一株耐高溫檸檬酸生產菌株的製作方法
2023-06-07 22:14:31
專利名稱：一株耐高溫檸檬酸生產菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，涉及一株耐高溫檸檬酸生產菌株。本發明還涉及獲得該菌株的誘變篩選方法及應用方法。
背景技術：
檸檬酸行業是一個高耗能的產業，檸檬酸發酵過程是產熱的過程，在這個過程中需要大量的循環冷卻水以維持發酵溫度。在國內，檸檬酸菌種一般選用黑麴黴 {Aspergillus / >#)，該菌種的發酵溫度目前是37. 5 °C左右。據工廠實際測算，如果其發酵溫度能夠提高1°C，則冬季減少循環冷卻水量15. 2噸/噸檸檬酸(均為300 m3發酵罐)， 夏季減少為31. 2噸/噸檸檬酸。循環冷卻水用量的減少降低了水耗和運轉能耗，同時也節約了設備投資。如果能提高檸檬酸菌種黑麴黴的耐熱性，將發酵溫度提高3 5°C，可節約大量的生產成本。菌株的選育是發酵工業的關鍵技術，而國內的現有技術中對檸檬酸生產菌株的選育仍集中在提高菌株的產酸上，而少有提高菌株耐熱性的目標菌株的選育方法。若能通過誘變育種的方法提高菌株的耐熱性，可從菌株的本性上降低檸檬酸生成的耗能，在檸檬酸工業中將具有較好的應用前景。
發明內容
本發明的技術目的是提供一株新的耐高溫的檸檬酸生產菌株，從而從提高菌株耐熱性的方面實現菌株的誘變篩選及其低成本的發酵產檸檬酸的應用。為了實現本發明的技術目的，本發明的技術方案如下。一、一株耐高溫檸檬酸生產菌株，其分類命名為Asper識7ΛΛ5 niger zjs_8，其保藏編號為CCTCC NO: M 2011359。二、本發明所述的耐高溫檸檬酸生產菌株A^ergiBM niger zjs-8的誘變篩選方法，包括以下步驟
1)將As/^rpVAAsniger原始菌株的孢子懸浮液進行離子束注入誘變，得到突變孢子
液；
2)將上述步驟1)獲得的突變孢子液塗布於含有溴甲酚綠的固體平板在40 44°C下培養，挑取固體平板上的單菌落進行斜面培養，即得耐受高溫的黑麴黴突變株；
3)將步驟2)所得的突變株以玉米粉帶渣培養基搖瓶發酵，培養溫度40 42°C，即得耐高溫檸檬酸高產菌株；
4)將步驟3)所得的耐高溫檸檬酸高產菌株進行斜面傳代培養，對傳代後的菌株進行搖瓶發酵，考察其遺傳性狀穩定性，培養溫度40 42°C，獲得產酸、耐熱性狀穩定的突變株；
5)以步驟4)所得的穩定突變株為出發菌株，多次重複進行步驟1)到步驟4)的誘變選育工作，最後得到耐高溫且性狀最穩定的檸檬酸高產菌株As/^r^/Bm niger zjs_8。進一步地，所述步驟1)中的離子束注入誘變的方法是用15 keV氮離子進行離子術注入操作，注入劑量為50 300X 1014個N+/Cm2，靶室真空度為10_3 Pa。三、本發明所述的耐高溫檸檬酸生產菌株Asper識7ΛΛ5 鞏ir zjs-8在發酵生產檸檬酸中的應用。本發 明的有益效果在於
本發明以購買自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)的黑麴黴Asper識7ΛΛ5 niger CICC No: 40567為出發菌株，採用本發明所述的誘變方法篩選得到耐高溫檸檬酸生產菌突 H Aspergillus niger ζ js_8，該突變株可耐受40 42°C高溫，在原始菌株基礎上將發酵溫度提高了 3 5°C，產酸水平雖略有降低，但發酵周期不變。利用菌株Asper識7ΛΛ5 niger zjs-8進行檸檬酸的發酵生產，生產1噸檸檬酸可降低冷卻循環水用量約69. 6 116噸，按工廠設備的功率來看，運轉這些循環水需21 35度電，而按0. 5元/度電來算，生產1噸檸檬酸可節約10. 5 17. 5元。若是一個年產上萬噸的檸檬酸工廠，則可節約電耗200，000 350，00度，成本降低約105，000 175，000 元。由於該菌株在降低生產成本上的具有較大優勢，其工業化應用前景將非常廣闊。
