微生物檢測質量控制標準物質及其製備方法
2023-09-18 12:26:55
專利名稱：微生物檢測質量控制標準物質及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用在微生物檢測實驗室作質量控制對照，指示微生物檢測實驗室中檢測質量的，定量的微生物標準物質及其製備方法。
背景技術：
產品(食品、飲用水、化妝品、醫療用品、生活用品、衛生用品等)和環境中存在大量的微生物(非致病微生物、致病微生物、條件致病微生物、弱毒性致病微生物和強毒性致病微生物等)，由於產品中存在大量的微生物極大多數是繁殖體(正在大量繁殖的微生物)，產品質量監督監測部門和企業內部的實驗室，進行檢測檢測，檢測的數據只能表示檢測當時的衛生標準。同一產品，不同時間檢測，檢測的微生物數據均為不一致，有時差異會很大。因此，微生物檢測有一個不成文的規定微生物檢測不復檢。由於沒有一個統一的微生物檢測質量控制標準物質，使各系統、各單位的微生物檢測實驗室對產品等微生物檢測時，沒有標準物質作同步檢測對照，使檢測結果成為不確定性。
為了能證明檢測質量的準確，只有在微生物檢測時，同步進行「微生物檢測質量控制標樣」檢測，當檢測的數據符合標定的「微生物檢測質量控制標準物質」數據時，才能證明本次微生物檢測過程中的各方面的影響因素(技術人員的技能、生物試劑的質量、實驗檢測環境條件等)得到控制，檢測的數據是準確的。同時，每周採用「微生物檢測質量控制標準物質」進行檢測，繪製質量控制曲線圖進行分析、總結，分析微生物檢測實驗室質量保證體系運行情況，提出整改措施。才能保證該微生物檢測實驗室的質量體系正常運行。
發明內容
為提供一種微生物檢測質量的標準物質，本發明提供以下技術方案。
微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，包括以下步驟
a.選擇性狀穩定、形成集落能識別的、容易保存的、對人和動、植物無毒害的微生物，利用芽孢形成培養基或真菌孢子形成培養基製備細菌芽胞或真菌孢子，b.用滅菌蒸餾水洗下細菌芽孢或真菌孢子，染色，用滅菌蒸餾水稀釋至應用濃度，即內含指示微生物含量為102～109CFU/0.01G(或片、支、粒)，c.將定量的己稀釋至應用濃度的細菌芽孢或真菌孢子加入到已經環氧乙烷滅菌處理，並已達到無菌要求的定量載體中，均質，達到定量數值的細菌芽胞或真菌孢子均勻結合在載體上，d.將滅菌後的吸附有定量數值細菌芽胞或真菌孢子的定量載體置於已經滅菌的尖底2ml具塞塑料管中。
步驟a中優選的微生物為嗜熱脂肪桿菌芽胞、枯草桿菌黑色變種芽胞、短小桿菌芽胞、蠟樣芽胞或白色念珠菌、酵母。
優選步驟a中芽孢形成培養基的配方如下蛋白腖1.0％、牛肉浸膏粉0.3％、氯化鈉0.5％、葡萄糖0.1％、碳酸氫鈉0.08％、瓊脂粉1.2％。
優選步驟a中真菌孢子形成培養基的配方如下蛋白腖0.5％、葡萄糖4.0％、玉米澱粉4.0％、吐溫80 0.1％、瓊脂粉1.0％、碳酸氫鈉0.01％。
優選的方案中步驟c中載體可以是不溶性澱粉或可溶性澱粉、磁珠、直徑為1～6mm的塑料圓珠、瓊脂顆粒、明膠片、50％明膠溶液、直徑為6mm的厚濾紙片、葡萄糖、蔗糖、乳糖。
用上述任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質，其特徵在於載體上均勻地分布有細菌芽胞或真菌孢子，載體內含指示微生物含量為102～109CFU/0.01G(或片、支、粒)。
用上述任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質，可用於樣品或產品等菌落計數項目檢測過程中同步陽性對照。培養基的質量檢定。滅菌器滅菌工藝制訂及滅菌效果考核、繪製微生物檢測實驗室內質量控制曲線圖及微生物檢測實驗室室內、室間盲樣(技術人員技能)考核。
