製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法

2023-07-03 23:08:11

專利名稱：製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法
技術領域：
本發明涉及藥用蛋白物質的製備，尤其涉及對用於製備目的蛋白的基因重組工程菌進行發酵的方法，特別涉及製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法。
背景技術：
1985年Welte.K成功地從人膀胱癌細胞株5637的培養上清液中純化並精製出人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱hG-CSF)，然後Welte.K與美國的AMGEN公司的Souza.L.M又進一步確定這種hG-CSF的N段胺基酸排列順序，將來源於5637細胞株的hG-CSF基因克隆化，採用基因工程技術將該基因插入大腸桿菌成功地製得hG-CSF而開發出重組人粒細胞集落刺激因子(以下簡稱rhG-CSF)，商品名為Filgratin(惠爾血)。該藥1991年美國FDA批准上市。hG-CSF由CHO細胞(中華倉鼠卵巢細胞)產生的rhG-CSF來源於人口腔底細胞的基因Granocyte(格拉諾塞特)是一種含有174個胺基酸的糖蛋白，其胺基酸序列和糖鏈組分與人體G-CSF相同。
內毒素、TNF-α和IFN-γ可活化單核細胞和巨噬細胞產生G-CSF。此外，成纖維細胞、內皮細胞、星狀細胞和骨髓基質細胞等在LPS、IL-1或TNF-α刺激活化後也可分泌G-CSF。某些白血病細胞以及CHu-2人口腔癌細胞、5637人膀胱癌細胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細胞可組成性地表達G-CSF。
1986年G-CSF cDNA克隆成功，G-CSF基因全長2.5kb，包括5個外顯子和4個內含子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204胺基酸的前體蛋白，均有30個胺基酸的先導序列，成熟蛋白分子分別為177和174個胺基酸，前者除了在成熟分子N端35位處插入了3個胺基酸外，其餘的序列與174胺基酸分子相同。人G-CSF分子量為19.6kDa，PI6.1，O-糖基化，對酸鹼(pH2～10)、熱以及變性劑等相對較穩定。G-CSF有5個半胱氨酸，Cys 36與Cys42，Cys74與Cys64之間形成兩對二硫健，Cys17為不配對半胱氨酸，二硫鍵對於維持G-CSF生物學功能是必須的因素。
G-CSF主要作用於中性粒細胞系(lineage)造血細胞的增殖、分化和活化。在體外G-CSF刺激骨髓造血祖細胞中中性粒細胞集落的形成，延長成熟中性粒細胞的存活時間，活化中性粒細胞，促進其ADCC，超氧陰離子的產生和鹼性磷酸酶的合成。最近研究表明，單獨G-CSF或與SCF協同可促進多能造血幹細胞的增殖、幹細胞母細胞集落形成以及體內CFU-S的形成。G-CSF還具有對人粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及成肌纖維細胞的趨化作用。腫瘤患者注射G-CSF後可提高血循環中中性粒細胞的水平，這種作用可能與縮短某些骨髓細胞進入S期的時間以及增加生成粒細胞的祖細胞數量有關。
申請人深圳新鵬生物工程有限公司生產的rhG-CSF，商品名為瑞血新，採用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF製備而成，含有175個胺基酸，分子量為18.8kDa，等電點6.2±0.4，除第一個胺基酸外，其他174個胺基酸排列順序與天然人體的G-CSF序列完全相同，在中國獲得批准上市，可適用於癌症放、化療等原因引起的白細胞減少症，是腫瘤放、化療過程中重要的輔助用藥。
目前，國內外生產的各種rhG-CSF商品都已經應用到臨床，並取得了很好的效果。人們也在尋求簡化rhG-CSF製備工藝，增加製品的活性，降低成本的各種各樣的方法。這些方法可以分化為三類第一種方法是從能夠分泌rhG-CSF的重組基因工程菌菌株入手，以期獲得獲得產量高的、便於後期提取處理的菌種，如中國專利ZL98103011.4和中國專利申請01800753.8各公開了一種分泌rhG-CSF的大腸桿菌菌株；第二種方法是能夠從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，雖然大量文獻提到菌株的培養，但大多是輕描淡寫，沒有對該種方法予以深入研究和分析，換句話來說，就是在該領域一直以來沒有好的突破；第三種方法則是從rhG-CSF的提取、純化入手，如中國專利ZL96106418.8中公開了一種採用外壓式中空纖維超濾透析復性，以離子交換柱層析、疏水柱層析和分子篩柱層析順序組合純化以製備高純度藥用rhG-CSF蛋白方法。
現有技術在如何從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，以解決rhG-CSF的製備上始終存在表達率偏低、菌體產量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題方面，一直以來沒有好的解決方案。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於克服現有技術的不足，從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，來解決rhG-CSF的製備上存在的表達率偏低、菌體產量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題。
本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是，提出一種製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF，其發酵過程包括步驟種子液培養和分批補料發酵，所述種子液培養包括以下子步驟①.菌種的篩選從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養過夜，挑取單菌落接種於含100μg/ml氨苄青黴素的5mlLB試管中培養，至OD600值為0.4-0.6，再於42℃培養4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發酵用種子，分裝甘油保存，每批發酵取用一支；②.一級種子液培養將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養，至OD600值為0.6-1.0；③.二級種子液培養將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態正常，即為發酵用種子；所述分批補料發酵包括以下子步驟①.發酵前的準備將8L發酵培養基接入20L的發酵罐中，115℃滅菌30分鐘；②.基本發酵滅菌後，待培養基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束髮酵；上述分批補料發酵子步驟②和③中，通過補加4mol/LNaOH(氫氧化鈉)控制pH為7.0-7.1，通過調節發酵罐的空氣流速和轉速，控制溶氧值為50％；並且當OD600值為2時，開始補料，補料方式為每小時補加補料I和II各100ml。
所述發酵培養基的配方為蛋白腖20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸銨50g，葡萄糖100g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀100g，磷酸二氫鉀20g，加純化水定容至8L。
所述補料I的配方為葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L。
所述補料II的配方為酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B10.1g，加純化水定容至1L。
