD16)。雖然每一類都存在於小鼠和人中，但它們所存在於的免疫細胞的同種型和亞組的數目不同。例如，Fe Y RIIA和Fe Y RIIIB在人的輔助細胞上表達但據報導不存在於小鼠中。此外，不同IgG同種型(例如，IgGl)對每一種Fe Y R的親和力在人和小鼠中不同。通過Fe Y R的細胞信號轉導的激活或抑制和與抗體對Fe Y R的結合相關的效應子功能據認為由Fe Y R的細胞內結構域的特定序列基序或共受體(co-receptor)的亞基的特定序列基序介導。激活受體最常見地與包含免疫受體基於酪氨酸活化基序(ITAM)的常見Y鏈(FcRy鏈)相關。ITAM包含約9-12個胺基酸的特定序列，該序列包括響應於抗體對FcR的結合而被磷酸化的酪氨酸殘基。磷酸化導致信號轉導級聯。已報導了缺失編碼FcR Y鏈的基因的小鼠(FcRy鏈KO)(例如，參見Takai等人(1994)FcR Y chainDepletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell 76:519-529;vanVugt 等人(1996)FcR y-chain Is Essential for Both Surface Expression andFunction of Human Fe γ RI (CD64) In Vivo, Blood 87 (9) : 3593-3599 ;和 Park 等人(1998)Resistance of Fe Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin.Invest. 102(6) :1229-1238) 0 FcRy鏈據報導為大多數FcR的正確表面表達和功能(例如，信號轉導、吞噬作用等)所必需的；根據一些報導FcRy鏈KO小鼠缺失FcyRI。然而，其它報導顯示FcR Y鏈KO小鼠確實在某些輔助細胞的表面上表達Fe Y RI，並且表達的Fe Y RI據報導顯示具有功能，功能在於其在表達的FcR Y鏈不存在的情況下在小鼠中結合 IgG (Barnes 等人(2002) Fe Y RI-Deficient Mice Show Multiple Alterations toInflammatory and Immune Responses, Immunity 16:379-389)。相反地，Fe y RIIB是在其細胞質結構域中包含免疫受體基於酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的抑制性受體。與ITAM—樣，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸殘基的序列基序。然 而，在ITM的磷酸化後的下遊事件導致免疫細胞功能的抑制而非激活。Fe Y RIIB缺陷型小鼠據報導展示與野生型小鼠相比較增強的抗體應答(Takai等人(1996) Augmented humoraland anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature379:346-349),此為支持Fe y RIIB作為B細胞抗體應答的下遊調節劑的觀察。在人中，FcyRIIA,FcyRIIB, FcyRIIC, Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 被認為是經典低親和力Fe YR基因並且一起位於相同染色體上(Su等人(2002)Genomic organizationof classical human low-affinity Fe y receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple
I): S51-S56)。這些基因展示出幾個與獨特表型例如受體的配體結合和功能的改變相關的多態性。一些多態性與自身免疫疾病例如系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風溼關節炎(RA)和多發性硬化(MS)相關。針對不同的人FcyRQiFcyR)的轉基因小鼠已被開發並且用作疾病模型、產生高親和力抗體、測試治療性抗體引發特異性細胞應答的能力、篩選緩解異常免疫應答的化合物(例如，參見Heijnen等人(1996)A Human FcgRI/CD64Transgenic Model for InVivo Analysis of(Bispecific)Antibody Therapeutics, J.Hematother. 4:351-356;Heijnen 和 van de Winkel(1996)Antigen Targeting toMyeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced antibody Responses inTransgenic, J. Clin. Invest. 97(2) :331-338;美國專利 No. 6，111，166、6，676，927、7，351，875,7, 402，728 和 7，416，726)。儘管FcR在提供免疫系統的抗體與輔助細胞之間的橋梁中起著重要作用，但目前仍然不存在其中所有低親和力hFc Y R都表達的模型系統。其中所有低親和力hFc Y R共表達的小鼠(包括缺失內源小鼠Fe YR的小鼠)在不同的實施方案中可用於精確地反映人抗體治療劑的效應，包括ADCC介導的效應。這樣的小鼠可在用於治療人疾病例如RA、I型糖尿病、SLE和自身免疫性的治療性抗體的工程改造、分析和評估中用作至關重的工具提供能夠實現人的免疫過程的更精確評估(特別地在測試人抗體治療劑的情景中)的動物模型。小鼠還可以是具有低親和力受體的細胞的有價值的來源，所述細胞可在體外測定中用於評估結合低親和力受體的治療劑的治療劑依賴性細胞殺傷，並因此而被用於鑑定有用的人治療劑。內源低親和力Fe Y R基因缺陷型小鼠提供了不表達內源低親和力小鼠Fe Y R基因但表達內源小鼠FcRy鏈的遺傳修飾的非人動物。在不同的實施方案中，FcRy鏈以與野生型小鼠中相同或大體上相同的分布(即，在細胞類型中)和水平在小鼠中表達。內源低親和力Fe YR基因可在免疫細胞的表面上表達或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達。用於產生不表達內源低親和力小鼠Fe Y R基因的非人動物的遺傳修飾通過使用小鼠為例子來方便地說明。可以以多種方式，特別是實施方案已在本文中進行了描述的方式產生根據本發明的遺傳修飾的小鼠。 圖I中(頂部)提供了顯示FcyR基因在內源基因座中的排列的低親和力小鼠Fe Y R基因基因座的示意圖(未按比例的)。如圖所示，低親和力小鼠Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII —起緊密地存在於一條染色體上。這些基因中的每一個基因包含負責結合抗體分子的Fe部分的α鏈或配體結合結構域。缺失編碼內源低親和力Fe YR基因的α鏈的核苷酸序列的遺傳修飾的小鼠可通過本領域已知的任何方法來產生。例如，可製備缺失低親和力小鼠Fe YRa鏈基因的具有選擇標記基因的靶向載體。圖I舉例說明了被靶向構建體靶向的小鼠基因組(底部)，所述構建體具有包含內源低親和力Fe Y Ra鏈基因座的上遊序列的5』同源臂，後接藥物選擇盒(例如，側翼連接有IoxP序列的新黴素抗性基因)和包含內源低親和力FcYRa鏈基因座的下遊序列的3』同源臂。於基因座上同源重組後，內源低親和力FcYRa鏈基因座被藥物選擇盒替代(圖I的底部)。內源低親和力FcYRa鏈基因基因座因此被缺失，從而產生不表達內源低親和力小鼠FcYRa鏈基因的細胞或非人動物。可作選地通過隨後添加重組酶(例如，通過Cre處理)除去藥物選擇盒。在不同實施方案中，遺傳修飾小鼠以使內源低親和力小鼠Fe YRa鏈基因失去功能，產生展示免疫應答的缺陷的小鼠，從而使得小鼠對於評估內源低親和力小鼠Fe Y R基因在正常和紊亂的免疫功能、IgG-介導的過程以及自身免疫疾病中的協同以及單獨的作用是有用的。在不同的實施方案中，修飾內源低親和力小鼠Fe YR基因的α鏈但非FcRy鏈，避免了需要FcRy鏈以進行表面表達和功能的其它內源FcR基因(例如，高親和力Fe Y RI)的潛在減少，從而維持通過Y鏈依賴性過程介導的各種其它免疫功能和過程。根據一些方面，FcR Y鏈缺陷型小鼠缺失Fe Y RIII和Fe Y RI的表面表達。然而，已報導在FcR Y鏈缺陷型小鼠的細胞表面上檢測到Fe Y RI，所述Fe y RI據報導具有至少部分功能。