一種發酵製備除臭酶製劑的方法
2023-06-07 23:59:26
專利名稱：一種發酵製備除臭酶製劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵製備除臭酶製劑的方法，具體是涉及釆用系統的微生物技術通過 鏈黴菌(&"/7tom);c" w.)DS-021發酵製備除臭酶製劑的方法，屬於生物技術與生物工程領域。
背景技術：
以硫化物為主導的惡臭汙染成分，廣泛地存在於汙水處理廠、垃圾轉運站、化工廠、 養殖場、公共廁所及生活汙水等中。這類物質進入大氣對人類形成嚴重的嗅覺汙染，可使 人和動物損傷神經、削弱食慾、增強健忘、阻滯血液循環，而且還嚴重地威脅著生命；有 些還會隨廢水、廢物進入水體，使水質變成惡臭，直接影響了水生生物的生存，破壞了生 態循環。硫化物產生的惡臭在城市環境中形成了典型的社會公害。我國人口密度大，工業 發展速度迅速，對環境治理與保護的措施與快速的工農業化和城市化發展不相協調，環境 中的惡臭汙染問題愈加嚴重。
目前惡臭物質去除處理常用的方法可以分為三類物理法、化學法與生物法。這些方 法在不同程度上都存在著去除效率低、操作複雜、佔地面積大、能耗高、使用不方便等方 面的不足。
除臭酶是一類具有催化惡臭硫化物降解的生物活性大分子。發明人曾在濃香型麯酒發 酵池窖泥中分離出能產生除臭酶的兼性自養型鏈黴菌DS-021 (食品與發酵工業，2001， 27 (11)， 17-20)。該菌株屬於放線菌目鏈黴菌科鏈黴菌屬，具有利用硫及硫化物自養生活和 利用有機物進行異養的能力，培養產生的除臭酶液對麯酒發酵池窖泥中的致臭硫化物具有 明顯的去除效果。現有培養方法如2001年的文章所示，其沒有做成製劑，且工藝不完善， 用於大量生產也非常困難。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種工藝簡單，且能大量生產，可生物降 解的由微生物規模化發酵製備除臭酶製劑的方法。
本發明選用鏈黴菌(&r印to/^ces w.)DS-021為除臭酶製劑的生產菌種，採用發酵方法 生產用於去除環境惡臭物質的酶製劑。製備過程包括液體種子製備、發酵液製備、發酵液 預處理、產物提取與精製和成品加工。
本發明的技術方案為 一種發酵製備除臭酶製劑的方法，包括以下步驟
1) 液體種子製備
種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉10-30; (NH4)2HP04 3-10;K2HPO4 0.4-1.5; MgS04 0.3-1.2; CaCl2 0.2-1.2;玉米漿0.2-2.0。
製備方法將水和按上述濃度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱至各成 分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4,裝入種子罐，在蒸汽壓力1 Kg/cm2條件下滅菌 30min，降溫使培養基冷卻至25-33'C，得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液l瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為25-35'C,無菌空氣通風比1: 0.15-0.55(V/V), 攪拌轉速為150-350r/min，培養28-42h，得液體種子備用；
2) 發酵液製備
發酵培養基的水溶液組成(g/L):玉米粉15-40; (NH4)2HP04 5-15;K2HP04 0.3-1.2; MgS04 0.2-1.0; CaCl2 0.1-1.0;玉米漿0.5-1.5。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。
發酵液製備將重量比為5-15%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為 25-35°C,無菌空氣通風比1 : 0.25-0.85(V/V)，攪拌轉速為120-250r/min，培養32-45h，得
發酵液備用；
3) 發酵液預處理將發酵液升溫至65-85'C，保持10-25min後將溫度降至20-45°C，加入5-15ppm的聚
氨基葡萄糖進行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(1) 產物沉澱往發酵清液中先加入0.05y。-0.35。/。(W/V)的硅藻土攪拌5-15min,再加入 0.05。/。-0.35。/。(W/V)的丹寧攪拌5-15min，靜止20-60min後離心分離，得沉澱複合物；
(2) 產物分離將沉澱複合物分散於5-8倍重量的水中，加入產物液量0.05%-0.35% (W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌0.5-3h後離心分離，得酶清液備用。
5) 成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑 明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精, 獲得固態酶製劑。
本發明鏈黴菌DS-021孢子懸液採用現有技術的常規製備孢子懸浮液的方法製備，所 製備成的孢子懸液濃度為0.8><108個孢子/1111,所使用的茄子瓶規格為250ml。
該除臭酶製劑的使用方法為直接混入具有惡臭物質的汙水、汙物，或噴灑於產生臭 味的環境中。
