一種產角質酶基因工程菌及其應用的製作方法
2023-07-04 15:42:16
專利名稱：一種產角質酶基因工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
一種產角質酶基因工程菌及其應用，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
角質酶是一種多功能酶，屬於絲氨酸酯酶的一種，既可水解長鏈、短鏈脂肪酸酯、 乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯，還能參與酯化、轉酯化等，由於角質酶的特殊結構，還 可以水解角質。因此其在紡織工業、食品工業以及生物催化、化工工業等諸多領域有著廣泛 的應用前景。角質酶的發酵工藝研究主要集中在野生菌的培養條件優化以及對重組真菌 角質酶採用不同的基因工程宿主細胞(如釀酒酵母、大腸桿菌和麴黴屬)進行高效表達，優 化生產工藝，降低生產成本等方面。但由於酵母培養成本高、生長周期長的缺點，以及/^ solani pisi角質酶重組菌穩定性差的問題，至今未有角質酶工業化生產的報導。本實驗室陳晟等(ChenS, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (28)25854-25862)報導的 力i/ii/a角質 酶熱穩定性好，PH穩定範圍寬，最適作用溫度60°C，最適作用pH 8. 0，符合紡織用角質酶應 用要求。在此基礎上通過發酵優化，3L罐發酵30h，酶活達500U/mL (吳敬，吳丹，張瑤，陳 堅，陳晟，一種重組角質酶的發酵工藝，中國專利，申請號200910259651. 1)。但是存在兩點 不足在複合培養基的基礎上進行補料，成份複雜，不便於發酵調控；採用II型分泌途徑， 兩步跨越大腸桿菌內外膜，轉運效率較低，發酵過程中通過加入一定量的甘氨酸改變細胞 壁通透性來增加胞外分泌水平，這就增加了發酵生產成本。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種產角質酶基因工程菌。所述基因工程菌是通過構建重組質粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，並轉化大 腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)，得到重組大腸桿菌 Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21(DE3)。所述產角質酶基因工程菌的構建方法如下
1)以本實驗室前期構建的Tfu_0883/pET20b (+)質粒為模板擴增角質酶Tfu_0883基
因；
2)以五coliCFT073總DNA為模版擴增hlyAs的基因(中國專利申請 200910260984. 6)；
3)以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，PCR擴增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；
4)pET20b(+)和Tfu_0883-hlyAs進行雙酶切，割膠產物回收轉化五co7iJM109感受態 細胞，得到質粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；5)重組質粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)轉化大腸桿菌五coli BL21 (DE3)，得到大腸 桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。所述Tfu_0883/ pET20b (+)來源(Chen S, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008，283 (28) 25854-25862)
所述質粒 pET20b(+)、菌株五 coli BL21(DE3)購自 Novagen 公司，五 coli CFT073 (ATCC 700928)，購於 ATCC。本發明還要解決的技術問題是提供一種上述產角質酶基因工程菌發酵生產角質 酶的方法。為解決上述問題，具體生產方法如下
1)發酵過程溫度維持在36_38°c，通過增減攪拌轉速或通入富氧空氣使溶解氧維持 20-40 %，通過補加氨水控制生長階段pH 7. 0-7. 2、誘導產酶階段pH 6. 4-6. 6 ；
2)發酵5-6h或溶解氧濃度升至〉70%時，以初始3. 5-5. O mL ·廠1 · IT1的流速補 加500g/L的甘油，以後通過指數補料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 22 之間；
3)發酵12-13h或OD600達到25-35時，加入終濃度0. 02-0. 04 mM/L IPTG進行誘 導，同時以8-10 mL .L-1 .h—1的速度補加50g/L的乳糖，停止補加氨水，待pH降至6. 4-6. 6 後通過補加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)發酵15-17h或誘導3-4 h，甘油流速恆定，約為25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)發酵19-21h或OD6tltlF再增加時，將乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h內逐步下降至步驟4)流速的一半。所述種子培養條件為將_80°C包藏的菌種接入種子培養基，初始pH7. 0-7. 2，迴轉 恆溫搖床37°C、200 rpm培養7-8 h ；種子培養基組成為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青黴素濃度為100mg/L。所述發酵過程接種量4%_8%。所述發酵培養基組成為蛋白腖lg/L、酵母粉2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L,KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青黴素濃 度為100mg/L ；發酵過程接種量4%-8%。所述微量元素液組成為=HCl5M/L，FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。本發明構建的產角質酶基因工程菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/BL21 (DE3)搖瓶 培養60小時，角質酶產量達到274 U/mL;採用本發明提供的發酵方法，培養30-34 h，酶活 達到700-750 U/mL，本發明還具有發酵培養基價格低廉，菌種易於調控等優點，適合在角質 酶的工業化生產中應用。