相反地，根據本發明的小鼠包含未修飾的內源FcRy鏈，其保持天然細胞表面表達模式和需要FcR Y鏈的其它FcR基因的細胞功能。在不同的實施方案，本發明的小鼠顯示了優於其它Fe Y R基因-缺陷小鼠的有利方面，所述有利方面在於它們所具有的遺傳修飾導致不完全貢獻於低親和力Fe Y R基因的其它免疫功能所必需的其它基因的維持。例如，通過功能性FcR Y鏈，其它Y鏈依賴性蛋白(例如，Fe Y RI)將能夠與FcR Y鏈結合併且在免疫應答中參與效應細胞功能。在根據本發明的各種遺傳修飾的小鼠中，據認為維持此類功能(歸因於功能性FcRy鏈的存在)同時缺失內源低親和力Fe Y R基因(一個或多個a -亞基)使得能夠更精確地闡明FcR在自身免疫中的作用。低產和力Fe Y R人源化小鼠
提供了表達低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的非人動物。低親和力人Fe Y R基因可在動物免疫系統的輔助細胞的表面上表達或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達。在不同的實施方案中，遺傳修飾包含一個或多個低親和力小鼠Fe Y R基因的功能性α鏈的缺失，並且在一些實施方案中包含含有以兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個低親和力人Fe Y R α亞基基因的替代的其它修飾，其中非人動物表達功能性小鼠FcRy鏈基因。還提供了遺傳修飾的非人胚胎、細胞和用於產生非人動物、非人胚胎和細胞的靶向構建體。提供了用於製備表達人Fe Y R基因(包括特定多態性形式或等位基因變體(例如，單個胺基酸的差異))的小鼠的組合物和方法，包括用於製備從人啟動子和人調控序列表達此類基因的的小鼠的組合物和方法。所述方法包括選擇性地使內源低親和力小鼠FcyR基因失去功能(例如，通過其α鏈的缺失)以及在內源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座上利用低親和力人Fe Y R基因的α鏈在小鼠中表達低親和力人Fe Y Ra-亞基基因。通過缺失一個或多個α鏈基因但非FcR Y鏈基因來產生低親和力小鼠Fe Y R基因的 缺失。所述方法選擇性地使一個或多個內源低親和力Fe YRa鏈基因失去功能而同時保留功能性內源FcR Y鏈。在不同的實施方案中，內源Fe YRa鏈替代方法對動物中的天然Fe Y R介導的信號轉導產生的破壞相對最小，因為Fe YRa鏈的基因組序列在單個片段中被替代，從而通過包含必需調控序列保留正常功能性。因此在這樣的實施方案中，FcYRa鏈修飾不影響其它依賴於功能性FcR Y鏈分子的內源FcR。此外，在不同實施方案中，修飾不影響包括FcyRa鏈和內源FcR Y鏈的功能性受體複合物的裝配，所述複合物據認為是一些Fe Y R a鏈在細胞表面上的正確表達以及由激活的受體產生的下遊信號轉導所需要的。因為FcRy鏈未缺失，在不同實施方案中，包含人Fe Y Ra鏈基因對內源Fe YRa鏈基因的替代的動物應當能夠通過IgG免疫球蛋白的Fe部分對存在於輔助細胞表面上的人Fe YRa鏈的結合來處理來自抗體的正常效應子功能。在圖4中(上部)提供了缺失的內源低親和力小鼠FcyR基因的示意圖(未按比例的)。如圖所示，通過用包含人低親和力人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的基因組片段以靶向構建體(人Fe Y RIIIA-IIA靶向載體)將人低親和力人Fe Y R基因Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA插入缺失的內源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座。這些基因的每一個基因包含負責結合抗體分子的Fe部分的人Fe Y R基因的α鏈或配體結合結構域。在內源低親和力小鼠Fe Y R基因座上表達低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的小鼠可通過本領域內已知的任何方法來製圖。例如，可製備引入低親和力人FcyR基因(例如，和選擇標記基因的靶向載體。