本發明的技術效果是本發明發酵製備除臭酶製劑的方法，工藝簡單，且具有能大量 生產，收率高(收率296%)和純度高(純度2卯％)的優點。由發酵製備除臭酶製劑的方 法所獲得的除臭酶製劑應用於環境惡臭物質去除處理與現有的除臭方法相比具有無毒無 害(山東省疾病預防控制中心檢驗報告，魯疾控檢字2004D060。檢驗結論急性經口毒性 試驗證明樣品實屬無毒；Ames試驗結果為陰性說明樣品無遺傳毒性；小鼠骨髓細胞微核 試驗證明樣品無致微核作用)、可生物降解、效率高(每克固態酶製劑每小時可去除惡臭 硫化物10000微克)、使用方便(直接應用於臭味物質處理，不需複雜的設施)的優點。
具體實施例方式
實施例l
1)液體種子製備種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉25; (NH4)2HP04 8; K2HP04 1.3; MgS04 1.0; CaCl2 1.0;玉米槳1.8。
製備方法將水和按上述溶度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱至各成 分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4，裝入種子罐，在蒸汽壓力lKg/cii^條件下滅菌 30min，降溫使培養基冷卻至32'C,得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液l瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為33'C，無菌空氣通風比1:0.5(V/V)，攪拌轉速 為330r/min，培養40h,得液體種子備用；
2) 發酵液製備
發酵培養基的水溶液組成(g/L):玉米粉35; (NH4)2HP04 13;K2HP04 1.0; MgS04 1.0; CaCl2 1.0;玉米槳1.3。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。
發酵液製備將重量比為13%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為33°C, 無菌空氣通風比1:0.8(V/V)，攪拌轉速為230r/min，培養42h，得發酵液備用；
3) 發酵液預處理
將發酵液升溫至80'C，保持25min後將溫度降至42°C，加入13ppm的聚氨基葡萄糖 進行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(1) 產物沉澱往發酵清液中先加入0.33n/。(W/V)的硅藻土攪拌15min，再加入 0.33。/。(W/V)丹寧攪拌15min，靜止50min後離心分離，得沉澱複合物。
(2) 產物分離將沉澱複合物分散於7倍重量的水中，加入產物液量0.33W(W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌兩小時50分鐘後離心分離，得酶清液備用。
5) 成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精， 獲得固態酶製劑。產品收率為96.5%,純度為90.6%。 實施例2
1) 液體種子製備
種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉20; (NH4)2HP04 6; K2HP04 0.9; MgS04 0.8; CaCl2 0.8;玉米漿1.5。
製備方法將水和按上述溶度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱至各成
分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4,裝入種子罐，在蒸汽壓力1Kg/cr^條件下滅菌 30min，降溫使培養基冷卻至32'C,得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液1瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為32'C,無菌空氣通風比1:0.45(V/V),攪拌轉速 為300r/min，培養38h，得液體種子備用；
2) 發酵液製備
發酵培養基的水溶液組成(g/L):
玉米粉30; (NH4)2HP04 10; K2HP04 0.7: MgS04 0.7; CaCl2 0.7;玉米漿1.0。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。
發酵液製備將重量比為10%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為31'C, 無菌空氣通風比1:0.65(V/V)，攪拌轉速為200r/min,培養40h，得發酵液備用；
3) 發酵液預處理
將發酵液升溫至78°C ，保持23min後將溫度降至40°C,加入9ppm的聚氨基葡萄糖進 行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(l)產物沉澱往發酵清液中先加入0.30。/。(W/V)硅藻土攪拌13min,再加入0.28%(W/V) 丹寧攪拌13min，靜止45min後離心分離，得沉澱複合物。(2)產物分離將沉澱複合物分散於6倍重量的水中，加入產物液量0.28。/。(W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌2h後離心分離，得酶清液備用。 5)成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑 明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精， 獲得固態酶製劑。產品收率為96.8%,純度為卯.7%。