同現有技術相比較，採用本發明的製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，為解決rhG-CSF的製備上存在的表達率偏低、菌體產量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題提供了可能。
具體實施例方式
以下對本發明予以進一步詳盡說明。
本發明的一種製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF，其發酵過程包括種子液培養和分批補料發酵，所述種子液培養包括以下子步驟①.菌種的篩選從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養過夜，挑取單菌落接種於含100μg/ml氨苄青黴素的5ml LB試管中培養，至OD600值為0.4-0.6，再於42℃培養4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發酵用種子，分裝甘油保存，每批發酵取用一支；②.一級種子液培養將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養，至OD600值為0.6-1.0；③.二級種子液培養將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態正常，即為發酵用種子；所述分批補料發酵包括以下子步驟①.發酵前的準備採用NBS 20L發酵罐，將pH電極、溶氧電極校正和安裝好；將8L發酵培養基接入發酵罐，設定滅菌溫度115℃，30min，發酵罐自動在線滅菌；②.基本發酵滅菌後，待培養基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，這時的OD600約為11，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束髮酵；上述分批補料發酵子步驟②和③中，通過補加4mol/L NaOH控制pH為7.0-7.1，通過調節發酵罐的空氣流速和轉速，控制溶氧值為50％；並且當OD600值為2時，開始補料，補料方式為每小時補加補料I和II各100ml。
所述LB的配方為蛋白腖10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加純化水定容至1L。
所述2YT培養基的配方為蛋白腖16g，酵母粉10g，氯化鈉5g，加純化水定容至1L。
上述經4小時誘導發酵後，經離心收集，平均溼菌收率可達80-100g/L，經SDS-PAGE分析，rhG-CSF蛋白的表達量佔菌體總蛋白的含量不低於40％。
收集到的菌體可以在-20℃的冷藏設備中進行保藏、轉運，也可以立即進行包涵體的分離與洗滌、復性、超濾和層析等提取、純化工藝過程以製備高純度藥用rhG-CSF蛋白。
選用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF做菌株的好處是其rhG-CSF蛋白佔菌體總蛋白的40％以上。
採用本發明發酵方法，並經上述提取、純化工藝過程製成的瑞血新，rhG-CSF比活性不低於4.0×108IU/mg。
本發明的難點在於根據所選用工程菌的生長特性，而提供相應的發酵條件，具體包括溫度、pH值控制，溶氧量控制，比如本發明之所以溶氧量控制採用50％，而不是採用一般發酵工藝中的30％左右，就是經過反覆分析、實驗得出的優選數據。
本發明的難點還在於適合工程菌的生長特性的培養基配方的選擇，以及分時分批補料時補料本身配方的選擇。
本發明選用的發酵培養基配方為蛋白腖20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸銨50g，葡萄糖100g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀100g，磷酸二氫鉀20g，加純化水定容至8L。
本發明選用的補料I的配方為葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L。
本發明選用的補料II的配方為酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B10.1g，加純化水定容至1L。
採用本發明發酵方法，從對重組基因工程菌菌株進行高密度、快速培育入手，解決rhG-CSF的製備上存在的表達率偏低、菌體產量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題提供了可能。
權利要求
1.一種製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF，其發酵過程包括種子液培養和分批補料發酵，其特徵在於所述種子液培養包括以下子步驟①.菌種的篩選從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養過夜，挑取單菌落接種於含100μg/ml氨苄青黴素的5ml LB試管中培養，至OD600值為0.4-0.6，再於42℃培養4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發酵用種子，分裝甘油保存，每批發酵取用一支；②.一級種子液培養將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養，至OD600值為0.6-1.0；③.二級種子液培養將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態正常，即為發酵用種子；所述分批補料發酵包括以下子步驟①.發酵前的準備將8L發酵培養基接入20L的發酵罐中，115℃滅菌30分鐘；②.基本發酵滅菌後，待培養基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束髮酵；上述分批補料發酵子步驟②和③中，通過補加4mol/L氫氧化鈉控制pH為7.0-7.1，通過調節發酵罐的空氣流速和轉速，控制溶氧值為50％；並且當OD600值為2時，開始補料，補料方式為每小時補加補料I和II各100ml。
2.如權利要求2所述的製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，其特徵在於，所述發酵培養基的配方為蛋白腖20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸銨50g，葡萄糖100g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀100g，磷酸二氫鉀20g，加純化水定容至8L。
3.如權利要求1所述的製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，其特徵在於，所述補料I的配方為葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L。
4.如權利要求1所述的製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，其特徵在於，所述補料II的配方為酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B1 0.1g，加純化水定容至1L。
全文摘要
一種製備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發酵方法，所述工程菌為DH5α－PBV220－hGCSF，其發酵過程包括種子液培養，包括以下子步驟①.菌種的篩選；②.一級種子液培養；③.二級種子液培養；和分批補料發酵，包括以下子步驟①.發酵前的準備；②.基本發酵按接種量1 0％體積比接入二級種子液，30℃，培養8小時，開始誘導表達；③.誘導發酵誘導溫度為42℃，誘導4小時，結束髮酵；上述分批補料發酵子步驟②和③中，控制pH為7.0－7.1，溶氧值為50％；並且當OD
文檔編號C12N1/20GK1718740SQ20041002794
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月7日 優先權日2004年7月7日
發明者李政海, 李靜, 李繼東 申請人:深圳新鵬生物工程有限公司