圖4(頂部)舉例說明了包含內源低親和力Fe YR基因座的缺失的小鼠基因組。如圖所示，靶向構建體包含含有內源低親和力小鼠FcyR基因座的上遊序列的5』同源臂、後接藥物選擇盒(例如，兩側連接有IoxP序列的潮黴素抗性基因)、包含人Fe Y RIIA基因、人HSP76基因和人Fe Y RIIIA基因的基因組片段以及包含內源低親和力小鼠Fe YR基因座的下遊序列的3』同源臂。於缺失的基因座上同源重組後，藥物選擇盒被包含在靶向載體中的序列替代(圖4的底部)。內源低親和力Fe Y R基因基因座因此被低親和力人Fe Y R基因替代，產生表達低親和力人Fe Y R基因的細胞或動物。可任選地通過隨後添加重組酶(例如，通過Cre處理)除去藥物選擇盒。
為了在血小板上表達hFc y RIIA,靶向構建體人hFc y RIIA-IIA靶向載體包含延長的序列，該序列包括例如與人基因組中的hFc Y RIIA基因可操作地連接的全部或大體上全部人啟動子區域。為了阻止hFc Y RIIA在血小板上表達，靶向構建體缺失可操作地連接於人的hFc Y RIIA基因的全部或大體上全部啟動子區域。可使用對於利用兩個人Fe Y R基因的替代所描述的相似技術實現對嵌合基因座的其它修飾(圖4的底部)。用兩個人Fe Y R基因替代內源低親和力Fe Y R基因基因座的修飾還可提供用於整合其它低親和力人Fe YR基因的起始點。例如，圖6(頂部)中提供了用兩個人低親和力Fe Y R基因替代的內源低親和力Fe Y R基因座的示意圖(未按比例的)。如圖所示，通過另一個具有包含低親和力人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe y RIIIB基因的基因組片段的靶向構建體(人FcyRIIB-IIIB-IIC靶向載體)將低親和力人Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fc Y RIIC和Fe y RIIIB插入修飾的內源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座。這些基因的每一個基因包含負責結合抗體分子的Fe部分的人FcyR基因的α鏈或配體結合結構域。
在內源低親和力小鼠Fe Y R基因座上表達5個低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的小鼠可通過本領域已知的任何方法來產生。例如,可製備引入低親和力人Fe Y R基因(例如，Fe yRIIB、Fe yRIIC^PFcyRIIIB)的具有選擇標記基因的靶向載體。圖6(頂部)舉例說明了包含以2個低親和力人Fe Y R基因對內源低親和力Fe Y R基因座的替代的小鼠基因組。如圖所示，靶向構建體包含含有內源低親和力小鼠Fe Y R基因座的上遊序列的5』同源臂、後接藥物選擇盒(例如，兩側連接有IoxP序列的新黴素抗性基因)、包含人Fe Y RIIB基因、人Fe Y RIIIB、人HSP77基因、人Fe Y RIIC基因的基因組片段，後跟含有存在於內源基因座上的低親和力人Fe Y RIIIA基因的下遊序列的3』同源臂。於修飾的基因座上同源重組後，人Fe Y RIIB、Fe YRIIIB和Fe y RIIC基因通過靶向載體中包含的序列被插入先前存在於內源低親和力Fe Y R基因基因座上的人Fe Y RIIIA和Fe Y RIIA基因的5』(圖6的底部)。因此對修飾的內源低親和力Fe Y R基因基因座進一步修飾以整合3個額外的低親和力人Fe Y R基因，從而產生表達5個低親和力人Fe Y R基因的細胞或動物。藥物選擇盒可任選通過隨後添加重組酶(例如，通過Cre處理)來除去。圖6(底部分)顯示所得的基因座的結構，其將表達可在動物的免疫系統的輔助細胞的表面上檢測到的並且適當時與內源FcRy鏈獨立結合的5個低親和力人Fe Y R基因。FcyR缺陷型小鼠和Fe Y R人源化小鼠的實驗模型不表達內源低親和力小鼠Fe Y R基因的遺傳修飾的非人動物是有用的，其用於例如闡明單個低親和力Fe Y R基因在免疫應答中的各種功能、通過細胞介導的免疫(例如，ADCC)測量人治療性抗體的功效、測定Fe Y R在免疫疾病或障礙中的作用、用作免疫疾病或障礙的模型、產生抗一種或多種Fe Y R蛋白的抗體、以及用作產生其它目標遺傳修飾的小鼠的交配配偶。