實施例3
1) 液體種子製備
種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉13; (NH4)2HP04 5; K2HP04 0.6; MgS04 0.5; CaCl2 0.4;玉米槳0.8。
製備方法將量取的水和按上述溶度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱 至各成分溶解，以NaOH溶液調pH值至7.0-7.4，裝入種子罐，在蒸汽壓力1Kg/ci^條件 下滅菌30min，降溫使培養基冷卻至32'C，得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液1瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為30°C，無菌空氣通風比1:0.25(V/V),攪拌轉速 為200r/min，培養38h，得液體種子備用；
2) 發酵液製備
發酵培養基的水溶液組成(g/L):玉米粉18; (NH4)2HP04 8;K2HP04 0.5; MgS04 0.3; CaCl2 0.3;玉米漿0.7。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。
發酵液製備將重量比為8%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為30t)，
無菌空氣通風比1:0.35(V/V),攪拌轉速為l卯r/min，培養36h,得發酵液備用；
3) 發酵液預處理
將發酵液升溫至73'C,保持20min後將溫度降至33'C,加入7ppm的聚氨基葡萄糖進行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(1) 產物沉澱往發酵清液中先加入0.25M(W/V)硅藻土攪拌12min，再加入0.25%(W/V) 丹寧攪拌12min，靜止30min後離心分離，得沉澱複合物。
(2) 產物分離將沉澱複合物分散於6倍重量的水中，加入產物液量0.25。/。(W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌50min後離心分離，得酶清液備用。
5) 成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑 明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精， 獲得固態酶製劑。產品收率為96.5%,純度為90.6%。
實施例4
1) 液體種子製備
種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉30: (NH4)2HP04 10; K2HP04 1.3: MgS04 U; CaCl2 1.2;玉米漿1.9。
製備方法將量取的水和按上述溶度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱 至各成分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4,裝入種子罐，在蒸汽壓力1Kg/cn^條件 下滅菌30min，降溫使培養基冷卻至32'C，得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液1瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為30'C,無菌空氣通風比1:0.55(V/V)，攪拌轉速 為340r/min，培養42h,得液體種子備用；
2) 發酵液製備
發酵培養基的水溶液組成(g/L):
玉米粉38; (NH4)2HP04 10; K2HP04 1.5; MgS04 0.8; CaCl2 0.8;玉米漿0.9。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。發酵液製備:將重量比為15%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為30'C， 無菌空氣通風比1:0.85(V/V)，攪拌轉速為250r/min，培養45h，得發酵液備用；
3) 發酵液預處理
將發酵液升溫至85'C，保持25min後將溫度降至3(TC，加入15ppm的聚氨基葡萄糖 進行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(1) 產物沉澱往發酵清液中先加入0.35。/。(W/V)硅藻土攪拌10min，再加入0.35%(W/V) 丹寧攪拌10min,靜止50min後離心分離，得沉澱複合物。
(2) 產物分離將沉澱複合物分散於8倍重量的水中，加入產物液量0.35n/。(W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌3h後離心分離，得酶清液備用。
5) 成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑 明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精， 獲得固態酶製劑。產品收率為96.5%,純度為卯.7%。
實施例5
1) 液體種子製備