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用於說明目的而非用於限制本 發明範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。菌株和質粒質粒pET20b(+)，菌株五 coli BL21(DE3),^. coli CFT073、 Ε. co7iJM109o材料和方法所用限制性內切酶，T4 DNA連接酶，pMD18-T simple載體，PCR試劑， DNA Marker等均購於TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態細胞萬.co/iJM109，引物，質粒提 取試劑盒，PCR產物純化試劑盒均購於上海生工生物工程公司；電轉儀購自Bio-Rad公司。實施例1 :Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)構建 根據角質酶、hlyAs的基因設計引物兩對引物Pl、P2和P3、P4。Pl :5』 -GTAATCCATATGGCCAACCCCTACGAGCGC-3』 P2 :5』 - GACTTCCATAGGCTAAGAACGGGCAGGTGGAG - 3』 P3 :5』 - CTCCACCTGCCCGTTCTTAGCCTATGGAAGTC - 3』 P4 :5』 - CCGCTCGAGTTATGCTGATGCTGTCAAAG - 3』
以質粒Tfu_0883/ pET20b(+)DNA為模板，以PI、P2為引物，PCR擴增角質酶的基因 Tfu_0883。以五coli CFT073總DNA為模版，以P3、P4為引物，PCR擴增hlyAs的基因。PCR反應在50 μ L體系中進行，反應條件為94°C變性Imin後開始循環，然後94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C分別延伸Imin和20s，共30個循環後，再於72°C延伸IOmin0 分別擴增得到783 bp和180 bp的PCR片段，割膠回收。然後再以Tfu_0883和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，以PI、P4為引物，再 進行PCR反應。擴增得到96;3bp的PCR片段，割膠回收，回收片段與pMD18_T simple載體 連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物塗布含100 mg/L氨苄青黴素的LB固體平板， 經37°C培養過夜，挑選單克隆，接入含100 mg/L氨苄青黴素的LB液體培養基，37°C，200rpm 培養8-10 h後提取質粒。將此質粒進行序列測定，結果表明此基因全長963個核苷酸，和 Tfu_0883及hlyAs基因的序列均完全相同。將pET20b (+)質粒和Tfu_0883-hlyAs基因進行Nde I和Β ο I雙酶切，酶切產物 割膠回收後，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產物轉化五coliMim感受態細胞，轉化 產物塗布含100 mg/L氨苄青黴素的LB固體平板，經37°C培養過夜，挑選轉化子於含100 mg/L氨苄青黴素的LB液體培養基進行培養，然後抽提質粒，得到富集的Tfu_0883-hlyAs/ pET20b (+)質粒。將所述重組質粒Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+)轉化萬.coli BL21 (DE3) 宿主菌，在含氨苄青黴素(100 mg/L) LB平板上經37 °C培養8-10h，挑選轉化子 (Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/ Ε. coli BL21 (DE3))。實施例2 大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)搖瓶發酵 菌株大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。種子培養將-80°C包藏的菌種接入種子培養基，初始pH7. 0-7. 2，迴轉恆溫搖床 37200 rpm培養7-8 h。種子培養基組成為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青黴素濃度為100mg/L。發酵產酶發酵接種量5% ；發酵培養基組成為甘油5g/L，蛋白腖12g/L，酵母膏 24g/L, K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L ； 37°C培養 2 h 後加入終濃度 0. 4 mM IPTG 誘導， 降溫至25°C培養，60 h產酶達274 U/mL。
實施例3 大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)發酵工藝 菌株大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。種子培養將-80°C包藏的菌種接入種子培養基，初始pH7. 0-7. 2，迴轉恆溫搖床 37200 rpm培養7-8 h。種子培養基組成為蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青黴素濃度為100mg/L。發酵接種量4%_8%。發酵培養基組成為蛋白腖lg/L、酵母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/ L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青黴素濃度 為 100mg/L ；微量元素液組成為=HCl 5M/L，FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. O g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. O g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。1)發酵過程溫度維持在36_38°C，通過增減攪拌轉速或通入富氧空氣使溶解氧維 持20-40 %，通過補加氨水控制生長階段pH 7. 0-7. 2、誘導產酶階段pH 6. 4-6. 6 ；
2)發酵5-6h或溶解氧濃度升至〉70%時，以初始3. 5-5. O mL · L—1 · IT1的流速補加 500g/L的甘油，以後通過指數補料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 22 之 間；