在一個實施方案中，根據本發明的小鼠可用於通過給不表達低親和力Fe Y R基因的小鼠施用試劑來測定這樣的小鼠的細胞毒性效應的喪失(與野生型小鼠相比較)，其中已知所述試劑在野生型小鼠中觸發Fe YR-依賴性細胞毒性效應。在一個實施方案中，將腫瘤細胞植入本發明的小鼠，在隨後的一段時間後，用特異於在腫瘤細胞表面上表達的抗原的抗體注射小鼠。抗體的同種型在注射前是已知的並且通過與在野生型動物中觀察到的ADCC相比較來分析動物的Fe Y R-依賴性ADCC的減弱。在另一個方面，可將內源低親和力受體缺陷型小鼠與其它免疫缺陷型小鼠組合(例如，通過交配)以產生自身免疫疾病的體內模型。例如，重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠在本領域常規地用作用於研究免疫系統的模型生物。SCID小鼠具有受損的產生T或B淋巴細胞或激活補體系統的一些組分的能力，並且不能高效地抵抗感染、排斥腫瘤和排斥移植物。可將本發明的低親和力Fe Y Ra -亞基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以確定宿主動物響應於抗體治療劑(例如，抗腫瘤抗體)的施用的細胞耗盡，這可測定ADCC和補體依賴的細胞毒性(CDC)在體內腫瘤細胞耗盡中的作用。在另一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y R基因對內源低親和力Fe Y R基因的替代的遺傳修飾的非人動物。此類動物對於研究完全人抗體和hFc Y R介導的ADCC的藥代動力學是有用的。此外，已顯示人Fe Y R基因展示與疾病(例如，SLE, RA, WegenerJ s肉芽腫病、Guillain-Barr6症候群和多發性硬化)相關的多態性或等位基因變體。因此，包含人Fe Y R基因的特定等位基因或多態性形式對內源低親和力Fe Y R基因的替代的遺傳修飾的非人動物可用於在動物中研究人自身免疫疾病和與多態性相關的性狀。在具體的實施方案中，人Fe Y R基因的等位基因形式與對於人IgG的增強的功效相關。·在另一個具體的實施方案中，測定人低親和力Fe Y R多態性對人抗體治療劑的功效的影響。在具體的實施方案中，給包含人Fe YR的第一多態性的第一人源化小鼠施用抗腫瘤抗體，也給包含人Fe YR的第二多態性的第二人源化小鼠施用抗腫瘤抗體，其中第一和第二小鼠各自包含人腫瘤細胞；並且在第一小鼠和第二小鼠中評估抗腫瘤抗體的抗腫瘤活性。在具體的實施方案中，由醫生基於抗腫瘤抗體在第一小鼠和第二小鼠中的功效的評估選擇關於治療具有第一或第二多態性和具有相應於人腫瘤細胞的腫瘤的人的治療選擇。人Fe Y R基因的適當多態性包括本領域已知的全部多態性。對於人Fe Y RIIA基因，多態性包括例如通過T細胞響應於IgG增殖的能力報導的高應答者表型和低應答者表型。高應答者多態性的特徵在於位點131上的精氨酸殘基(131Arg)，而低應答者的特徵在於位點131上的組氨酸殘基(131His)。在具體的實施方案中，人Fe y RIIA序列包含131His多態性。人FcYRIIAa鏈的代表性蛋白質序列示於SEQ ID N0:32中。人FcyRIIB基因的單核苷酸置換在配體結合結構域(α鏈)中導致錯義置換並且推定其影響IgG的Fe部分結合細胞表面上的Fe Y RIIB的α鏈的結合能力。例如，已顯示小鼠的Fe YRIIB基因的跨膜結構域內的位點232上的蘇氨酸對異亮氨酸的置換(Ile232Thr)削弱了受體的信號轉導能力。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIB基因包含異亮氨酸變體(232Ile)。人FcyRIIBa鏈的代表性蛋白質序列示於SEQ ID N0:33中。有人提出人Fe Y RIIIA基因的等位基因變體牽涉SLE和RA的易感性。該等位基因變體包括位點158上苯丙氨酸對纈氨酸的置換(Vall58Phe)。纈氨酸等位基因變體(158Val)經表徵具有比苯丙氨酸等位基因變體(158Phe)更高的對IgGl和IgG3的親和力。已有人提出158Phe等位基因變體導致減少的免疫複合物的清除。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIIA基因包含158Val等位基因變體。