種子培養基的水溶液組成為(g/L):澱粉10; (NH4)2HP04 4; K2HP04 0.3; MgS04 0.4; CaCl2 0.2;玉米漿0.5。
製備方法將水和按上述溶度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱至各成 分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4,裝入種子罐，在蒸汽壓力1Kg/ci^條件下滅菌 30min，降溫使培養基冷卻至32'C，得滅菌種子培養基備用；
液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸 液1瓶(50ml)進行攪拌培養，培養溫度為25°C，無菌空氣通風比1:0.17(V/V)，攪拌轉速 為180r/min，培養30h，得液體種子備用；
2) 發酵液製備發酵培養基的水溶液組成(g/L):
玉米粉 15; (NH4)2HP04 6; K2HP04 0.3; MgS04 0.4; CaCl2 0.2;玉米漿0.5。
發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐。
發酵液製備將重量比為5%的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為25'C， 無菌空氣通風比1:0.25(V/V)，攪拌150r/min，培養33h，得發酵液備用；
3) 發酵液預處理
將發酵液升溫至68'C,保持15min後將溫度降至30'C,加入6ppm的聚氨基葡萄糖進 行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用。
4) 產物提取與精製
(1) 產物沉澱往發酵清液中先加入0.08。/。(W/V)硅藻土攪拌5min,再加入0.10%(W/V) 丹寧攪拌5min,靜止20min後離心分離，得沉澱複合物。
(2) 產物分離將沉澱複合物分散於5倍重量的水中，加入產物液量0.10Q/。(W/V)的PVP (聚乙烯氮戊環酮)，攪拌25min後離心分離，得酶清液備用。
5) 成品製備
將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑 明膠，獲得液態酶製劑把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精， 獲得固態酶製劑。產品收率為96.0%，純度為90.5%。
權利要求
1、一種發酵製備除臭酶製劑的方法，包括以下步驟1)液體種子製備種子培養基的水溶液組成為澱粉10-30g/L；(NH4)2HPO4 3-10g/L；K2HPO4 0.4-1.5g/L；MgSO4 0.3-1.2g/L；CaCl2 0.2-1.2g/L；玉米漿0.2-2.0g/L；製備方法將水和按上述濃度稱取的以上各種原料加入配料容器中，攪拌加熱至各成分溶解，用NaOH溶液調pH值至7.0-7.4，裝入種子罐，在蒸汽壓力1Kg/cm2條件下滅菌30min，降溫使培養基冷卻至25-33℃，得滅菌種子培養基備用；液體種子製備每100L滅菌種子培養基接種50ml種齡5天的茄子瓶鏈黴菌DS-021孢子懸液進行攪拌培養，培養溫度為25-35℃，無菌空氣通風體積比1∶0.15-1∶0.55，攪拌轉速為150-350r/min，培養28-42h，得液體種子備用，所述的孢子懸液濃度為0.8×108-1.2×108個孢子/ml，所使用的茄子瓶規格為250ml；2)發酵液製備發酵培養基的水溶液組成玉米粉15-40g/L；(NH4)2HPO4 5-15g/L；K2HPO4 0.3-1.2g/L；MgSO4 0.2-1.0g/L；CaCl2 0.1-1.0g/L；玉米漿0.5-1.5g/L；發酵培養基的製備方法與種子培養基的製備步驟相同，將配製的發酵培養基裝入發酵罐；發酵液製備將重量比為5-15％的液體種子接入發酵罐進行攪拌培養，培養溫度為25-35℃，無菌空氣通風體積比1∶0.25-1∶0.85，攪拌轉速為120-250r/min，培養32-45h，得發酵液備用；3)發酵液預處理將發酵液升溫至65-85℃，保持10-25min後將溫度降至20-45℃，加入5-15ppm的聚氨基葡萄糖進行生物絮凝，去除菌體及其它雜質，得發酵清液備用；4)產物提取與精製(1)產物沉澱往發酵清液中先加入重量體積比為0.05％-0.35％的硅藻土攪拌5-15min，再加入重量體積比為0.05％-0.35％的丹寧攪拌5-15min，靜止20-60min後離心分離，得沉澱複合物；(2)產物分離將沉澱複合物分散於5-8倍重量的水中，加入產物液量重量體積比為0.05％-0.35％的PVP，攪拌0.5-3h後離心分離，得酶清液備用；5)成品製備將酶清液用截留分子量為5000-50000的有機超濾膜進行濃縮，在濃縮液中加入穩定劑明膠，獲得液態酶製劑；把酶清液用噴霧乾燥器乾燥獲得粉末，在粉末中加入保護劑糊精，獲得固態酶製劑。
全文摘要
本發明公開了一種發酵製備除臭酶製劑的方法，屬於生物技術與生物工程領域。本發明選用鏈黴菌(Streptomyces sp.)DS-021為除臭酶製劑的生產菌種，採用發酵方法生產用於去除環境惡臭物質的酶製劑。製備過程包括液體種子製備、發酵液製備、發酵液預處理、產物提取與精製、成品加工，製備的高效除臭酶製劑可廣泛地應用於安全去除環境中的惡臭物質。本發明發酵製備除臭酶製劑的方法，工藝簡單，且具有能大量生產，收率高(收率≥96％)和純度高(純度≥90％)的優點。
文檔編號B01D53/84GK101565693SQ20091001586
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者欒興社 申請人:欒興社