1、樣品(或產品)等菌落計數項目檢測過程中同步陽性對照。
在每批(每天)進行樣品(產品)等菌落計數檢測時，採用「微生物檢測質量控制標準物質」進行同步檢測，作為陽性對照，判定本次實驗結果是否準確和實驗過程中存在引起誤差的原因。
2、繪製微生物檢測實驗室內質量控制曲線圖。
為了保證微生物實驗室的檢測質量，每周用「微生物檢測質量控制標準物質」進行檢測，將檢測結果標入質量控制圖內，對本微生物檢測實驗室內存在的影響檢測質量的因素進行系統分析，並提出整改意見。
3、用於培養基(營養瓊脂)質量檢定。
樣品(產品)等菌落計數檢測時，培養基(營養瓊脂)的質量是保證微生物實驗檢測質量的關鍵因素之一，為了保證微生物實驗室的檢測質量，必須對本實驗室使用的培養基(營養瓊脂)進行質量檢定，選擇適用於本微生物檢測實驗室使用的培養基，並對培養基(營養瓊脂)存在的不足之處提出建設性意見。
4、用於微生物檢測實驗室室內、室間盲樣考核。
為了保證各微生物實驗室的檢測質量和檢測數據具有可比性，經常性地用「微生物檢測質量控制標準物質」開展微生物檢測實驗室室內、室間盲樣考核，保證微生物實驗室的檢測質量。
5、用於滅菌器進行產品滅菌時的工藝制訂、確認和滅菌效果考核。
由於產品的規格、包裝和性質均不相同，產品滅菌滅菌時的各種技術數據均不一樣，為了保證產品的滅菌質量，對各類產品滅菌滅菌時，必須制訂滅菌工藝和工藝確認。「微生物檢測質量控制標準物質」適用於滅菌工藝、工藝確認滅菌效果考核，保證產品的滅菌質量。
具體實施例方式
實施例1微生物在細菌芽胞形成培養基或真菌孢子形成培養基上經過2～4小時適應(枯草桿菌黑色變種芽胞、短小桿菌芽胞和蠟樣芽胞桿菌等的培養溫度為35℃～37℃，嗜熱脂肪桿菌芽胞的培養溫度為54℃～56℃，白色念珠菌培養溫度為25℃)，微生物進入對數生長期，微生物數量大量增加，微生物生長旺盛，將培養基中的營養耗盡，培養基可利用成分大量減少，產生的有害物質大量增加。微生物在營養成分不足、有害物質存在的這種惡劣環境中經過10天以上的培養，90％以上的微生物形成芽胞和孢子，進入休眠狀態。
用滅菌蒸餾水將培養基上的菌苔洗下，充分混勻，形成2.0×109cfu/ml細菌懸液，置於盛有玻璃珠的滅菌三角洗瓶中將三角燒瓶置於80℃的水浴中，水浴的液面高於三角燒瓶中菌懸液的液面，搖動三角燒瓶，作用10分鐘，殺滅未形成芽胞的繁殖體和未形成孢子的真菌，保留具有活性、能復甦的芽胞和孢子，並將形成鏈狀的芽胞菌體和真菌孢子分離成單個菌體。
無菌操作，將菌懸液置於滅菌的沉澱管中，置於離心機中，4000轉/分鐘，離心30分鐘，傾棄上清液，加入沉澱物10倍量的滅菌蒸餾水，置於混和器中，充分混勻。再進行4000轉/分鐘離心30分鐘，傾棄上清液。重複操作3次。
用50倍量的滅菌蒸餾水，將沉澱管中的芽胞菌體和真菌孢子洗下，置於滅菌的玻璃容器內，充分混勻。殺滅非細菌芽胞和非真菌孢子的微生物。
取菌懸液一滴，置於潔淨的載玻片上，塗布均勻，自然乾燥，在酒精燈上過火焰固定；在菌膜上滴加足量的5.0％孔雀綠水溶液；取平皿一隻，內放置二張濾紙，在濾紙上滴加蒸餾水，使濾紙吸足蒸餾水，無多餘的蒸餾水外溢，將載玻片置於平皿中，蓋好平皿蓋，將平皿置於54℃~56℃培養箱，烘30分鐘。將載玻片取出，用自來水水洗，將孔雀綠殘留洗淨。加入0.6％沙黃水溶液，復染2分鐘，用自來水水洗，將沙黃殘留洗淨，待幹。完成芽胞染色。將載玻片置於顯微鏡載物臺上，用油鏡觀察，芽胞呈綠色，菌體成紅色，計算芽胞形成率。芽胞形成率達95％以上即可。用滅菌蒸餾水稀釋至應用濃度。即內含指示微生物含量為102～109CFU/0.01G(或片、支、粒)，(1)、定量菌懸液的製備①、取已處理的細菌芽胞和真菌孢子懸液，②、用滅菌蒸餾水作10-1～10-9稀釋。