人Fe Y RIIIAa鏈的代表性蛋白質序列示於SEQ ID NO:35 中。人Fe Y RIIIB基因的等位基因變體包括嗜中性粒細胞抗原I(NAl)和嗜中性粒細胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出這些等位基因變體牽涉輸血反應、同種免疫嗜中性白血球減少症(alloimmune neutropaenia)、SLE和Wegener’s肉芽腫病。NA2等位基因變體的特徵在於減小的介導吞噬作用的能力。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIIB基因包含NA2等位基因變體。人Fe YRIIIB α鏈的代表性蛋白質序列示於SEQ ID Ν0:36中。在一個方面，遺傳修飾的非人動物對於最優化通過治療性抗體的Fe部分觸發的Fe Y R介導的功能是有用的。可利用本領域已知的任何方法修飾抗體的Fe區域。例如，可修飾Fe部分(例如，CH2和CH3結構域)中的胺基酸殘基以選擇性增強對人Fe Y RIIIA的結合親和力。因此，所得的抗體應當具有增強的Fe Y RIIIA依賴性ADCC。在具體的實施方案中，將表達本發明的人Fe Y RIIIA的動物用於評估修飾的人抗體的增強的ADCC能力(通過給動物施用修飾的人抗體，檢測(例如，體外)抗體對表達Fe YRIIIA的細胞的結合和將觀察到的ADCC活性與從野生型動物的測定觀察到的ADCC活性相比較)。
實施例實施例I:低親和力Fe Y R基因缺失型小鼠的產生構建用於引入內源低親和力小鼠Fe YR基因座的缺失的靶向構建體(下文中描述的)(圖I)。使用VELOC1GENE 技術(參見，例如，美國專利No. 6，586，251和Valenzuela 等人(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6) :652-659)製備革巴向構建體以修飾細菌人工染色體(BAC) RP23-395f6 (Invitrogen)。修飾RP23_395f6 BAC DNA以缺失內源低親和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因(包括每一個Fe Y R的α鏈)。簡而言之，分別利用引物mFcR5-up-l(5』-ACCAGGATATGACCTGTAGA G;SEQ ID NO:I)和 mFcR3_up-la(GTCCATGGGTAAGTAGAAAC A;SEQ ID NO:2)以及mFcR5-DN(ATGCGAGCTCATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCTTGCCCAATACTTAC; SEQ ID NO:3)和 mFcR3_DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGG A; SEQ ID NO:4)產生上遊和下遊同源臂。這些同源臂被用於產生缺失內源低親和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因的α鏈的盒。靶向構建體包括Iox化的新黴素抗性基因，其包含相對於內源基因座的5』和3』區域同源的序列的同源臂。內源Fe YRIIB基因的上遊和內源Fe YRIII基因的下遊的基因和/或序列(參見圖I)不被該靶向構建體修飾。使用在缺失區域外部和在靶向構建體內部的引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)來確認靶向缺失。使用針對 mFcR-up-detect(ATCCTGAGTA TACTATGACA AGA; SEQ ID NO: 5)和 PGK-up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C;SEQ ID NO:6)的引物通過 PCR 來確認缺失的基因座的上遊區域；使用引物 pA-DN-detect(CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO:7)和 mFcR-DN-detect (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO:8)來確認缺失的基因座的下遊區域。