本發明的生物材料Asper識7ΛΛ5 niger zjs-8的保藏日期為2011年10月20日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，其保藏編號為CCTCC NO: M 2011359。
具體實施例方式一般性說明
玉米粉的預處理將玉米粉與適量的水混合，加熱到70°C，加入耐高溫α -澱粉酶 (Liquozyme Supra,購自諾維信)，加酶量為800 U/g幹澱粉質原料，升溫至90°C後保溫至液化完全(碘試不變色)，得玉米粉液化液，將液化液趁熱用濾布過濾後得液化清液，測定液化液和液化清液的總糖、還原糖後，按所需糖液濃度加水進行調整。其中，所述的總糖和還原糖的測定方法為菲林試劑法。溴甲酚綠固體培養基組成20%(W/ V)馬鈴薯的煮汁，2%蔗糖，0.02%溴甲酚綠， 2. 2%瓊脂。搖瓶發酵培養基(即上述玉米粉帶渣培養基)組成總糖濃度為14 16%，按15 85的體積比將玉米粉液化液與液化清液進行混合。種子罐培養基總糖濃度為9 11%左右；其製備方法為稱取300 400 g玉米粉加水定容至2 L後，按上述玉米粉預處理方法進行液化後得玉米粉液化液，將此液化液直接定容至2. 5 L，121°C、30 min滅菌，接種量35萬個孢子/mL。發酵罐培養基(5 L罐):總糖濃度為14 16%，裝液量為3 L。首先將預處理玉米粉得到的液化液和液化清液用水調整其總糖濃度分別為9 10%、15 18% ；然後分別按裝液量的10%和80%將液化液和液化清液混合，並加入0. 4 0. 7 g的尿素；110°C、10 min條件下滅菌後在無菌條件下按10%的接種量接種種子罐成熟液(種子液pH ( 2. 5)。檸檬酸發酵液酸度的測定方法酸鹼滴定法，採用0. 1429 mol/L NaOH溶液對發酵液進行滴定。檸檬酸發酵液中有機酸的測定是採用HPLC方法採用日本shimadzu島津高效液相色譜儀LC-20A測定。其具體方法為色譜柱，C18柱；流動相，0. 1 %Η3Ρ04 乙腈=96. 5 3. 5;溫度，常溫；流速，0.6 mL/min;檢測器，紫外檢測波長210 nm ；進樣量，15 μ L ；保留時間，30 min。實施例1
本實施例說明As^rgiB^s niger zjs-8的誘變和篩選方法。出發菌株購買自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)的黑麴黴Asper識7ΛΛ5 niger CICC NO: 40567 為出發菌株。一、離子束誘變。
取培養5 6 d的產檸檬酸黑麴黴出發菌株的成熟孢子斜面一支，用無菌水洗脫孢子並經紗布過濾後置於預先滅菌的放有玻璃珠的三角瓶中，於搖床上震蕩30 60 min至鏡檢為分散的單孢子。用血球計數法數並用無菌水調節孢子濃度為IXlO7個/mL，即為單孢子懸浮液。取0.1 mL孢子懸浮液，均勻塗布於無菌培養皿表面，並在無菌條件下室溫風乾。然後將塗有孢子懸浮液的培養皿放入離子注入機內，靶室抽真空至10_3 Pa，選用15 KeV 氮離子，50 300 X IO1Vcm2劑量對這些孢子進行處理。