3)發酵12-13h或OD6c 達到25-35時，加入終濃度0.02-0. 04 mM/L IPTG進行誘導， 同時以8-10 mL · L-1 · h-1的速度補加50g/L的乳糖，停止補加氨水，待pH降至6. 4-6. 6後 通過補加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)發酵15-17h或誘導3-4 h，甘油流速恆定，為25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)發酵19-21h或OD6tltlF再增加時，將乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h內逐步下降至步驟4)流速的一半。發酵30-34 h，酶活達到 700-750 U/mL。序列表 江南大學
一種產角質酶基因工程菌及其應用 4
PatentIn version 3.5
1
30
DNA
人工合成序列
根據基因序列設計用於擴增 1
gtaatccata tggccaaccc ctacgagcgc 2 32 DNA
30人工合成序列
根據基因序列設計用於擴增 2
gacttccata ggctaagaac gggcaggtgg ag32
3
32
DNA
人工合成序列
根據基因序列設計用於擴增 3
ctccacctgc ccgttcttag cctatggaag tc32
4
29
DNA
人工合成序列
根據基因序列設計用於擴增 4
ccgctcgagt tatgctgatg ctgtcaaag29
權利要求
1.一種產角質酶基因工程菌，是將角質酶Tfu_0883基因和hlyAs基因導入大腸桿菌。
2.一種產角質酶基因工程菌，其特徵在於，該基因工程菌是攜帶重組質粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)的大腸桿菌五 coli BL21 (DE3)。
3.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特徵在於，具體構建方法如下 以質粒Tfu_0883 /pET20b (+)為模板擴增角質酶Tfu_0883基因；以五coli CFT073總DNA為模版擴增hlyAs的基因；以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，PCR擴增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；pET20b (+)和Tfu_0883-hlyAs進行雙酶切，割膠產物回收轉化五coliJM109感受態細 胞，構建質粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；重組質粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)轉化大腸桿菌五coli BL21 (DE3)，得到大腸杆 菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)/E. coli BL21 (DE3)。
4.一種權利要求1所述基因工程菌生產角質酶的方法，包括如下步驟發酵過程溫度維持在36-38°C，通過增減攪拌轉速或通入富氧空氣使溶解氧維持20-40 %，通過補加氨水控制生長階段PH 7. 0-7. 2、誘導產酶階段pH 6. 4-6. 6 ；發酵5-6 h或溶解氧濃度升至〉70%時，以初始3. 5-5. 0 mL .L—1 .h—1的流速補加500g/ L的甘油，以後通過指數補料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 3 h—1之間；發酵12-13 h或OD600達到25-35時，加入終濃度0. 02-0. 04 mM/L IPTG進行誘導，同 時以8-10 mL · L-1 · h-1的速度補加50g/L的乳糖，停止補加氨水，待pH降至6. 4-6. 6後通 過補加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；發酵15-17 h或誘導3-4 h，甘油流速恆定，25-35 mL · L-1 · h-1 ； 發酵19-21 h或OD6tltlF再增加時，將乳糖流速降至2-4 mL·!^·!!—1，甘油流速6-8 h 內逐步下降至步驟4)流速的一半。
5.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述種子培養基組成為蛋白腖10g/L，酵 母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青黴素濃度為100mg/L。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養基組成為蛋白腖lg/L、酵 母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸 0. 85 g/L，甘 油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青黴素濃度為100mg/L。
7.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述其特徵在於微量元素液組成為HC1 5M/L, FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/L, (NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。
全文摘要
本發明公開了一種產角質酶基因工程菌及其應用，屬於生物工程技術領域。構建重組質粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，並轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，得到重組大腸桿菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)。採用補料分批發酵的方式控制一定的比生長速率，發酵培養30-34h，發酵上清酶活達到700-750U/mL。本發明以甘油為主要原料，採用半合成培養基，具有穩定性好，便於調控等優點，適於大規模生產。
文檔編號C12N1/21GK102080063SQ20101057892
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者吳丹, 吳敬, 王蕾, 陳堅 申請人:江南大學