橫跨上遊缺失點的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示與存在於缺失點上的盒序列連續連接的FcyRIIB基因的下遊內源小鼠序列(包括在下面的括號內)(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA(SEQ ID NO:9)。橫跨下遊缺失點的核苷酸序列包括下列序列，其表示與Fe YRIII基因上遊的內源小鼠序列(包括在下面的括號內)連續的盒序列CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACTTA) (SEQ IDNO:10)。
通過將靶向BAC DNA(上文中描述的)電穿孔入小鼠ES細胞來產生Fe Y RIIB、Fe Y RIII和Fe Y RIV缺陷小鼠。通過Taqman 篩選和核型分析確認陽性ES細胞克隆。隨後將陽性ES細胞克隆用於植入雌性小鼠以產生一窩低親和力Fe Y R基因缺陷幼鼠。實施例2:低親和力Fe Y R基因缺陷型小鼠的表徵從Fe Y R缺陷型小鼠和野生型小鼠收穫脾，在無菌一次性袋中用IOmL的膠原酶-D灌注。隨後將每一隻包含單個脾的袋子置於Stomacher (Seward)中，在培養基環境中勻漿30分鐘。將勻漿的脾轉移至IOcm培養皿，在37° C溫育25分鐘。使用1:50稀釋度的O. 5MEDTA，利用移液器分離細胞，隨後在37° C再溫育另外5分鐘。隨後通過離心(IOOOrpm進行10分鐘)沉澱細胞,將紅細胞在4mL ACK緩衝液(Invitrogen)中裂解3分鐘。用RPMI-1640 (Sigma)稀釋脾細胞，再次離心。將沉澱的細胞重懸浮於IOmL RPMI-1640中，利用O. 2 μ m細胞濾過器進行過渡。 流式細胞術。利用下列綴合有螢光團的細胞表面標記物抗_CD19(B細胞)、抗-CD3 (T細胞)、抗-NKp46 (NK細胞)和抗-F4/80 (巨噬細胞)在BD LSR II系統(BDBioscience)上通過FACS鑑定淋巴細胞群體。針對特定細胞譜系門控淋巴細胞，利用大鼠抗-小鼠 Fe Y RIII/II 抗體(克隆 2. 4G2, BD Biosciences)分析內源Fe Y RIII 和 Fe Y RIIB的表達。克隆2. 4G2識別鼠Fe Y RIII和Fe Y RII的細胞外結構域上的共同多態性表位。結果顯示在mFc Y R KO小鼠的B-細胞、NK細胞和巨噬細胞上不存在可檢測的鼠低親和力FcyRIII 或 Fe Y RII (圖 2)。ADCC測定。從Fe Y R基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分離脾細胞，在細胞殺傷測定中分析它們進行ADCC的能力。使用MACS 技術(Miltenyi Biotec)分離和分開細胞群體。簡而言之，使用磁性標記的抗-小鼠CD3珠粒從脾細胞耗盡T細胞。隨後使用磁性標記的抗-小鼠CD49B珠粒就NK細胞富集T細胞耗盡的脾細胞。單獨地，用不同濃度(範圍從O. I 至 10 μ g/mL)的小鼠抗 _ 人 CD20 抗體(克隆 BI; BeckmanCoulter)在 4。C 包被 Raji細胞(表達人⑶20) 30分鐘。以100:1和50:1的比率(NK = Raji)將抗體包被的Raji細胞與富集的NK細胞在37° C溫育4小時。使用CytoTox-Glo 細胞毒性測定法(Promega)測量細胞死亡。發光信號來源於裂解的細胞並且與死亡細胞的數目成正比。就每一個比率的本底死亡細胞計數測定來自對照(無抗-CD20抗體)的發光，從野生型和KO小鼠的測量扣除該發光。計算平均細胞死亡，通過與野生型相比較測定細胞殺傷的百分比減少(%ADCC)。結果不於表I中。表I
[012權利要求
1.包含遺傳修飾的小鼠，其中所述遺傳修飾包括以置於內源小鼠低親和力FeY R基因基因座上的至少兩個低親和力人Fe Y R基因替代內源低親和力Fe Y R基因，並且其中所述小鼠包含功能性FcR Y鏈。
2.權利要求I所述的小鼠，其中至少兩個低親和力人FeYR基因選自FcyRIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIBo
3.權利要求I所述的小鼠，其中至少兩個低親和力人FeY R基因為Fe Y RIIA和Fe Y RIIIAo
4.權利要求3所述的小鼠，其中人FeY RIIIA在小鼠的NK細胞上表達。
5.權利要求I所述的小鼠，其中所述至少兩個低親和力人FeY R基因為FcyRIIB、Fe Y RIIC 和 Fe Y RIIIBo
6.權利要求3所述的小鼠，其中所述FeY RIIA和Fe Y RIIIA基因包含等位基因變體或多態性。
7.權利要求5所述的小鼠，其中所述小鼠包含人低親和力FeY R等位基因變體，並且所述等位基因變體選自(a)Fe Y RIIA等位基因變體131H，(b)Fe Y RIIIA等位基因變體158V，(c)Fc Y RIIB等位基因變體2321，(d)特徵在於嗜中性粒細胞抗原2 (NA2)等位基因的Fe Y RIIIB等位基因變體，及(e)它們的組合。
8.遺傳修飾的小鼠，其中所述遺傳修飾包括以編碼人FeY RIIIA α -亞基的基因替代編碼FcyRIIB、FcyRIII和Fe Y RIV α -亞基的內源小鼠基因，其中所述小鼠表達與內源小鼠FcR Y -亞基結合的人Fe Y RIIIA蛋白，其中人Fe Y RIIIA蛋白在小鼠NK細胞的表面上表達。
9.權利要求8的遺傳修飾的小鼠，其中小鼠NK細胞是小鼠血液中的循環NK細胞，並且在小鼠NK細胞表面上表達的Fe Y RIIIA蛋白結合包含人Fe或修飾的人Fe的免疫粘附素或抗體，其中免疫粘附素或抗體特異性結合小鼠中的靶細胞，並且免疫粘附素或抗體對NK細胞的Fe YRIIIA的結合介導靶細胞的NK細胞殺傷。
10.權利要求9的遺傳修飾的小鼠，其中用人病原體感染靶細胞，並且免疫粘附素或抗體特異性結合人病原體的表位。
11.權利要求9的遺傳修飾的小鼠，其中所述靶細胞是腫瘤細胞，並且免疫粘附素或抗體特異性結合腫瘤細胞的表位。
12.用於測量治療依賴性細胞殺傷的方法，包括 (a)給遺傳修飾的小鼠施用特異性結合小鼠中的不是NK細胞的靶細胞的治療劑，其中所述治療劑包含人Fe ； (b)測量小鼠或小鼠的組織樣品中的NK介導的靶細胞殺傷的水平；和 (c)測定由所述治療劑介導的靶細胞殺傷的量，從而測量治療依賴性細胞殺傷； 其中所述遺傳修飾包括編碼小鼠Fe Y RIIB的α -亞基的基因的缺失、編碼小鼠Fe Y RIII的α -亞基的基因的缺失和編碼小鼠Fe Y RIV的α -亞基的基因的缺失，並且其中所述小鼠在內源小鼠α-亞基基因座上包含編碼人Fe Y RIIIA的α-亞基的基因，並且其中所述小鼠表達功能性FcRy鏈亞基。
13.權利要求12的方法，其中所述小鼠還在內源小鼠α-亞基基因座上包含編碼選自Fe Y RIIA α -亞基、Fe Y RIIB α -亞基、Fe Y RIIC α -亞基、Fe Y RIIIB α -亞基及其組合的人Fe YRa-亞基的基因。
14.權利要求12的方法，其中所述靶細胞為人病原體，並且所述治療劑特異性結合人病原體的表位。
15.權利要求12的方法，其中靶細胞為被人病原體感染的小鼠細胞，並且所述治療劑特異性結合所述人病原體的表位。
16.權利要求12的方法，其中所述靶細胞為被人病原體感染的人細胞，並且所述治療劑特異性結合所述人病原體的表位。
17.權利要求12的方法，其中靶細胞為人腫瘤細胞，並且所述治療劑特異性結合所述人腫瘤細胞的表位。
18.權利要求12的方法，其中所述組織樣品為血液樣品。
19.權利要求12的方法，其中所述治療劑為抗體。
20.權利要求17的方法，其中所述抗體為人抗體。
全文摘要
提供了遺傳修飾的非人動物和用於產生和使用它們的方法和組合物，其中所述遺傳修飾包括內源低親和力FcγR基因座的缺失，並且其中小鼠能夠表達功能性FcRγ鏈。描述了遺傳修飾的小鼠，包括從內源FcγR基因座表達低親和力人FcγR基因的小鼠，並且其中所述小鼠包含功能性FcRγ鏈。提供了在宿主免疫系統的輔助細胞上表達至多5個低親和力人FcγR基因的遺傳修飾的小鼠。
文檔編號C07K14/705GK102762590SQ201080064262
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月21日
發明者A·J·墨菲, C·古爾, L·麥克唐納, S·史蒂文斯, 塗納新 申請人:瑞澤恩製藥公司