然後取出培養皿，以1 mL無菌水洗脫，經10倍稀釋至10_3、ΙΟ"4後塗布平板進行篩選。二、耐高溫的突變株的篩選。平板初篩取100 μ L上述稀釋過的經離子注入誘變後所得孢子懸浮液均勻塗布於溴甲酚綠PDA平板上，倒置於40 44°C恆溫培養箱中培養2 3 d。由於黑麴黴生長過程中產生的檸檬酸可改變菌落周圍培養基的PH，使溴甲酚綠變色，出現黃色的變色圈，通過比較測量變色圈直徑與菌落直徑之比的大小來選取突變株，將比值較大的菌株轉接於PDA 斜面培養，以備搖瓶初篩。三、耐高溫檸檬酸高產突變菌株的篩選。搖瓶初篩經過平板初篩，得到35株在高溫條件下產酸可能較高的突變株，將突變株斜面按實例1的方法製成孢子懸浮液，以35萬個/mL的接種量接種於搖瓶培養基，置於轉速為220 rpm的恆溫搖床上，40 42°C培養90 96 h，測定其檸檬酸的產量，其結果如表1所示，其中7株在高溫條件下產酸較出發菌株高出10%以上，分別為突變株ζ je、z jg、 zjh、zjk、zjq、zjr 禾口 zjs。
權利要求
1.一株耐高溫檸檬酸生產菌株，其分類命名為A^argiBM niger zjs_8，其保藏編號為CCTCC NO :M 2011359。
2.權利要求1所述的耐高溫檸檬酸生產菌株As/^r^/BMniger zjs-8的誘變篩選方法，其特徵在於包括以下步驟1)將As/^rpVAAsniger原始菌株的孢子懸浮液進行離子束注入誘變，得到突變孢子液；2)將上述步驟1)獲得的突變孢子液塗布於含有溴甲酚綠的固體平板在4(T44°C下培養，挑取固體平板上的單菌落進行斜面培養，即得耐受高溫的黑麴黴突變株；3)將步驟2)所得的突變株以玉米粉帶渣培養基搖瓶發酵，培養溫度4(T42°C，即得耐高溫檸檬酸高產菌株；4)將步驟3)所得的耐高溫檸檬酸高產菌株進行斜面傳代培養，對傳代後的菌株進行搖瓶發酵，考察其遺傳性狀穩定性，培養溫度4(T42°C，獲得產酸、耐熱性狀穩定的突變株。
3.5)以步驟4)所得的穩定突變株為出發菌株，多次重複進行步驟1)到步驟4)的誘變選育工作，最後得到耐高溫且性狀最穩定的檸檬酸高產菌株A^argiBM niger zjs_8。
4.根據權利要求2所述的耐高溫檸檬酸生產菌株As/^r^/Bmzjs-8的誘變篩選方法，其特徵在於所述步驟1)中的離子束注入誘變的方法是用15 keV氮離子進行離子術注入操作，注入劑量為5(Γ300Χ1014個N+/cm2，靶室真空度為10_3 Pa。
5.權利要求1所述的耐高溫檸檬酸生產菌株As/^r^/Bm/^ger zjs-8在發酵生產檸檬酸中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物工程技術領域，涉及一株耐高溫檸檬酸生產菌株。本發明還涉及獲得該菌株的誘變篩選方法及應用方法。本發明的菌株分類命名為Aspergillusnigerzjs-8，保藏號為CCTCCNOM2011359。得到該菌株的方法是採用離子束注入誘變處理出發菌株，然後將處理後的菌液塗布於含溴甲酚綠的篩選平板上高溫培養，挑取變色圈與菌落直徑比值較大的單菌落進行高溫發酵產檸檬酸。採用此方法篩選得到的菌株可耐受42℃的高溫，且在高溫條件下遺傳性狀穩定，產酸水平較高，這對檸檬酸工業的節能生產提供了一條可行的道路。
文檔編號C12N15/01GK102352322SQ20111036040
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者左靜, 徐晴, 李霜, 滿雲, 黃和 申請人:南京工業大學