③、取各稀釋度的菌懸液1ml，分別置於滅菌平皿中，傾注入已熔化、並已冷卻至50～60℃的營養瓊脂或真菌培養基。凝固後，置於36±1℃(細菌芽胞)或26±1℃(真菌孢子)的培養箱內，培養24小時。
④、計數。
⑤、用滅菌蒸餾水稀釋至應用濃度的定量菌懸液。
其中菌量計數的方法
①、取一支菌落計數質量控制標樣，(管上標明的重量為內容物重量)。在微生物檢測實驗室(P1級生物安全防護實驗室)內。打開塑料管(或安瓿瓶)。
②、取一支移液管，吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，充分混勻。
③、另取一支移液管，將塑料管中的液體吸出，加入滅菌試管中。
④、繼續吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，充分混勻，然後將混和樣液吸出，置於上述中試管中。按此方法再重複5次，將塑料管中的樣品充分洗淨，置於中試管內。
⑤、繼續在中試管內加入5.0ml滅菌蒸餾水，總量為10.0ml，為1號中試管。
⑥、另取二支中試管，分別加入9.0ml滅菌蒸餾水。
⑦、用1.0ml移液管將1號中試管內的樣液吹打均勻，靜止20min。吸取1.0ml樣液置於2號中試管內，將移液棄掉。
⑧、另取1支1.0ml移液管吹打2號中試管內的液體，充分混勻，吸取1.0ml溶液置於滅菌平皿中(共四隻平皿)。
⑨、在平皿中加入已融化並冷卻至45℃～50℃的營養瓊脂20ml/皿。凝固後置於36±1℃培養箱內，培養24h，計數。
計算 注N1-N410-2稀釋度的四隻平皿中的菌落數。
(2)、吸附①、載體吸附前處理A、不溶性澱粉、糖(葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、奶粉a、將不溶性澱粉、(糖類、奶粉)置於自封式塑膠袋中，排除氣體，封口，再用一隻自封式塑膠袋封口包裝，平攤成為厚1cm的包裝，每袋250g。
b、在其中一袋不溶性澱粉、(糖類、奶粉)包裝袋中，同時放入一支「微生物檢測標樣」。
c、採用環氧乙烷滅菌。
d、滅菌後在通風的環境中放置15天。
e、在生物安全防護實驗室內，從包裝袋中取出一支「微生物檢測標樣」。進行滅菌效果檢測。
B、磁珠、塑料珠、a、用蒸餾水將磁珠清洗。涼燥。
b、將磁珠置於自封式塑膠袋中，排除氣體，封口，再用一隻自封式塑膠袋封口包裝，平攤成為厚1cm的包裝，每袋100g。
c、在其中一袋磁珠包裝袋中，同時放入一支「微生物檢測標樣」。
d、採用環氧乙烷滅菌。
e、滅菌後在通風的環境中放置15天。
f、在生物安全防護實驗室內，從包裝袋中取出一支「微生物檢測標樣」。進行滅菌效果檢測。
C、瓊脂顆粒a、用200目的銅絲網過篩。
b、將瓊脂粉置於自封式塑膠袋中，排除氣體，封口，再用一隻自封式塑膠袋封口包裝，平攤成為厚1cm的包裝，每袋250g。
c、在其中一袋瓊脂粉包裝袋中，同時放入一支「微生物檢測標樣」。
d、採用環氧乙烷滅菌。
e、滅菌後在通風的環境中放置15天。
f、在生物安全防護實驗室內，從包裝袋中取出一支「微生物檢測標樣」。進行滅菌效果檢測。
D、濾紙片a、將直徑為6mm的厚紙片置於自封式塑膠袋中，排除氣體，封口，再用一隻自封式塑膠袋封口包裝，每袋5000片。
b、在其中一袋濾紙片包裝袋中，同時放入一支「微生物檢測標樣」。
c、採用環氧乙烷滅菌。
d、滅菌後在通風的環境中放置15天。
e、在生物安全防護實驗室內，從包裝袋中取出一支「微生物檢測標樣」。進行滅菌效果檢測。
②、吸附a、磁珠、塑料珠、濾紙片將已滅菌的載體置於已滅菌的燒瓶內。
根據載體的吸水量，加入已定量的菌懸液。充分混勻。
烘乾。
定量分裝於已滅菌的尖底2ml具塞塑料管內。
b、不溶性澱粉、糖(葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、奶粉、瓊脂顆粒將已滅菌的載體置於已滅菌的燒瓶內。
根據載體的吸水量，加入已定量的菌懸液。充分混勻。
將已加入微生物菌懸液的載體置於已滅菌的球磨機內，滾動混勻。
定量分裝於已滅菌的尖底2ml具塞塑料管內。
c、明膠片取15g明膠，置於100ml蒸餾水內，121℃滅菌20min。
待冷卻至45～50℃時，加入1倍量的菌懸液，置於混勻器內，充分混勻。
用滅菌的200ul移液器，分裝於已滅菌的尖底2ml具塞塑料管內。
實施例2用於菌落計數項目檢測過程中同步陽性對照a，取一支「微生物檢測質量控制標準物質」。
b，在微生物檢測實驗室(生物安全防護實驗室)內。打開塑料管。
c，取一支移液管，吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，充分混勻。
d，另取一支移液管，將塑料管中的液體吸出，加入滅菌中試管中(1號管)。
e，繼續吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，衝洗塑料管，然後將樣液吸出，置於上述中試管中。按此方法再重複2次，將塑料管中的樣品充分洗淨，置於中試管內。
f，繼續在中試管內加入滅菌蒸餾水，總量為5.0ml。
g，另取滅菌中試管，加入4.0ml滅菌蒸餾水(2號管)，另取一支移液管，從1號中試管中吸取1.0ml混和樣液，加入2號中試管中，充分混勻。
h，用1.0ml移液管，將2號中試管內的樣液吹打(或用混和器)均勻，靜止20min。
i，吸取1.0ml上清樣液，置於滅菌平皿中(共二隻平皿)，加入已融化並冷卻至45℃～50℃的營養瓊脂20ml/皿。充分混勻，凝固後置於36±1℃培養箱內，培養24h，計數。
計算 注N1和N2二隻平皿中的菌落數。
淨重量在塑料管上標明。
實施例3 培養基(營養瓊脂)質量檢定a、取一支「微生物檢測質量控制標準物質」。
b、在微生物檢測實驗室(生物安全防護實驗室)內。打開塑料管。
c、取一支移液管，吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，充分混勻。
d、另取一支移液管，將塑料管中的液體吸出，加入滅菌中試管中。
e、繼續吸取1.0ml滅菌蒸餾水，加入塑料管中，衝洗塑料管，然後將樣液吸出，置於上述中試管中。按此方法再重複2次，將塑料管中的樣品充分洗淨，置於中試管內。
f、繼續在中試管內加入滅菌蒸餾水，總量為5.0ml，用lml移液管(或用混和器)充分混勻。
g、用100ul移液器吸取混勻樣液，置於被檢定培養基(四隻)和對照1號培養基(四隻)上。每隻培養基100ul。
h、用滅菌L棒將培養基表面的混勻樣液塗布均勻，並塗布至乾燥。
i、將八隻培養基置於37℃培養箱內，培養24h。
j、計算菌落數和用數顯式遊標卡尺測量菌落直徑。
計算①、菌落平均數計算
②、菌落平均直徑計算 ③、生長率計算 ④、總分值計算總分值＝菌落直徑分值+菌落差分值+生長率分值 菌落差分值＝(X-Y+1)×5 注X為被檢定培養基菌落直徑平均數Y為對照1號培養基菌落直徑平均數ρ為生長率被檢定培養基質量判定總分值≥20.00為合格。≤19.99為不合格；其中≤12.08為促生長能力偏弱；≤3.16為促生長能力不良。
菌落直徑分值≥10.00為合格，≤9.99為不合格；其中≤5.00為促生長能力偏弱；≤0.00為促生長能力不良。
菌落差分值≥5.00為合格，≤4.99為不合格；其中≤4.08為促生長能力偏弱；≤3.16為促生長能力不良。
生長率分值≥5.00為合格，≤4.99為不合格；其中≤3.00為促生長能力偏弱；≤0.00為促生長能力不良。
權利要求
1.微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，包括以下步驟a.選擇性狀穩定、形成集落能識別的、容易保存的、對人和動、植物無毒害的微生物，利用芽孢形成培養基或真菌孢子形成培養基製備細菌芽胞或真菌孢子，b.用滅菌蒸餾水洗下細菌芽孢或真菌孢子，染色，用滅菌蒸餾水稀釋至應用濃度，即內含指示微生物含量為102～109CFU/0.01G(或片、支、粒)，c.將定量的已稀釋至應用濃度的細菌芽孢或真菌孢子加入到已經環氧乙烷滅菌處理，並已達到無菌要求的定量載體中，均質，達到定量數值的細菌芽胞或真菌孢子均勻結合在載體上，d.將滅菌後的吸附有定量數值細菌芽胞或真菌孢子的定量載體置於已經滅菌的尖底2ml具塞塑料管中。
2.如權利要求1所述的微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，其特徵在於選擇的微生物為嗜熱脂肪桿菌芽胞、枯草桿菌黑色變種芽胞、短小桿菌芽胞、蠟樣芽胞或白色念珠菌、酵母。
3.如權利要求1所述的微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，其特徵在於步驟a中芽孢形成培養基的配方如下蛋白腖1.0％、牛肉浸膏粉0.3％、氯化鈉0.5％、葡萄糖0.1％、碳酸氫鈉0.08％、瓊脂粉1.2％。
4.如權利要求1所述的微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，其特徵在於步驟a中真菌孢子形成培養基的配方如下蛋白腖0.5％、葡萄糖4.0％、玉米澱粉4.0％、吐溫80 0.1％、瓊脂粉1.0％、碳酸氫鈉0.01％。
5.如權利要求1所述的微生物檢測質量控制標準物質的製備方法，其特徵在於步驟c中載體可以是不溶性澱粉或可溶性澱粉、磁珠、直徑為1～6mm的塑料圓珠、瓊脂顆粒、明膠片、50％明膠溶液、直徑為6mm的厚濾紙片、葡萄糖、蔗糖、乳糖。
6.以權利要求1至5的任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質，其特徵在於載體上均勻地分布有細菌芽胞或真菌孢子，載體內含指示微生物含量為102～109CFU/0.01G(或片、支、粒)。
7.以權利要求1至5的任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質用於樣品或產品等菌落計數項目檢測過程中同步陽性對照。
8.以權利要求1至5的任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質用於培養基的質量檢定。
9.以權利要求1至5的任一種方法製備的微生物檢測質量控制標準物質用於滅菌器滅菌工藝制訂及滅菌效果考核、繪製微生物檢測實驗室內質量控制曲線圖及微生物檢測實驗室室內、室間盲樣(技術人員技能)考核。
全文摘要
本發明涉及一種用在微生物檢測實驗室作質量控制對照，指示微生物檢測實驗室中檢測質量的，定量的微生物標準物質及其製備方法。其主要方法是將定量的已稀釋至應用濃度的細菌芽孢或真菌孢子加入到已經環氧乙烷滅菌處理，並已達到無菌要求的定量載體中，均質，達到定量數值的細菌芽胞或真菌孢子均勻結合在載體上，將滅菌後的吸附有定量數值細菌芽胞或真菌孢子的定量載體置於已經滅菌的尖底2ml具塞塑料管中。製成微生物檢測質量控制標準物質。
文檔編號C12R1/01GK101086008SQ20071006905
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月4日 優先權日2007年6月4日
發明者楊寧敏 申請人:杭州致遠醫學檢驗所有限公司